內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)豚鼠色素沉著的觀察

傅祥評(píng) 莊永燦 王紅蘭

362000福建泉州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院皮膚科

·研究報(bào)道·

內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)豚鼠色素沉著的觀察

傅祥評(píng) 莊永燦 王紅蘭

362000福建泉州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院皮膚科

目的探討內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)紫外線誘導(dǎo)豚鼠色素沉著的治療作用。方法用中波紫外線（UVB）照射豚鼠皮膚制作色素沉著模型。模型制作成功后，模型動(dòng)物分為空白對(duì)照組（生理氯化鈉溶液）、內(nèi)皮素拮抗劑組及熊果苷組（陽性對(duì)照）。分別于中波紫外線（UVB）照射前、15 d后及30 d后，用Mexameter?MX 18檢測豚鼠背部皮膚的黑素指數(shù)。連續(xù)治療30 d后比較黑素指數(shù)、表皮內(nèi)黑素細(xì)胞數(shù)目和黑素含量等指標(biāo)。結(jié)果UVB照射30 d時(shí)，豚鼠背部9塊UVB照射區(qū)域的黑素指數(shù)顯著高于照射前（P＜0.000 1）。外涂1‰內(nèi)皮素拮抗劑的照射區(qū)域30 d后的黑素指數(shù)值明顯降低，和熊果苷組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。內(nèi)皮素拮抗組黑素含量指數(shù)1明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。而3組間黑素含量指數(shù)2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論外涂內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)UVB照射誘導(dǎo)豚鼠的色素沉著有一定治療作用。

紫外線；色素沉著；治療應(yīng)用；豚鼠；內(nèi)皮素拮抗劑

過度的紫外線照射會(huì)造成皮膚細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基增加，損傷皮膚內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白和核酸，皮膚會(huì)出現(xiàn)紅斑、水腫、增生、光老化，最終形成色素沉著。目前的研究表明，皮膚美白物質(zhì)如熊果苷、曲酸、維生素C衍生物等能減輕紫外線引起的皮膚損傷，抑制黑素細(xì)胞合成黑素而減淡膚色［1?3］。研究發(fā)現(xiàn)，與非紫外線暴露區(qū)皮膚組織相比，紫外線暴露區(qū)內(nèi)皮素和多巴氧化酶的表達(dá)較高，而酪氨酸羥化酶較低［4］。因此，我們推測應(yīng)用內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)紫外線誘導(dǎo)所產(chǎn)生的色素沉著可能有治療作用。本研究通過在成年雌性豚鼠皮膚使用中波紫外線（UVB）照射制作色素沉著模型，觀察涂抹內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)色素反應(yīng)程度、表皮內(nèi)黑素細(xì)胞數(shù)目和黑素含量等指標(biāo)的影響，探討局部涂抹內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)UVB引起的豚鼠色素沉著的治療作用。

一、材料與方法

（一）主要試劑：內(nèi)皮素拮抗劑（濃度為1‰）購于上海奧利實(shí)業(yè)有限公司，熊果苷購于上海奧利實(shí)業(yè)有限公司。

（二）方法：

1.模型制作及實(shí)驗(yàn)分組：20只250 g成年雌性豚鼠JY2011A16（合格證號(hào)0248335）購于福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。紫外光輻照計(jì)對(duì)UV236B紫外線治療儀進(jìn)行能量監(jiān)測，監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，距離紫外線治療儀5 cm處，紫外線的能量強(qiáng)度為5.5 mW/cm2，該強(qiáng)度用于后續(xù)的模型制作。將每只豚鼠背部設(shè)定9個(gè)相離區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?yàn)? cm×1 cm，光斑間隔為0.5 cm。每3個(gè)為1組，取平均值（圖1）。每次照射前用剪刀剪除豚鼠背部面積為4 cm×4 cm的長毛，電動(dòng)剃須刀剃盡短毛。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（生理氯化鈉溶液）、內(nèi)皮素拮抗劑組及熊果苷組（陽性對(duì)照）3個(gè)組。先對(duì)10只豚鼠背部皮膚進(jìn)行紫外線照射30 d構(gòu)建色素沉著模型，后外涂1‰的內(nèi)皮素拮抗劑或1‰熊果苷及生理氯化鈉溶液30 d，分別從大體和鏡下觀察豚鼠皮膚顏色的變化。

