白藜蘆醇誘導HepG2細胞凋亡中線粒體差異蛋白鑒定

歐單鳳, 陳春霞, 馬曉冬, 田雪梅*

(1. 華南師范大學生命科學學院, 廣州 510631； 2. 華南師范大學腦科學與康復醫(yī)學研究院， 廣州 510631)

白藜蘆醇誘導HepG2細胞凋亡中線粒體差異蛋白鑒定

歐單鳳1, 陳春霞1, 馬曉冬2, 田雪梅1*

(1. 華南師范大學生命科學學院, 廣州 510631； 2. 華南師范大學腦科學與康復醫(yī)學研究院， 廣州 510631)

文中分離提取白藜蘆醇處理的HepG2細胞線粒體蛋白質，以未處理HepG2細胞為對照，利用雙向電泳技術分離差異蛋白，飛行時間質譜分析鑒定差異蛋白點. 初步分析鑒定了4個顯著性差異蛋白，其中驅動蛋白和著絲粒相關蛋白CENP-E在白藜蘆醇處理的HepG2細胞中表達降低，證明白藜蘆醇對細胞周期有調節(jié)作用；線粒體加工肽酶表達降低，線粒體核糖體蛋白L7/L12表達升高，說明白藜蘆醇誘導HepG2細胞凋亡與其影響線粒體功能有關.

白藜蘆醇； HepG2細胞； 線粒體； 蛋白質組

Keywords： Resveratrol； HepG2 cell； Mitochondria; proteomics

二苯乙烯類物質是植物對抗真菌感染和紫外輻射等逆境生長條件所產生的次生代謝產物，白藜蘆醇(Resveratrol)即屬于此類物質. 白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等多種食用和藥用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗癌等功效，抑制細胞生長、誘導細胞凋亡是白藜蘆醇抗癌的重要機制之一[1-3].

線粒體與細胞的能量代謝和多種功能有關，線粒體功能異常將會啟動細胞的應激反應，繼而引起基因表達的改變[4]. 線粒體介導的信號轉導通路是細胞凋亡的一條重要通路[5]. 作者前期的研究發(fā)現白藜蘆醇能影響線粒體內膜通道的開放狀態(tài)[6]. 近期研究發(fā)現白藜蘆醇能促進結腸癌細胞SW620中線粒體電子傳遞鏈超載，導致反應性氧化物(Reactive Oxygen Species，ROS)生成增多，誘導細胞凋亡[7]. 白藜蘆醇誘導膀胱癌細胞凋亡也與線粒體功能失調有關[8]. 因此，白藜蘆醇的抗癌作用可能與影響腫瘤細胞的代謝有關，通過影響線粒體的功能誘導細胞凋亡可能是白藜蘆醇抗癌作用的一種機理.

本研究分離提取人肝癌細胞系HepG2細胞的線粒體蛋白質，采用雙向電泳分離線粒體總蛋白，飛行時間質譜進行肽指紋圖譜分析鑒定差異蛋白質，分析白藜蘆醇誘導HepG2細胞凋亡過程中的線粒體蛋白質的變化，以期發(fā)現和認識白藜蘆醇誘導人肝癌HepG2細胞凋亡過程中線粒體的潛在作用靶點.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

白藜蘆醇、二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)購自Sigma公司；線粒體提取試劑盒購自Pierce公司；IPG干膠條(3～10NL，17 cm)、IEF Buffer(pH3～10)等雙向電泳試劑購自Bio-Rad公司； DMEM培養(yǎng)基為Gibco產品；胎牛血清為杭州四季青公司產品；細胞裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純. 酶標儀(Bio-Rad iMark)，等電聚焦儀(Bio-Rad Protean IEF Cell)和垂直電泳儀(Bio-Rad，ProteanⅡ )，質譜儀(ABI 4700 TOF-TOF)， Dounce勻漿器購自上海仕博生物技術有限公司.

1.2 材料

人肝癌細胞系HepG2細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所. 以含10%牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃ . 因線粒體功能異常發(fā)生在細胞凋亡過程的較早期，根據前期實驗的結果[5]，100 μmol/L白藜蘆醇處理24 h是分離線粒體的最佳時間. 因此白藜蘆醇處理組為含100 μmol/L白藜蘆醇的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中DMSO的最終體積分數不超過0.2%；對照組為含體積分數0.2% DMSO的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h.

