空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌的活力及其超微結(jié)構(gòu)的影響

劉夢(mèng)蝶+唐慧+李潔+嚴(yán)守雷+王清章

摘 要：采用空氣放電技術(shù)對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，空氣放電對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用（P<0.05），且抑制效果與處理時(shí)間呈正相關(guān)；通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空氣放電處理后的菌絲體干癟褶皺且表面粗糙，外層結(jié)構(gòu)不完整；菌絲細(xì)胞和孢子細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞壁內(nèi)陷或者突起，厚薄不均勻，其中孢子細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡且液泡體積較大，細(xì)胞質(zhì)失去緊致結(jié)構(gòu)；利用AO/EB熒光染料標(biāo)記孢子細(xì)胞，結(jié)果顯示空氣放電處理顯著促進(jìn)孢子凋亡（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：空氣放電；尖孢鐮刀菌；抑制作用；超微結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào)：S477+.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2017）18-0147-05

蓮藕是我國(guó)最重要的水生蔬菜，也是一種典型的經(jīng)濟(jì)作物[1]，全國(guó)栽培面積大，產(chǎn)量高。但由于蓮藕組織含水量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，在貯藏期間容易發(fā)生腐敗霉?fàn)€從而失去其商品價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室前期研究確認(rèn)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是造成蓮藕采后腐敗的優(yōu)勢(shì)病原菌之一[2]。

空氣放電抑菌法是通過(guò)采用非均電場(chǎng)無(wú)聲放電或電暈放電使空氣電離產(chǎn)生放電生成氣，主要是臭氧（ozone）和負(fù)離子（Negative air ions，NAI，包括O2-、H2O-、O3-等），使整個(gè)殺菌環(huán)境中保持一定濃度的放電生成氣對(duì)微生物進(jìn)行短期或長(zhǎng)期處理，從而抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組分與結(jié)構(gòu)，阻礙病原菌物質(zhì)代謝、呼吸代謝、能量代謝，進(jìn)而誘導(dǎo)病原菌細(xì)胞凋亡。

利用空氣放電生成氣對(duì)尖孢鐮刀菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，研究空氣放電處理對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲和孢子的生長(zhǎng)、凋亡及超微結(jié)構(gòu)的影響，為空氣放電抑制尖孢鐮刀菌的機(jī)理研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

①菌種 尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）由本實(shí)驗(yàn)室對(duì)蓮藕貯藏期病原菌進(jìn)行分離保存。

②試劑 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：北京陸橋責(zé)任技術(shù)有限公司；AO/EB染料：上海貝博生物公司。

③儀器 臭氧變送器MIC-O3，負(fù)離子發(fā)生器XA-1：深圳市藍(lán)月測(cè)控技術(shù)有限公司；掃描電鏡：日本NTC公司；透射電鏡：日本HITACHI公司；熒光顯微鏡：日本Olympus公司。

1.2 試驗(yàn)方法

①試驗(yàn)設(shè)計(jì) F. oxysporum置于PDA平板上培養(yǎng)6 d后，在菌落邊緣打出直徑6 mm的菌餅移至新的PDA平板中央，當(dāng)密閉空氣放電設(shè)備內(nèi)氣體中ozone和NAI生成氣達(dá)到設(shè)定濃度后，將樣品放入ozone（濃度3 500 mg/m3）、NAI（濃度6×106 ions/cm3）、ozone+NAI同時(shí)處理（3 500 mg/m3+6×106 ions/cm3），處理時(shí)間分別為6、12、18、24、30、36 h，處理完畢后立即將平板倒置于26℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次，以不做任何處理為對(duì)照。

②抑菌率的測(cè)定 培養(yǎng)3 d后，用“十”字交叉法測(cè)定其菌落擴(kuò)展直徑，計(jì)算其抑菌率[3，4]。抑菌率（%）=（a-b）/a，a為對(duì)照菌落的平均直徑，b為處理菌落的平均直徑。

③孢子萌發(fā)抑制率的測(cè)定 培養(yǎng)6 d后，采用凹玻片法測(cè)孢子的萌發(fā)率[5]，將上述經(jīng)不同處理

后的培養(yǎng)皿上的分生孢子用無(wú)菌水洗下，離心

（1 500 r/min，5 min）洗滌得到純凈孢子，加適量無(wú)菌水使其濃度達(dá)到在顯微鏡下每個(gè)視野中有30～50個(gè)孢子，另設(shè)空白對(duì)照，每組重復(fù)3次，26℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，觀察孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)玻片按5點(diǎn)取樣法觀察5個(gè)視野，計(jì)算孢子的萌發(fā)抑制率。