2.黑素指數(shù)（melanin index，MI）測定：使用Mexameter?MX 18測量豚鼠背部皮膚的顏色。分別于照射前、照射15 d、照射30 d后測定各部位的色素指數(shù)，每個(gè)部位測4個(gè)點(diǎn)，取平均值作為該點(diǎn)的MI。為了分析內(nèi)皮素拮抗劑的治療作用，研究中比較各組間MI下降值（MI下降值=MI治療30d-MI治療前）。

3.皮膚取材：20只豚鼠背部的實(shí)驗(yàn)區(qū)域A～I(xiàn)分別取相同大小的皮膚進(jìn)行活檢。分成2份：分別福爾馬林固定后石蠟包埋，立即放入-80℃冰箱凍存。

4.Masson?Fontana銀染色法：觀察3組中黑素顆粒的數(shù)量和分布部位，評(píng)價(jià)黑素合成情況。基本步驟為：豚鼠背部9塊區(qū)域皮膚組織各取一小塊經(jīng)4%甲醛溶液固定，按常規(guī)石蠟包埋、切片；將上述切片常規(guī)脫蠟；后經(jīng)氨銀液置室溫下避光浸染16 h；蒸餾水洗2 min。0.2%氯化金水溶液處理8 min；5%硫代硫酸鈉水溶液固定5 min；中性紅液復(fù)染。黑素及嗜銀細(xì)胞顆粒呈黑色，其他組織呈復(fù)染的顏色。黑素合成的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：共分為5級(jí)。1級(jí)為基底層細(xì)胞和棘層偶見黑素顆粒；2級(jí)為黑素分布以基底層為主，且黑素顆粒分布不連續(xù)；3級(jí)為基底層細(xì)胞和棘層均可見連續(xù)呈帶狀分布的黑素顆粒；4級(jí)為基底層棘層可見大量連續(xù)呈帶狀分布的黑素顆粒，且角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)可見較多黑素帽（帽狀附著于細(xì)胞核的黑素顆粒）；5級(jí)為表皮全層密布黑素顆粒，可見較多黑素帽。

5.黑素含量指數(shù)（melanin content index，MCI）測定：用Image J Launcher分析系統(tǒng)對(duì)Masson?Fontanas銀染色切片進(jìn)行MCI計(jì)算。MCI?1：選擇10處表皮，測定受檢表皮基底層內(nèi)黑素顆粒面積占受檢基底層細(xì)胞總面積的百分比平均值。MCI?2：選擇10處表皮，測定受檢表皮基底層以上各層黑素顆粒面積占受檢基底層以上各層細(xì)胞總面積的百分比均值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SAS 6.1.76統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，采用成組t檢驗(yàn)和方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 將每只豚鼠背部設(shè)定9個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域?yàn)? cm×1 cm，光斑間隔0.5 cm。每3個(gè)1組

二、結(jié)果

圖2 UVB照射前（2A），照射30 d（2B）豚鼠背部皮膚顏色變化

1.紫外線誘導(dǎo)色素沉著動(dòng)物模型的構(gòu)建及MI測定：10只豚鼠背部皮膚的最小紅斑量200～300 mJ/cm2。肉眼觀察UVB照射前和照射30 d后豚鼠背部皮膚顏色變化，可看到豚鼠背部皮膚顏色明顯加深（圖2）。UVB照射期間未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，如水腫、鱗屑、壞死等。分別于UVB照射前、15 d后及30 d后，用Mexameter MX 18檢測豚鼠背部皮膚的色素指數(shù)。照射前、15 d、30 d后的MI值不斷上升。