1.3 線粒體分離

按Pierce線粒體提取試劑盒操作，具體步驟如下：分別收集白藜蘆醇處理組和對照組細胞；冰預冷PBS(pH 7.4)洗2次， 10倍體積的線粒體分離緩沖液(20 mmol/L HEPES-KOH，pH7.5，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.25 mol/L 蔗糖，質量分數1% 蛋白酶抑制劑)懸浮細胞，冰上放置10 min；細胞懸液冰浴勻漿，相差顯微鏡下觀察破碎細胞達到75% 以上，于4 ℃、1 000 g離心10 min，取上清液于4℃、1 200 g離心10 min，收集上清，于4 ℃、12 500 g離心20 min，收集沉淀加懸浮緩沖液(10 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.4，0.25 mol/L 蔗糖，1.0 mmol/L MgCl2)離心洗滌2次，即為富含線粒體的粗提物.

1.4 線粒體形態(tài)觀察

取少量線粒體粗提物進行詹姆斯綠B(Jenu’s Green B)染色，光學顯微鏡下觀察；取適量線粒體粗提物按常規(guī)方法制備電鏡切片，透射電子顯微鏡觀察線粒體結構.

1.5 線粒體純化與蛋白質提取

在15 mL離心管中先加入5 mL 1.5 mol/L的蔗糖溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)，然后在液面上輕輕加一層5 mL 1.0 mol/L的蔗糖溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)，形成10 mL的蔗糖濃度梯度溶液. 將線粒體粗提物以1.5 mL懸浮緩沖液懸浮，輕輕加于蔗糖濃度梯度溶液液面上，4 ℃、60 000 g離心30 min，線粒體在1.0 mol/L和1.5 mol/L蔗糖梯度交界處形成薄層，吸出交界處線粒體薄層，用懸浮緩沖液懸浮，4 ℃、20 000 g離心20 min,沉淀線粒體. 線粒體沉淀于細胞裂解液中裂解，獲得線粒體蛋白質溶液，用蛋白測定試劑盒(2D Qant kit)測定總蛋白含量，80 ℃保存待用.

1.6 雙向電泳分離差異蛋白

雙向電泳方法主要參考文獻[9]和Bio-Rad儀器操作手冊進行.

制樣：分別取一定量的線粒體粗提物和純化的線粒體蛋白質樣品，加入已預先加有DTT和IPG緩沖液的Eppendorf管中,再加入相應容積的沖泡脹液，混合好的樣品離心除去氣泡，為雙向電泳樣品. 用微量移液器沿水化盤槽的邊緣從左向右線性加入樣品；去除IPG膠條上的保護層，將IPG膠條膠面朝下輕輕置于水化盤中樣品溶液上30～45 min，至大部分吸收樣品被膠條吸收，然后沿著膠條緩慢加入礦物油，于等電聚焦儀-20 ℃水化11～15 h.

等電聚焦：將紙電極置于聚焦盤的正負極上，加5 μL超純水潤濕；水化好的膠條瀝干礦物油，膠面朝下置于潤濕好的濾紙片上雜交，去除表面上的不溶物，面朝下置于聚焦盤中，確保膠條與電極緊密接觸，在每根膠條上覆蓋2～3 mL礦物油；設置等電聚焦程序，進行等電聚焦.

平衡膠條：將膠條轉移至樣品水化盤中，加入6 mL平衡緩沖液I，在水平搖床上緩慢搖晃15 min，取出膠條，在濾紙上瀝去多余的液體，放入平衡緩沖液II中，繼續(xù)在水平搖床上緩慢搖晃15 min，取出膠條，用濾紙吸去多余的平衡液.

SDS-PAGE電泳：分離膠的質量分數為12%，平衡后膠條在1倍電泳緩沖液中漂洗數次，膠面朝上，用塑料板將膠條輕輕地推入2塊玻璃板間,與分離膠膠面緊密接觸，以適量的瓊脂糖凝膠封口.

染色：硝酸銀和考馬斯亮藍染色.

分析：Umax PowerLook1100光密度儀獲取染色后的雙向電泳凝膠圖像，UV波長為355 nm，重復速率為200 Hz，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質量分辨率為1 500 Da. 掃描質量范圍為700～3 200 Da，凝膠圖像經Imagemaster 2D platinum 5.0分析軟件(Amersham Biosciences)分析，確定差異位點.

1.7 質譜鑒定差異蛋白

切取考馬斯亮藍染色凝膠上的差異蛋白質點，置于1.5 mL EP管. 1 mL純水清洗蛋白質點3次，每次10 min. 加入脫色液(250 mL乙醇，80 mL冰醋酸，加水至1 000 mL)50 μL浸泡膠片，脫色2 min. 水洗2次，至蛋白質點無色透明后，用體積分數50%的冰醋酸50 μL脫水15 min，50 μL 200 mmol/L 乙醇吸脹5 min，50 μL冰醋酸脫水15 min，真空冷凍干燥1 h，并進行蛋白還原與烷基化，膠內酶內切，提取多肽片段混合物點樣，用基質輔助激光解吸P電離飛行時間質譜(MALDI2TOF MS)進行肽質量指紋譜的分析，分析結果利用軟件Mascot distiller進行識別. 通過Matrixscience公司的Mascot軟件搜索NCBInr數據庫(http://www.matrixscience.com)，尋找匹配的相關蛋白質，并通過檢索不同的數據庫進行蛋白質鑒定與功能預測.

