大豆皂苷I與II及苷元B對(duì)黃曲霉毒素B1和苯并芘突變效應(yīng)的拮抗

光翠娥， 干建平， 楊紅飛， 李志剛

（1.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

大豆皂苷I與II及苷元B對(duì)黃曲霉毒素B1和苯并芘突變效應(yīng)的拮抗

光翠娥1，2， 干建平1， 楊紅飛2， 李志剛2

（1.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃岡 438000；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

本研究確認(rèn)了大豆皂苷I與II及苷元B對(duì)黃曲霉毒素B1和苯并芘的抗突變作用。Ames試驗(yàn)中，除了最小劑量時(shí)大豆皂苷I與II未能顯著抑制移碼突變外，3個(gè)受試物均明顯抑制黃曲霉毒素B1和苯并芘誘發(fā)的TA98和TA100回復(fù)突變。而且，除了最小劑量時(shí)大豆皂苷I與II未能顯著抑制苯并芘與DNA的結(jié)合外，3個(gè)受試物均明顯抑制人肝癌 （HepG2）及支氣管上皮（BEAS-2B）細(xì)胞中突變劑與DNA加合物的形成。大體上，苷元B比大豆皂苷I與II更有效地抑制移碼與堿基置換突變和加合物的形成。因此，3個(gè)食源活性成分不僅抑制基因突變同時(shí)也拮抗突變劑誘導(dǎo)的DNA損害。

大豆皂苷；黃曲霉毒素；苯并芘；Ames試驗(yàn)；DNA加合物

以苷元B為配基的大豆皂苷I與II是天然的齊墩果酸型五環(huán)三萜苷，其含量隨大豆品種、種植年份、地理位置及成熟度而變化[1]，大豆皂苷I更多存在于胚芽中而大豆皂苷II則主要分布在子葉中[2]。兩皂苷分子具有兩親性，由極性可溶的糖鏈連接到非極性不可溶的苷元B C-3位上[3]，分子式分別為3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-β-D-吡喃半乳糖基 （1→2）-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-苷元B和3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）-α-L-吡喃阿拉伯糖基（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基-苷元 B。作為單糖鏈 B 族和 DDMP （2，3-二氫-2，5-二羥-6-甲基-4-氫-吡喃-4-酮）族皂苷的糖苷配基，苷元B（齊墩果酸型-12-烯-3β，22β，24-三醇） 由大豆皂苷酸堿水解生成，因而可存在于大豆制品中[4]。B族大豆皂苷經(jīng)人體代謝成苷元B[5]，其中大豆皂苷I由人體糞便微生物代謝成中間體大豆皂苷III（或者大豆皂苷III與苷元 B-3-β-D-葡糖苷酸）[6]，而大豆皂苷 II的代謝中間體為大豆皂苷IV[7]。

大豆皂苷I有抗炎、抗癌、抗微生物、抗氧化、佐劑、肝臟、腎臟及心血管保護(hù)等功能，大豆皂苷II有抗病毒、佐劑、肝臟及心血管保護(hù)等功能，苷元B也能抗炎、抗癌、抗病毒及保護(hù)肝臟[8]。大豆皂苷粗提物顯著抑制黃曲霉毒素B1誘發(fā)的堿基置換突變并通過抑制DNA加合物的生成而阻止癌變的啟動(dòng)[9]，苷元B則能拮抗2-乙酰氧基乙酰氨基芴誘導(dǎo)的DNA損害[10]。本研究通過細(xì)菌回復(fù)突變和DNA加合物形成實(shí)驗(yàn)確定大豆皂苷I與II及苷元B對(duì)黃曲霉毒素B1和苯并芘的抗突變作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

