仙鶴草乙醇提取物通過抑制STAT3表達(dá)促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病大鼠Th17/Treg平衡恢復(fù)

李晶 陳劍超 段珊

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1急診科，湖南 衡陽 421001；2超聲科；3南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)表現(xiàn)為不可逆性氣流受限，一般與患者肺部對煙霧有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)相關(guān)〔1〕。肺部和氣道壁結(jié)構(gòu)破壞及慢性炎癥是COPD的病理基礎(chǔ)，患者肺功能出現(xiàn)障礙、衰退，嚴(yán)重威脅身體健康安全，目前COPD位居全球死亡病因的第4位〔2，3〕。因此，如何防治COPD是醫(yī)學(xué)界面臨的重大課題?，F(xiàn)代藥理研究表明，仙鶴草具有抗炎、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用〔4〕。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)3能夠維持和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路，下調(diào)p-STAT3水平可有效緩解COPD肺組織炎癥反應(yīng)和肺損傷〔5〕。Treg在COPD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，在機(jī)體正常生理?xiàng)l件下，Th17/Treg保持動態(tài)平衡，此時機(jī)體免疫功能靈活，一旦Th17/Treg平衡打破，Th17細(xì)胞增殖過度，可引發(fā)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)COPD發(fā)生〔6，7〕。仙鶴草乙醇提取物能否通過調(diào)控STAT3通路以恢復(fù)Th17/Treg平衡，從而緩解COPD大鼠病癥未見相關(guān)報(bào)道，因此本研究擬建立COPD大鼠模型作為研究對象，觀察不同濃度仙鶴乙醇提取物作用后COPD癥狀緩解情況及對STAT3通路、Th17/Treg平衡的影響。

1 資料與方法

1.1試劑和儀器 仙鶴草乙醇提取物的制備：精確稱取100 g仙鶴草粉于5 000 ml三頸瓶中，加入30%的乙醇1 500 ml，在100℃恒溫水浴鍋中分別冷凝回流提取100 min，趁熱過濾，提取2次，合并濾液，濃縮至1 g生藥/ml，等量蒸餾水洗滌，清洗至無乙醇，真空干燥，提取物用蒸餾水混懸待用〔8〕。氨茶堿片(國藥準(zhǔn)字H44021063，規(guī)格：0.1 g)購自國藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司；兔抗鼠STAT3(貨號：K25714-BJH)、兔抗鼠p-STAT3(貨號：K28006-MUN)、兔抗鼠ROR-γt(貨號：K24419-OBS)、兔抗鼠Foxp3(貨號：K15477-LJR)、羊抗兔二抗(貨號：BL0924-ILN)均購自北京百奧萊博科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-10(貨號：XY-SJH-3880)、IL-17(貨號：XY-SJH-3709)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購自上海烜雅生物科技有限公司；CUT6062型石蠟切片機(jī)購自北京天賜百年科技有限公司；Editormp601型胸部X射線檢查儀購自德國西門子公司；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動物 雄性清潔級SD大鼠，8周齡，體重200～250 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(豫)-2018-0001。實(shí)驗(yàn)動物均常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，COPD大鼠模型構(gòu)建采用Tian所建立的方法〔9〕，將大鼠持續(xù)暴露在煙霧環(huán)境中，前2 w在早、中、晚個各點(diǎn)燃3支煙，后10 w在早、中、晚個各點(diǎn)燃5支煙，此外，在前8 w，向大鼠鼻孔中滴加新配的100 μl肺炎克雷伯桿菌溶，1次/5 d。12 w后，所有大鼠行X射線檢測，肺組織增厚，形態(tài)不規(guī)則說明COPD模型構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)分組：①對照組；②COPD模型組；③低劑量組(仙鶴草乙醇提取物4 g/kg)；④中劑量組(仙鶴草乙醇提取物8 g/kg)；⑤高劑量組(仙鶴草乙醇提取物16 g/kg)〔10〕；⑥氨茶堿組(2.3 mg/kg)〔11〕。每組10只，灌胃給藥，1次/d，給藥體積1 ml，連續(xù)給藥60 d，對照組和COPD模型組灌胃等體積的生理鹽水。