④菌絲超微結(jié)構(gòu)的觀察 a.菌絲形態(tài)掃描電鏡的觀察。將對(duì)照菌絲和處理18 h后培養(yǎng)6 d的菌絲刮下，離心（1 500 r/min，5 min，4℃）勾取菌絲并洗滌。用2.5%戊二醛溶液固定2.5 h；0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）沖洗4次，每次15 min；用30%、50%、70%、80%、90%、100%系列濃度梯乙醇各脫水10 min，醋酸異戊酯置換25 min，真空干燥后鍍金[6]。制好的掃描電鏡樣品在掃描電鏡下觀察、拍照。

b.菌絲細(xì)胞透射電鏡的觀察。同上得到純凈的菌絲。在4℃ 下用3%的戊二醛固定2 h，0.1 mol/L PBS沖洗3次，每次10 min，浸泡于1%鋨酸溶液中，4℃ 放置1 h，0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，每次10 min，50%、70%、90%系列濃度梯度的乙醇脫水15 min，再用100%的丙酮脫水3次，每次10 min，最后用環(huán)氧樹(shù)脂作為包埋劑進(jìn)行包埋，包埋后將樣品放入恒溫箱中進(jìn)行聚合，制成超薄切片，分別用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛各染色30 min[7]。制備好的樣品置于透射電鏡下觀察并記錄。

⑤孢子超微結(jié)構(gòu)的觀察 將對(duì)照組孢子和處理18 h后培養(yǎng)6 d的孢子用無(wú)菌水洗下，離心

（1 500 r/min，5 min，4℃）棄上清液并洗滌得到純凈的孢子。采取相同方法制備透射電鏡樣品并觀察。

⑥AO/EB（吖啶橙/溴乙錠）熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將對(duì)照組孢子和處理18 h后培養(yǎng)6 d的孢子用無(wú)菌水洗下，離心（1 500 r/min，5 min，4℃）洗滌得到純凈孢子，加1.5 mL無(wú)菌水重新懸浮。取各處理孢子懸浮液50 μL，分別加入AO/EB染料

2 μL混勻，30 s后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞[8]。

1.3 數(shù)據(jù)分析及處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Data Processing System（DPS 7.05）軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖1可以看出，ozone、NAI、ozone+NAI 3種處理方式對(duì)菌絲的生長(zhǎng)均有抑制作用，處理時(shí)間越長(zhǎng)抑菌效果越好，兩者呈正相關(guān)關(guān)系。其中ozone+NAI的抑制作用最明顯，其次是ozone處理組，NAI處理抑制作用最弱，說(shuō)明ozone+NAI處理組較ozone和NAI單獨(dú)處理組有明顯的增效作用。由圖1可看出，24 h 前ozone+NAI的抑菌效果顯著強(qiáng)于ozone和NAI單獨(dú)處理組（P<0.05），24 h后這種差異逐漸減小，30 h后各組間差異不顯著。

2.2 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

由圖2可以看出，ozone、NAI、ozone+NAI 3種處理方式對(duì)孢子萌發(fā)均有明顯抑制作用，孢子萌發(fā)率與處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，處理時(shí)間越長(zhǎng)孢子萌發(fā)率越低，即處理時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)孢子細(xì)胞損傷越大，降低其萌發(fā)率。ozone+NAI處理對(duì)孢子細(xì)胞損傷最大，其次為ozone和NAI單獨(dú)處理組。結(jié)合圖2可知，ozone+NAI的抑菌效果最強(qiáng)，ozone單獨(dú)作用的抑菌效果優(yōu)于NAI單獨(dú)作用（P<0.05）。

2.3 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲形態(tài)的影響

通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖3），對(duì)照組菌絲形態(tài)正常，菌絲較為飽滿(mǎn)，菌絲體表面光滑，粗細(xì)均勻一致，無(wú)褶皺或凹陷出現(xiàn)；經(jīng)ozone、NAI、ozone+NAI處理后的菌絲形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，菌絲體干癟褶皺且表面粗糙，外層結(jié)構(gòu)不完整，其中ozone+NAI處理組菌絲體變形嚴(yán)重，說(shuō)明ozone+NAI處理組較ozone和NAI單獨(dú)處理組抑菌效果更為明顯。

2.4 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲細(xì)胞的影響

通過(guò)透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖4），對(duì)照組菌絲細(xì)胞呈圓形或者橢圓形，細(xì)胞較為正常飽滿(mǎn)；經(jīng)ozone、NAI、ozone+NAI處理后的菌絲細(xì)胞發(fā)生較為明顯的變化，細(xì)胞形態(tài)極不規(guī)則，細(xì)胞壁內(nèi)陷或者突起。ozone+NAI處理對(duì)菌絲細(xì)胞的損傷比ozone和NAI單獨(dú)作用明顯，ozone處理對(duì)菌絲細(xì)胞的傷害大于NAI處理，以上結(jié)果說(shuō)明空氣放電能夠?qū)е戮z細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。