大豆皂苷 I，II，苷元 B：美國 ChromaDex 公司；TA98，TA100，S9： 美國 Molecular Toxicology 公司產(chǎn)品；黃曲霉毒素B1，苯并芘，輔酶II，6-磷酸葡萄糖，L-組氨酸，D-生物素，核糖核酸酶：Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；[3H]黃曲霉毒素B1，[3H]苯并芘：美國Radiolabeled Chemicals公司產(chǎn)品；HepG2和BEAS-2B 細(xì) 胞 ：AmericanType Culture Collection；RPMI-1640和LHC-8培養(yǎng)基，胎牛血清，蛋白酶K：Gibco公司產(chǎn)品；LS 6500液體閃爍計(jì)數(shù)器：Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 移碼和堿基突變拮抗實(shí)驗(yàn) Ames實(shí)驗(yàn)中，鼠傷寒沙門氏菌TA98和TA100分別用于指示移碼突變和堿基置換突變。菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h。代謝活化體系包括（體積分?jǐn)?shù) ）：S9，4% ；0.4 mol/L MgCl2，1%；1.65 mol/L KCl，1%；1 mol/L 6-磷酸葡萄糖，0.5%；0.1 mol/L 輔酶 II，4%；0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，50%；無菌蒸餾水，39.5%。實(shí)驗(yàn)時(shí)，0.05 mL受試物、0.05 mL突變劑（20 μg/mL）、0.1 mL 菌株液以及 0.5 mL S9 混合液在37℃預(yù)孵30 min，加入含0.5 mmol/L組氨酸/生物素溶液的頂層瓊脂培養(yǎng)基2 mL，充分混勻，傾入底層葡萄糖瓊脂平板上，待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)[11]。

1.2.2 DNA加合物形成拮抗實(shí)驗(yàn) HepG2培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，BEAS-2B則培養(yǎng)在LHC-8中，培養(yǎng)箱條件為37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及90%相對(duì)濕度。培養(yǎng)基每隔一天更新，直至匯合達(dá)80%～90%。通過0.25 g/dL胰酶及0.02 g/dL EDTA傳代后，以細(xì)胞濃度6×105個(gè)/mL接種，24 h孵育后，由含受試物的培養(yǎng)基取代。在1 h預(yù)孵后，加入[3H]黃曲霉毒素 B1或[3H]苯并芘（30 nmol/L），24 h后，所得細(xì)胞用冷PBS沖洗2次，然后用含10 mmol/L Tris·HCl、0.1 mol/L EDTA、0.1 mg/mL 蛋白酶K及0.5 g/dL十二烷基硫酸鈉的溶液在50℃水浴中抽提 3 h。 用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）及氯仿∶異戊醇（24∶1）清洗后，分離出的 DNA 使用 1/5 體積的5 mol/L NaCl和2體積體積分?jǐn)?shù)99%的乙醇在-80℃沉降1 h，離心后，所獲沉淀用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇清洗，并使用核糖核酸酶在37℃重新溶解2 h。DNA量由在260 nm UV吸收方法決定，輻射量由液體閃爍計(jì)數(shù)器測量[9，12]。

2 結(jié)果與討論

從表1可知，高劑量大豆皂苷I與II顯著抑制2突變劑誘導(dǎo)的移碼突變，而苷元B在所有受試濃度都起作用（P＜0.01）見表 1。

表1 大豆皂苷 I（SSI）與 II（SSII）及苷元 B（SB）對(duì)黃曲霉毒素 B1（AFB1）和苯并芘（B[a]P）誘導(dǎo)的基因突變的拮抗Table 1 Protective effects of soyasaponin I （SSI），II （SSII） and soyasapogenol B （SB） against aflatoxin B1 （AFB1）-and benzo[a]pyrene（B[a]P）-induced mutations（1 μg/plate） in Salmonella typhimurium TA98/TA100*

在最低劑量0.3 mg/皿，苷元B的抑制能力明顯強(qiáng)于大豆皂苷I與II，在最高劑量1.2 mg/皿，苷元B抑制苯并芘誘導(dǎo)的移碼突變的能力也顯著強(qiáng)于2個(gè)皂苷。對(duì)于兩突變劑誘導(dǎo)的堿基置換突變，3個(gè)活性物在3個(gè)受試濃度都實(shí)施了顯著抑制；對(duì)于黃曲霉毒素B1誘發(fā)的突變，3個(gè)劑量皂苷彼此抑制能力顯著不同，對(duì)于苯并芘誘發(fā)的突變，不同劑量苷元B抑制能力也有顯著差異；苷元B在最低劑量0.3 mg/皿時(shí)抑制黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的堿基置換突變能力顯著強(qiáng)于2個(gè)皂苷，而對(duì)于苯并芘誘發(fā)的突變，苷元B在3個(gè)受試濃度均顯示了比皂苷明顯更強(qiáng)的拮抗能力。在劑量0.6 mg/皿，大豆皂苷I抑制了31.1%的黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的移碼突變和62.6%的堿基置換突變，大豆皂苷II分別抑制了36.8%和66.4%，苷元B則分別抑制了42.1%和68.4%；對(duì)于苯并芘誘導(dǎo)的移碼和堿基置換突變，大豆皂苷I分別抑制了35.4%和40.5%，大豆皂苷II分別抑制了36.4%和42.1%，苷元B則分別抑制了41.6%和63.5%。大體上，苷元B比大豆皂苷I與II更有效抑制突變，3個(gè)活性物拮抗堿基置換突變比拮抗移碼突變更有效。3個(gè)活性物對(duì)基因突變的拮抗可能緣于它們對(duì)親電突變劑的清除能力以及對(duì)基因毒物代謝的影響[9]。