1.3方法 ①一般情況：觀察各組大鼠精神狀況、毛發(fā)光澤程度，生理活動情況、氣喘、口鼻分泌物、腹瀉等一般情況。②各組肺功能測定：用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉各組大鼠，隨后將完全麻醉的大鼠固定在手術(shù)臺上，經(jīng)大鼠口氣管插入Y型氣管并固定，將氣管一端連接生物信號采集系統(tǒng)傳感器，隨后儀器自動掃描并繪制呼吸曲線，測定大鼠每分鐘吸氣峰流量(PIF)、呼氣峰流量(PEF)和通氣量(MV)等指標(biāo)。③各組肺組織病理學(xué)觀察：給藥結(jié)束后，脫頸處死大鼠，立刻進(jìn)行解剖，取大鼠左側(cè)肺組織，一部分置于-80℃冰箱中待用，一部分4%多聚甲醛固定。取部分各組固定后的肺組織，石蠟包埋，切片、梯度乙醇洗脫、脫水、蘇木素-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。④肺組織小氣道管壁厚度測量：將各組肺組織HE切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，各切片隨機(jī)選取3個視野，利用微尺測量小氣道管壁厚度，每個切片讀取10個數(shù)值，結(jié)果取平均值。⑤Western印跡測定各組大鼠肺組織中STAT3、p-STAT3、ROR-γt、Foxp3表達(dá)水平：從-80℃取出各組大鼠肺組織，置于含有500 μl十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解液的研缽中，充分研磨至無組織碎片，離心取上清液，用二喹啉甲酸(BCA)法測定上清液中蛋白含量。50 μg蛋白緩沖液在100℃條件下保溫5 min，隨后上樣電泳，低壓80 V，30 min，高壓120 V，120 min，濕法轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉結(jié)合位點(diǎn)1 h，加入兔抗鼠STAT3、兔抗鼠p-STAT3、兔抗鼠ROR-γt、兔抗鼠Foxp3、兔抗鼠內(nèi)參β-actin(稀釋比例均為1∶1 000)，常溫孵育過夜，加入羊抗兔二抗(稀釋比例均為1∶1 000)，常溫孵育2 h后，顯色、曝光、觀察。⑥ELISA檢測各組大鼠肺組織中IL-10、IL-17表達(dá)水平：從-80℃取出各組大鼠肺組織，置于含有200 μl生理鹽水的研磨中，研磨均勻，離心取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作測定各組大鼠肺組織中IL-10、IL-17表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠胸部X射線觀察 對照組肺部形態(tài)清晰可見，結(jié)構(gòu)完整，COPD模型組右肺下葉邊緣模糊，肺部有斑塊密集、多云陰影、增厚等病理特征，見圖1。

圖1 兩組胸部X射線觀察

2.2各組一般情況觀察 對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動，毛發(fā)光亮，呼吸、飲食、飲水正常。COPD模型組大鼠精神萎靡不振，毛發(fā)無光澤，身體蜷縮，大便質(zhì)稀，出現(xiàn)咳嗽、氣喘，部分有哮鳴音，鼻分泌物增多。低、中、高劑量組一般情況介于對照組和模型組之間，精神狀態(tài)轉(zhuǎn)好，活動頻率增加，毛發(fā)恢復(fù)光澤，咳嗽、氣喘癥狀減輕，鼻分泌物減少。氨茶堿組一般情況與高劑量仙鶴草乙醇提取物相仿。

2.3各組肺功能測定 與對照組相比，COPD模型組PIF、PEF、MV均顯著降低(P<0.05)；與COPD模型組相比，低、中、高劑量組和氨茶堿組PIF、PEF、MV均顯著升高(P<0.05)，隨著仙鶴草乙醇提取物給藥劑量升高，PIF、PEF、MV隨之升高(P<0.05)。氨茶堿組PIF、PEF、MV與高劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組肺功能測定

2.4各組肺組織病理學(xué)觀察 對照組大鼠肺部泡組織結(jié)構(gòu)完整，纖毛排列整齊且無脫落，未見管壁增厚，炎性細(xì)胞浸潤。COPD模型組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，泡壁纖薄、肺泡腫大，氣管黏膜部分脫落，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，管壁腔、終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端狹窄。仙鶴草乙醇提取物給藥后，隨劑量增加可見肺泡間隔逐漸消失，部分肺泡融合，少量炎性細(xì)胞浸潤，氣管黏膜皺襞輕度變長、增多，上皮細(xì)胞少量脫落。氨茶堿組病理組織緩解情況與高劑量組相仿，見圖2。

圖2 各組肺組織病理學(xué)觀察(HE，×400)