2.5 空氣放電對(duì)尖孢鐮刀菌孢子細(xì)胞的影響

通過(guò)透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)（圖5），對(duì)照組孢子細(xì)胞形態(tài)正常，呈橢圓形，細(xì)胞壁厚薄均勻，細(xì)胞內(nèi)容物如線粒體、細(xì)胞核等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較為完整，均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中且細(xì)胞質(zhì)較為緊致，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜無(wú)破損，胞外無(wú)外滲物，經(jīng)ozone、NAI、ozone+NAI處理后的孢子細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞壁內(nèi)陷或者突起，細(xì)胞壁厚薄不均勻，且經(jīng)ozone+NAI處理后的孢子細(xì)胞壁更薄，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡且液泡體積較大，細(xì)胞質(zhì)失去緊致結(jié)構(gòu)，說(shuō)明空氣放電破壞了細(xì)胞的細(xì)胞器及完整結(jié)構(gòu)。

2.6 AO/EB熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞凋亡

由圖6可以看出，未經(jīng)空氣放電處理的孢子細(xì)胞核染色質(zhì)大都呈現(xiàn)綠色熒光，說(shuō)明孢子細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞界限清晰，因?yàn)檫灌こ龋ˋO）能自由透過(guò)細(xì)胞膜與DNA結(jié)合。而溴乙錠（EB）只能穿透破損細(xì)胞膜與DNA結(jié)合呈現(xiàn)橘紅色熒光，經(jīng)空氣放電處理后的孢子細(xì)胞橘紅色熒光明顯增多，說(shuō)明孢子細(xì)胞膜受損，通透性發(fā)生變化，孢子可能失去了正常萌發(fā)的能力。

2.7 空氣放電對(duì)孢子細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)正常孢子和凋亡孢子所標(biāo)記的吖啶橙和溴乙錠激發(fā)后的顏色差異，利用image pro plus 6.0對(duì)AO/EB熒光圖像進(jìn)行分析得到不同處理組在

18 h處理下的孢子細(xì)胞凋亡情況（圖7），可看出空氣放電處理組孢子凋亡率顯著高于未處理組（P<0.05），且ozone+NAI處理組孢子凋亡率顯著高于ozone和NAI單獨(dú)處理組（P<0.05），而ozone單獨(dú)作用效果優(yōu)于NAI單獨(dú)處理組，說(shuō)明空氣放電能夠引起細(xì)胞凋亡，有明顯的抑菌作用。

3 結(jié)論

空氣放電對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用（P<0.05），且抑制效果與處理時(shí)間呈正相關(guān)。3種處理中，ozone+NAI處理組抑菌作用最為明顯，ozone單獨(dú)處理組的抑菌效果要優(yōu)于NAI單獨(dú)處理組。通過(guò)對(duì)菌絲、孢子超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，空氣放電處理后的菌絲體皺縮變形，同時(shí)處理后的菌絲細(xì)胞和孢子細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞壁內(nèi)陷或者突起，厚薄不均勻，其中孢子細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量液泡且液泡體積較大，細(xì)胞質(zhì)失去緊致結(jié)構(gòu)。AO/EB染色試驗(yàn)表明空氣放電對(duì)細(xì)胞凋亡具有顯著促進(jìn)作用（P<0.05）。

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Effect on Vitality and Ultrastructure of Fusarium oxysporum by Air Discharge

LIU Mengdie1， TANG Hui1， LI Jie2， YAN Shoulei1， WANG Qingzhang1

（ 1.College of Food Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070；

2.Aquatic Vegetable Preservation and Processing Technology Engineering Research Center of Hubei Province ）

Abstract： In this study， air discharge technology was adopted to investigate the effects on the vitality and ultrastructure of Fusarium oxysporum by bacteriostatic test in vitro. The results showed that air discharge had significant inhibition on mycelial growth and spore germination of F. oxysporum （P<0.05） and the inhibition ratio was positively correlated with treatment time. Structural damages were analyzed by scanning electron microscopy （SEM） and transmission electron

microscopy （TEM）. SEM observation indicated that， after air discharge treatments， the mycelium was dry and wrinkled with rough and incomplete surface. Cells of mycelia and spores were irregular in shape， and cell walls had invagination or protrusions with uneven thickness. In spore cells， a large number of vacuoles with a larger volume appeared and cytoplasm lost compact structure. The results by AO/EB fluorescent dye mark showed that air discharge significantly promoted the spore apoptosis （P<0.05）.

Key words： Air discharge； Fusarium oxysporum； Inhibition； Ultrastructureendprint