中藥淫羊藿薄層色譜鑒別方法的建立

謝媛媛，彭靈，蘇加坤，羅娟敏，王義明，郭磊，蔡繼寶，羅國(guó)安

中藥淫羊藿薄層色譜鑒別方法的建立

謝媛媛1，彭靈1，蘇加坤2，羅娟敏2，王義明3，郭磊2，蔡繼寶2，羅國(guó)安1

目的：建立淫羊藿薄層鑒別方法。方法：以朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷混合溶液為對(duì)照品，對(duì)淫羊藿進(jìn)行薄層鑒別，并考察了不同點(diǎn)樣量、不同薄層板、不同溫度及不同濕度對(duì)淫羊藿薄層鑒別的影響。結(jié)果：以朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷混合溶液為對(duì)照品，以甲醇∶丁酮∶氯仿∶水（4∶6∶6∶1）為展開(kāi)系統(tǒng)，5 μL點(diǎn)樣量點(diǎn)樣于Merck硅膠鋁箔板時(shí)，所得的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，專屬性強(qiáng)。結(jié)論：該鑒別方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可作為淫羊藿的薄層鑒別方法。

淫羊藿；朝藿定A；朝藿定C；淫羊藿苷；薄層鑒別

淫羊藿Epimedii Folium藥材來(lái)源復(fù)雜，2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定：淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi. 或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉[1]。2001年出版的《中國(guó)植物志》記載的淫羊藿主要種類有7種：箭葉淫羊藿、淫羊藿、粗毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿、柔毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿及巫山淫羊藿[2]。淫羊藿是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，在陽(yáng)痿、遺精、筋骨酸軟、手足麻木拘攣、更年期高血壓、心腦血管疾病[3,4]、提高機(jī)體免疫力[5,6]、抗腫瘤[7]及抗衰老[8]等方面有著顯著的療效[9]。

淫羊藿中成分主要為含有異戊烯基取代的黃酮類化合物。包括淫羊藿苷、寶藿苷I、寶藿苷II、寶藿苷V、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、脫水淫羊藿素、去甲基脫水淫羊藿素、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷C、大花淫羊藿苷F、淫羊藿次苷、箭藿苷A、箭藿苷B等[10]。薄層色譜法操作簡(jiǎn)便、設(shè)備簡(jiǎn)單、成本相對(duì)低廉、分離快速，被廣泛應(yīng)用于中藥鑒別領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)對(duì)淫羊藿進(jìn)行薄層色譜鑒別，是為了有效地控制其質(zhì)量，為淫羊藿的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

電子精密天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KM-12A型超聲波清洗機(jī)（廣州市科潔盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，功率60W，頻率40KHz）；SP-20E型全自動(dòng)點(diǎn)樣儀（上?？普苌萍加邢薰荆oodSee-20E薄層色譜成像系統(tǒng)（上?？普苌萍加邢薰荆?、25 μL微量進(jìn)樣針（寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠）；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；硅膠G板（北京和信同通科技發(fā)展有限公司）；硅膠GF254鋁箔板、硅膠GF254玻璃板（德國(guó)Merck公司）。

朝藿定A（純度99.25%，批號(hào) 110623-72-8）、朝藿定C（純度 98.93%，批號(hào) 110642-44-9）和淫羊藿苷（純度 99.31%，批號(hào) 489-32-7）均購(gòu)于四川省維克奇生物制藥有限公司；淫羊藿對(duì)照藥材（批號(hào)：Z09S7B20761）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。淫羊藿藥材經(jīng)清華大學(xué)化學(xué)系分析中心謝媛媛鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi.、巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜條件的考察

2.1.1 藥材供試品及對(duì)照藥材溶液的制備 取淫羊藿粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。另取淫羊藿對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷各1mg混溶于1 mL甲醇，作為混合對(duì)照品溶液。

圖1 點(diǎn)樣量的考察

2.1.3 點(diǎn)樣量的考察 分別吸取2 μL、5 μL、8 μL、10 μL淫羊藿供試品溶液點(diǎn)樣于同一薄層板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，點(diǎn)樣量為5 μL時(shí)斑點(diǎn)較清晰、無(wú)暈染情況，故確定供試品的點(diǎn)樣量為5 μL。2.1.4條帶寬度的考察 吸取淫羊藿供試品溶液分別以5 μL點(diǎn)樣量點(diǎn)2 mm、4 mm、6 mm、8 mm、10 mm的條帶于同一薄層板上，以甲醇∶丁酮∶氯仿∶水（4∶6∶6∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，條帶寬度為10mm時(shí)，斑點(diǎn)較清晰、無(wú)暈染情況，故確定點(diǎn)樣的條帶寬度為10 mm。

圖2 條帶寬度的考察

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 穩(wěn)定性考察 取同一批淫羊藿藥材，按2.1.1供試品溶液制備方法，制備4份供試品溶液，分別于室溫下保存不同時(shí)間（0天、1天、2天、3天）。吸取對(duì)照品溶液和上述4份供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，在3天內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

圖3 穩(wěn)定性考察

2.2.2 耐用性考察

（1）不同薄層板的考察 吸取混合對(duì)照品溶液、淫羊藿對(duì)照藥材溶液、淫羊藿供試品溶液各5 μL，點(diǎn)樣于3種不同的薄層板（Merck硅膠鋁箔板、Merck硅膠玻璃板和北京硅膠G板）上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，Merck硅膠鋁箔板的分離效果優(yōu)于Merck硅膠玻璃板和北京硅膠G板。