2 結果與分析

2.1 線粒體蛋白質的雙向電泳分析

分離后線粒體經透射電鏡觀察和Jenus Green B染色檢測，完整性較好，可用于進一步實驗，線粒體粗提物蛋白的雙向電泳結果顯示，大約有1 100±50個蛋白斑點被檢出(圖1A)；純化后的線粒體大約有450±50個蛋白斑點可被檢出(圖1B). 用白藜蘆醇處理細胞的過程中線粒體會受到不同程度的破壞，采用密度梯度純化的方法純化線粒體粗體物會導致處理后線粒體丟失，減少差異蛋白，影響蛋白質雙向電泳結果，因此，后續(xù)實驗采用線粒體粗提物進行雙向電泳.

圖1 線粒體總蛋白質的雙向電泳圖

2.2 蛋白質組的雙向電泳分析

銀染的靈敏度高，檢測的蛋白點多(圖2A、B)，但由于分析型雙向電泳上樣量少，并且硝酸銀染色后蛋白點在質譜鑒定過程中，出峰率低， 因此選用考馬斯亮蘭染色(圖2C、D). 結果顯示，處理組和對照組細胞的線粒體中大約有860±60個蛋白點可被檢測，初步鑒定出4個差異點(圖3)，蛋白的表達體積差異(Vol%)均在150%以上. A、C和D蛋白在白藜蘆醇處理組表達下調，而B蛋白在白藜蘆醇處理組表達上調.

圖2 HepG2細胞線粒體總蛋白質的雙向電泳圖

圖3 不同蛋白的差異表達

2.3 差異蛋白點的質譜鑒定

經過質譜鑒定(表1)，4個差異蛋白分別是：驅動蛋白(蛋白點A)、線粒體核糖體蛋白L7/L12(蛋白點B)、著絲粒相關蛋白CENP-E(蛋白點C)、線粒體加工肽酶(蛋白點D).

表1 差異蛋白鑒定結果和功能Table 1 Identification and function of the differentially expressed proteins

3 討論

線粒體是細胞能量代謝、生物合成和細胞死亡的調控中心，其功能異常會導致腫瘤、代謝性疾病、神經退行性病變等許多疾病的發(fā)生[10-12]. 線粒體蛋白表達異常是線粒體功能異常的重要原因，通過線粒體蛋白質組學可系統(tǒng)研究正常和病變組織中線粒體蛋白表達的差異，從而揭示研究線粒體相關疾病的分子機制以及藥物的作用的可能途徑[13].

分離提取線粒體蛋白質是進行線粒體蛋白質組學研究的關鍵步驟，由于藥物作用會導致線粒體不同程度的損傷，經過比較線粒體粗提物和純化的線粒體蛋白質雙向電泳的結果，選擇利用線粒體粗提物進行線粒體蛋白質組的差異分析. 白藜蘆醇處理后4種蛋白質表達明顯發(fā)生差異，其中驅動蛋白和著絲粒相關蛋白CENP-E 2種著絲粒蛋白是參與細胞周期的蛋白質，其表達下降說明白藜蘆醇誘導HepG2細胞凋亡可能與2種著絲粒蛋白的表達抑制有關，與白藜蘆醇影響細胞周期的功能相一致[1-2]. 線粒體中的蛋白質大部分來自于細胞核DNA編碼的蛋白，驅動蛋白和絲粒相關蛋白即屬于核編碼的蛋白，它們是否與線粒體的功能也有關還需進一步研究.線粒體加工肽酶的表達變化說明白藜蘆醇影響線粒體的功能活動.

核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分,在核糖體組裝和蛋白質合成中起重要作用，近年來研究[14]發(fā)現核糖體蛋白還具有廣泛的核糖體外功能,在細胞生長、增殖、凋亡以及一些病理過程中發(fā)揮重要作用. 線粒體核糖體蛋白作為線粒體核糖體的組成部分，其發(fā)生缺失或突變也會影響線粒體蛋白的合成而可能導致線粒體疾病[15]. 本研究中發(fā)現線粒體核糖體蛋白的表達上調，說明白藜蘆醇誘導HepG2細胞凋亡過程中線粒體核糖體蛋白可能為其作用靶點，影響線粒體功能，進而影響細胞凋亡，其機制尚有待深入研究.