2.內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)紫外線誘導(dǎo)色素沉著的治療：30 d UVB照射10只豚鼠成功構(gòu)建色素沉著模型后，外用1‰內(nèi)皮素拮抗劑或1‰熊果苷，每日1次，共30 d，比較色素沉著退卻的程度，即計(jì)算1‰內(nèi)皮素拮抗組（A-C區(qū)域）外涂前和外涂30 d后豚鼠背部皮膚的MI下降值。結(jié)果顯示3組的MI下降值分別為：空白組67.19±49.65；內(nèi)皮素拮抗劑121.90±64.71；熊果苷組89.10±41.34。內(nèi)皮素拮抗組的MI下降值和空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.71，P＜0.05）。而1‰熊果苷組的MI下降值大于空白組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

3.MCI計(jì)數(shù)及黑素合成評(píng)價(jià)：通過切片經(jīng)Masson?Fontana銀染色（圖3），發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素拮抗劑組中黑素合成等級(jí)多為1～2級(jí)，表現(xiàn)為基底層細(xì)胞和棘層偶見黑素顆粒，黑素分布以基底層為主，且黑素顆粒分布不連續(xù)。而熊果苷和空白組的黑素合成等級(jí)多為3～4級(jí)，表現(xiàn)為基底層棘層可見大量連續(xù)呈帶狀分布的黑素顆粒，且角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)可見較多黑素帽。MCI?1在各組的數(shù)值為：空白組0.48±0.177；內(nèi)皮素拮抗劑組0.25± 0.084；熊果苷組0.44± 0.112。MCI?2在各組的數(shù)值為：空白組0.04±0.039；內(nèi)皮素拮抗劑組0.03±0.022；熊果苷組0.07±0.039。經(jīng)方差分析比較，3組間MCI?1的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。內(nèi)皮素拮抗治療組中MCI?1明顯低于空白對(duì)照治療組。但3組間MCI?2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 豚鼠皮膚Masson?Fontanas銀染色，表真皮交界處黑褐色染色代表黑素（×200） 內(nèi)皮素拮抗劑組中黑素合成等級(jí)多為1～2級(jí)，表現(xiàn)為基底層細(xì)胞和棘層偶見黑素顆粒，黑素分布以基底層為主，且黑素顆粒分布不連續(xù)。而熊果苷組和空白對(duì)照組的黑素合成等級(jí)多為3～4級(jí)，表現(xiàn)為基底層棘層可見大量連續(xù)呈帶狀分布的黑素顆粒，且角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)可見較多黑素帽

三、討論

皮膚色素沉著的發(fā)生主要與以下幾個(gè)環(huán)節(jié)有關(guān)：①酪氨酸酶的含量與活性；②黑素體的合成速度與黑化程度；③黑素體向角質(zhì)形成細(xì)胞的轉(zhuǎn)輸效能；④黑素體在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的降解速度等［5］。體外惡性黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明［6］，特異性內(nèi)皮素B拮抗劑BQ788能夠顯著抑制黑素瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)分化。本次實(shí)驗(yàn)所用的是成年雌性豚鼠，棕黃色豚鼠體內(nèi)黑素細(xì)胞、黑素小體在表皮的分布類似于人體［7］，UVB照射豚鼠作為皮膚色素沉著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型已被廣泛接受并應(yīng)用。但有關(guān)UVB照射方法與照射量不盡相同，有研究采用一次性大劑量照射［8］，有些為避免急性損傷如紅斑、脫屑等采用小劑量重復(fù)照射［9］。本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)最后確定隔日最小紅斑量小劑量照射，既可出現(xiàn)明顯色素沉著，又不造成嚴(yán)重急性損傷。我們用UVB照射誘導(dǎo)豚鼠皮膚色素沉著作為動(dòng)物模型，對(duì)內(nèi)皮素拮抗劑進(jìn)行了效果觀察，并與傳統(tǒng)美白劑熊果苷進(jìn)行比較。