圖4 淫羊藿在Merck硅膠鋁箔板 (A)、Merck硅膠玻璃板(B)、Merck硅膠玻璃板(C)上展開(kāi)的薄層色譜圖

（2）不同展開(kāi)溫度的考察 吸取混合對(duì)照品溶液、淫羊藿對(duì)照藥材溶液、淫羊藿供試品溶液各5 μL點(diǎn)于3塊Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，分別在4 ℃、室溫（25 ℃）、32 ℃的條件下展開(kāi)，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，展開(kāi)溫度對(duì)展開(kāi)效果影響不大，故選擇室溫（25 ℃）下展開(kāi)。

圖5 淫羊藿在4 ℃ (A)、25 ℃ (B)、32 ℃(C)下展開(kāi)的薄層色譜圖

（3）不同展開(kāi)濕度的考察[11]吸取混合對(duì)照品溶液、淫羊藿對(duì)照藥材溶液、淫羊藿供試品溶液各5 μL點(diǎn)于3塊Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，分別在相對(duì)濕度32%、58%、88%的條件下展開(kāi)，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，相對(duì)濕度對(duì)展開(kāi)效果及斑點(diǎn)的清晰度影響較小。

圖6 淫羊藿在32% (A)、58% (B)、88% (C)濕度下展開(kāi)的薄層色譜圖

2.3 淫羊藿藥材的薄層鑒別

2.3.1 箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim. 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及供試品藥材點(diǎn)于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 第1～6批箭葉淫羊藿TLC圖

圖8 第7～12批箭葉淫羊藿TLC圖

2.3.2 朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及供試品藥材點(diǎn)于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 第1～6批箭葉淫羊藿TLC圖

圖10 第7～9批朝鮮淫羊藿TLC圖

2.3.3 巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及供試品藥材點(diǎn)于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 第1～4批巫山淫羊藿TLC圖

2.3.4 淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim. 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及供試品藥材點(diǎn)于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 第1～3批淫羊藿TLC圖

2.3.5 柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi. 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液及供試品藥材點(diǎn)于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開(kāi)系統(tǒng)，展開(kāi)，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖13。

圖13 柔毛淫羊藿TLC圖

以上箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai、巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying、淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.和柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi.的薄層色譜結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所建立的淫羊藿薄層色譜鑒別方法分離度高，重現(xiàn)性好，可用于淫羊藿藥材的鑒定并為淫羊藿藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)前期參考相關(guān)文獻(xiàn)[11,12,13]，對(duì)淫羊藿供試品制備方法中提取溶劑（50% 甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇）、溶劑體積（5 mL、10 mL、15 mL）及超聲處理時(shí)間（30 min、40 min、50 min）進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以10 mL甲醇作為溶劑，超聲30 min時(shí)薄層展開(kāi)效果最佳。

3.2 實(shí)驗(yàn)中對(duì)淫羊藿的薄層鑒別方法中的點(diǎn)樣量（2 μL、5 μL、8 μL、10 μL）、條帶寬度（2mm、4mm、6mm、8mm、10mm）、不同薄層板（Merck硅膠鋁箔板、Merck硅膠玻璃板、北京硅膠G板）、不同展開(kāi)溫度（4 ℃、25 ℃、32 ℃）及不同展開(kāi)濕度（32%、58%、88%）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明點(diǎn)樣量為5 μL，點(diǎn)樣于Merck硅膠鋁箔板時(shí)效果最好，而溫度和濕度對(duì)淫羊藿薄層色譜的展開(kāi)影響較??；對(duì)各批不同種的淫羊藿進(jìn)行薄層鑒別，色譜斑點(diǎn)明顯、分離效果好。本實(shí)驗(yàn)建立的淫羊藿薄層色譜鑒別方法朝藿定A、朝藿定C及淫羊藿苷斑點(diǎn)清晰，重復(fù)性好，可作為淫羊藿藥材的一種鑒定方法，為淫羊藿藥材的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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Establishment of TLC identi fication method of Yinyanghuo/

XIE Yuan-yuan1, PENG Ling1, SU Jia-kun2, LUO Juan-min2,WANG Yi-ming3, GUO Lei2, CAI Ji-Bao2, LUO Guo-an1//(1. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China.2.Tobacco Jiangxi Industrial Co., Ltd., Nanchang 330096, Jiangxi. 3. Zhuhai Qingda Hongrui Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai 519085, Guangzhou)

Objective: To establish a TLC method for the identification of Yinyanghuo. Method: The TLC was used to identify epimedin A, epimedin C and icariin. The effect of volume of application, thin layer plates, temperature and humidity on the TLC identi fication of Yinyanghuo were investigated. Result: With epimedin A, epimedin C and icariin as the reference substances, 5 μL volume of application, TLC spots on the Merck silica gel aluminum foil plate were clear and TLC identi fi cation of Yinyanghuo was high specific with Methanol-butanone-chloroform-water (4：6：6：1) as the developing system. Conclusion: The method established for Yinyanghuo is feasible and reproducible, and can be used for Yinyanghuo identification.

Yinyanghuo; epimedin A; epimedin C; icariin; TLC identi fi cation

R 284.1

A

1674-926X(2017)04-006-05

中國(guó)煙草總公司重大專項(xiàng)項(xiàng)目[項(xiàng)目編號(hào)：110201401025(JH-03)]

1.清華大學(xué)化學(xué)系，北京，100084；2.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江西 南昌 330096；3.珠海清大弘瑞生物科技有限公司，廣東 珠海 519085

謝媛媛（1980-），女，博士，主要從事中藥質(zhì)量分析研究Tel： 010-62772264 Email：yuanyuan_sy@tsinghua.edu.cn

王義明（1945-），女，本科，主要從事生命分析化學(xué)研究Tel：010-62781688 Email：wangyim@tsinghua.edu.cn

2017-03-10

（責(zé)任編輯：蔣淼）