[1] BHAT K P,PEZZUTO J M. Cancer chemopreventive activity of resveratrol [J]. Annual of the New York Academy of Sciences,2002,957(5):210-229.

[2] VARONI E M, LO FARO A F,SHARIFI-RAD J,et al. Anticancer molecular mechanisms of resveratrol [J]. Frontiers Nutrition,2016,8(3):1-15.

[3] ALUYEN J K,TON Q N,TRAN T,et al. Resveratrol:potential as anticancer agent [J]. Journal of Dietary Supplements,2012,9(1):45-56.

[4] RICHTER-DENNERLEIN R,OELJEKLAUS S,LORENZI I,et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein [J]. Cell,2016,167(2):471-483.

[5] WANG C,YOULE R J. The role of mitochondria in apoptosis [J]. Annual Review of Genetics,2009,43(1):95-118.

[6] MA X D,TIAN X M,HUANG X,et al. Resveratrol-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis are associated with Ca2+and mCICR-mediated MPT activation in HepG2 cells [J]. Molecular and Cellular Biochemistry,2007,302(1/2):99-109.

[7] BLANQUER-ROSSELLO M D,HEMANDEZ-LOPEZ R,ROCA P,et al. Resveratrol induces mitochondrial respiration and apoptosis in SW620 colon cancer cells [J]. Biochimica et Biophysica Acta,2017,1861(2):431.

[8] LIN X,WU G,HUO W Q,et al. Resveratrol induces apoptosis associated with mitochondrial dysfunction in bladder carcinoma cells [J]. International Journal of Urology,2012,19(5):757-764.

[9] RICHARD E,MONTEOLIVA L,JUAREZ S,et al. Quantitative analysis of mitochondrial protein expression in methylmalonic acidemia by two-dimensional difference gel electrophoresis [J]. Journal of Proteome Research,2006,5(7):1602-1610.

[10] OLIVEIRA M R,NABAVI S F,MANAYI A,et al. Resveratrol and the mitochondria:from triggering the intrinsic apoptotic pathway to inducing mitochondrial biogenesis,a mechanistic view [J]. Biochimica et Biophysica Acta ,2016,1860(4):727-745.

[11] ROGALINSKA M. The role of mitochondria in cancer induction,progression and changes in metabolism [J]. Mini Reviews in Medicinal Chemistry,2016,16(7):524-530.

[12] WANG X,PERALTA S,MORAES C T. Mitochondrial alterations during carcinogenesis:a review of metabolic transformation and targets for anticancer treatments [J]. Advances in Cancer Research,2013,119(1):127-160.

[13] GREGERSEN N,HANSEN J,PALMFELDT J. Mitochondrial proteomics:a tool for the study of metabolic disorders [J]. Journal of Inherited Metabolic Disease,2012,35(4):715-726.

[14] WANG W,NAG S,ZHANG X,et al. Ribosomal proteins and human diseases:pathogenesis,molecular mechanisms,and therapeutic implications [J]. Medicinal Research Reviews,2015,35(2):225-285.

[15] LEE J,SEOl M Y,JEONG S,et al. A metabolic phenotype based on mitochondrial ribosomal protein expression as a predictor of lymph node metastasis in Papillary Thyroid [J]. Carcinoma，2015,94(2):1-8.

Analysis of Mitochondrial Proteome in Apoptosis of HepG2 Cells Induced by Resveratrol

OU Shanfeng1， CHEN Chunxia1, MA Xiaodong2, TIAN Xuemei1*

(1.School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The effects of resveratrol on HepG2 cells apoptosis were investigated. Mitochondrial proteins were extracted from control and resveratrol treated cells and separated by two-dimensional electrophoresis. The peptide mass finger-printing was analyzed by time-of flight mass spectrometer. Four significantly differentiated proteins were identified. Kinesin protein and centromere-associated protein E (CENP-E) were down-regulated in HepG2 cells treated with resveratrol, which testified function of resveratrol on cell cycle regulation. Down-regulation of mitochondrial processing peptidase and up-regulation of mitochondrial ribosomal protein L7/L12 in HepG2 cells treated with resveratrol suggested the relationship between apoptosis induced by resveratrol and mitochondrial dysfunction in HepG2 cells.

2016-12-14 《華南師范大學學報(自然科學版)》網址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學基金項目(30300455)；廣東省科技計劃項目(2014A020212504)

*通訊作者:田雪梅，教授，Email:xmtian69@163.com.

R329.2

A

1000-5463(2017)05-0059-04

【中文責編：成文 編輯助理：冷佳奕 英文審校：李海航】