熊果苷是1988年日本學(xué)者從杜鵑花科植物熊果的葉中分離到的一種具有脫色作用的單體物質(zhì)，是氫醌的一種天然存在形式。其脫色作用可能與分子結(jié)構(gòu)中存在的氫醌基團(tuán)有關(guān)。有研究表明，熊果苷在人體去色素的機(jī)制涉及黑素體中酪氨酸酶活性的抑制，而不是酪氨酸酶的表達(dá)和合成［10］。目前它在化妝品中的添加用量約為3%，小于此量對(duì)皮膚中酪氨酸酶的催化活性的抑制作用較弱，增白效果不明顯；但是大于此量能抑制或者損傷細(xì)胞生長，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的熊果苷濃度與所用的內(nèi)皮素拮抗劑一致，從而更好地比較分析兩者對(duì)黑素的作用。本研究結(jié)果提示：UVB照射30 d后，豚鼠背部UVB照射區(qū)域的MI顯著高于未照射區(qū)域。與空白對(duì)照組和外涂1‰熊果苷組相比，外涂1‰內(nèi)皮素拮抗劑共30 d（每日1次）后，豚鼠背部皮膚黑素指數(shù)明顯降低，說明內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)UVB引起的色素沉著有治療作用。取3組皮膚活檢并進(jìn)行鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：同其他組比較，內(nèi)皮素拮抗劑組的MCI?1明顯降低，即內(nèi)皮素拮抗劑組的表皮基底層內(nèi)黑素顆粒明顯減少。本研究結(jié)果顯示，外涂1‰內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)UVB照射誘導(dǎo)的色素沉著有治療作用。但是治療的相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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Therapeutic effect of an endothelin antagonist on ultraviolet B?induced pigmentation in guinea pigs

Fu Xiangping,Zhuang Yongcan,Wang Honglan
Department of Dermatology,Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Quanzhou 362000,Fujian,China

Fu Xiangping,Email:fxp8398@126.com

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of endothelin antagonist on ultraviolet B（UVB）?induced pigmentation in guinea pigs.MethodsA skin pigmentation model was established by UVB irradiation in guinea pigs.The modeled animals were divided into 3 groups to be treated with sodium chloride physiological solution（blank control group）,an endothelin antagonist（endothelin antagonist group）and arbutin（positive control group）,respectively.Before the UVB irradiation,as well as after 15?and 30?day UVB irradiation,Mexameter?MX 18 was used to detect the melanin index in the dorsal skin of guinea pigs.After 30?day consecutive treatment,melanin index,the number of melanocytes in the epidermis and melanin content were compared among the above 3 groups.ResultsAfter 30?day UVB irradiation,the melanin index in the 9 UVB?irradiated areas on the dorsal skin of guinea pigs significantly increased compared with that before the radiation（P＜ 0.0001）.After 30?day treatment with the 1‰ endothelin antagonist,the melanin index in the UVB?irradiated areas significantly decreased compared with that in the positive control group（P＜ 0.0001）.Melanin content index?1（MCI?1）was significantly lower in the endothelin antagonist group than in the blank control group（P＜ 0.05）,while no significant difference in MCI?2 was observed among the 3 groups（P＞ 0.05）.ConclusionTopical application of the endothelin antagonist has a certain therapeutic effect on UVB?induced pigmentation in guinea pigs.

Ultraviolet rays;Pigmentation;Therapeutic uses;Guinea pigs;Endothelin antagonist

傅祥評(píng)，Email：fxp8398@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.011

泉州市財(cái)政局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013Z70）

Fund program:Science and Technology Planning Project of Quanzhou Municipal Bureau of Finance（2013Z70）

2017?03?01）

（本文編輯：吳曉初）