2.5肺組織小氣道管壁厚度測量 與對照組〔(15.09±1.64)μm〕相比，COPD模型組〔(128.35±2.47)μm〕小氣道管壁厚度顯著升高(P<0.05)；與COPD模型組相比，低、中、高劑量組小氣道管壁厚度顯著降低(P<0.05)，隨著仙鶴草乙醇提取物給藥劑量升高，小氣道管壁厚度隨之降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。氨茶堿組〔(18.04±0.71)μm〕小氣道管壁厚度與COPD模型組相比顯著降低(P<0.05)，與高劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6各組肺組織STAT3、p-STAT3、ROR-γt、Foxp3表達(dá)水平 與對照組相比，COPD模型組STAT3表達(dá)水平無明顯變化，STAT3磷酸化水平、ROR-γt表達(dá)水平顯著升高，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與COPD模型組相比，低、中、高劑量組和氨茶堿組STAT3表達(dá)水平無明顯變化，STAT3磷酸化水平、ROR-γt表達(dá)水平明顯降低，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，隨著仙鶴草乙醇提取物給藥劑量升高，STAT3磷酸化水平、ROR-γt表達(dá)水平隨之降低，F(xiàn)oxp3表達(dá)水平隨之升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。氨茶堿組與高劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2和圖3。

圖3 各組肺組織中STAT3、p-STAT3、ROR-γt、Foxp3表達(dá)

2.7各組肺組織IL-10、IL-17水平 與對照組相比，COPD模型組IL-10表達(dá)水平均顯著降低，IL-17水平顯著升高(P<0.05)；與COPD模型組相比，低、中、高劑量組和氨茶堿組IL-10水平均顯著升高，IL-17水平顯著降低(P<0.05)，隨著仙鶴草乙醇提取物給藥劑量升高，IL-10水平隨之升高，IL-17水平隨之降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。氨茶堿組與高劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

3 討 論

COPD臨床上一般表現(xiàn)為慢性咳嗽并伴有氣促、喘息等癥狀，病情嚴(yán)重者出現(xiàn)食欲不振、體重下降、肌肉功能障礙和萎縮等全身性病癥，甚至部分患者出現(xiàn)焦慮和抑郁現(xiàn)象〔12〕。目前臨床上治療COPD主要以減小氣道炎癥反應(yīng)提高患者免疫，以減輕患者肺部感染和損傷。本研究結(jié)果提示COPD大鼠模型構(gòu)建成功。仙鶴草在抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能方面的藥理作用受到廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度仙鶴草水煎液給藥后，能顯著提高環(huán)磷酰胺(CP)至免疫抑制小鼠白細(xì)胞數(shù)和脾臟指數(shù)，呈濃度依賴性，增強(qiáng)小鼠免疫功能〔13〕。臨床用藥發(fā)現(xiàn)，黃芪仙鶴湯治療潰瘍性結(jié)腸炎有效率高，服藥后患者腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6水平明顯降低，提示黃芪仙鶴湯有望在臨床上推廣使用〔14〕。本研究結(jié)果提示仙鶴草乙醇提取物有望成為治療COPD的備選藥物。

炎癥反應(yīng)伴隨COPD病情進(jìn)程，研究發(fā)現(xiàn)在COPD急性期小鼠鼠肺組織中，p-STAT3、p-JAK3表達(dá)水平顯著升高，麥角固醇通過抑制JAK3/STAT3信號通路活性，下調(diào)IL-6、TNF-α、IL-1β水平，緩解COPD病癥〔15〕。此外，許光蘭等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，清金化痰顆粒能夠下調(diào)p-STAT1、p-STAT3、IL-6水平，減輕COPD大鼠氣道炎癥。本研究結(jié)果提示仙鶴草能夠抑制STAT3通路活性，緩解炎癥反應(yīng)。

CD4細(xì)胞參與機(jī)體自身免疫調(diào)控，主要由Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞亞群組成，Th17/Treg平衡在抗炎和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用〔17〕。Treg細(xì)胞能夠分泌釋放IL-10，以降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其持續(xù)高表達(dá)是維持Treg細(xì)胞活性的前提〔18〕。

本研究結(jié)果提示仙鶴草乙醇提取物能夠上調(diào)Foxp3、IL-10表達(dá)水平，提高大鼠緩解炎癥反應(yīng)的能力。Th17細(xì)胞能夠分泌釋放IL-17，促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，ROR-γt特異性調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞因子誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)〔19〕。本研究結(jié)果說明COPD大鼠機(jī)體有炎癥反應(yīng)發(fā)生。仙鶴草乙醇提取物能夠下調(diào)IL-17、ROR-γt表達(dá)水平，緩解COPD大鼠炎癥反應(yīng)。

綜上，仙鶴草乙醇提取物可能通過抑制STAT3通路活性，上調(diào)Foxp3表達(dá)水平，下調(diào)ROR-γt表達(dá)水平，促進(jìn)慢阻肺大鼠Th17/Treg平衡恢復(fù)，緩解炎癥癥狀。但本研究樣本量少，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需擴(kuò)大樣本量深入研究調(diào)控機(jī)制。