圖1總結(jié)了3個(gè)活性物對(duì)HepG2中黃曲霉毒素B1-DNA和BEAS-2B中苯并芘-DNA加合物形成的拮抗。黃曲霉毒素B1與苯并芘分別產(chǎn)生1.14 pmol/mg和1.57 pmol/mg的加合物，除了在最低計(jì)量（5 mg/mL）大豆皂苷I與II未能顯著抑制苯并芘與DNA的結(jié)合外，3個(gè)受試物均能有效拮抗加合物生成（P＜0.01）；同一活性物在不同濃度的抑制能力沒有顯著差異；大豆皂苷II在質(zhì)量濃度30 μg/mL與50 μg/mL對(duì)黃曲霉毒素B1-DNA形成的拮抗能力明顯小于苷元B，2個(gè)皂苷在質(zhì)量濃度5 μg/mL對(duì)苯并芘-DNA形成的抑制能力也顯著弱于苷元B。在質(zhì)量濃度 10～50 μg/mL 和 5～15 μg/mL 下，3 個(gè)受試物分別抑制了30%～50%與17%～45%2種加合物形成。類似地，同一質(zhì)量濃度下苷元B比大豆皂苷I與II更有效抑制加合物生成。3個(gè)活性物對(duì)DNA加合物形成的拮抗可能緣于它們對(duì)細(xì)胞膜滲透性的改變[9]。

圖1 大豆皂苷 I（SSI）、II（SSII）及苷元 B（SB）對(duì)黃曲霉毒素 B1（AFB1）-DNA 和苯并芘（B[a]P）-DNA 的拮抗（鄧肯氏多范圍檢驗(yàn)確定顯著性差異）Fig.1 Protective effects of soyasaponin I （SSI），II （SSII） and soyasapogenol B （SB） against the formation of aflatoxin B1（AFB1）-DNA（a） and benzo[a]pyrene（B[a]P）-DNA（b） adducts.Significance（P＜0.01） was determined by Duncan’s multiple range test

3 結(jié)語

作為粗提物中的組成成分，大豆皂苷I與II及苷元B均貢獻(xiàn)于對(duì)黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的堿基置換突變以及HepG2中黃曲霉毒素B1-DNA形成的抑制，它們也能拮抗黃曲霉毒素B1誘導(dǎo)的移碼突變、苯并芘誘導(dǎo)的移碼與堿基置換突變以及BEAS-2B中苯并芘-DNA的生成。因此，3個(gè)食源活性成分能有效阻止基因突變并通過抑制DNA加合物形成而延緩癌變的啟動(dòng)。

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會(huì)議名稱(中文)：中國微生物學(xué)會(huì)釀造分會(huì)2017年學(xué)術(shù)年會(huì)

所屬學(xué)科：生物物理學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué),生物技術(shù)與生物工程

開始日期：2017-10-31

結(jié)束日期：2017-11-03

所在城市：北京市 東城區(qū)

主辦單位：中國微生物學(xué)會(huì)釀造分會(huì)

聯(lián)系人：高潔 魯緋

聯(lián)系電話：010-66237217

E-MAIL：gaojie@ninh.chinacdc.cn

會(huì)議網(wǎng)站：http://csm.im.ac.cn/templates/team/introduction.aspx?nodeid=9&page=ContentPage&contentid=4847

會(huì)議背景介紹：我國政府于2016年頒布“健康中國2030規(guī)劃綱要”，強(qiáng)調(diào)要將健康工作結(jié)合到所有政府工作當(dāng)中，把健康作為我國社會(huì)發(fā)展的目標(biāo)。利用微生物發(fā)酵而成的釀造食品是我國膳食結(jié)構(gòu)中的重要組成部分，發(fā)酵過程不僅能夠提高原產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物及微生態(tài)菌群，增加釀造食品的營養(yǎng)和保健價(jià)值，與我國居民的營養(yǎng)健康密切相關(guān)。我國微生態(tài)和益生菌資源豐富，是釀造科學(xué)應(yīng)用大國，近年來，產(chǎn)業(yè)界依靠科技與學(xué)術(shù)界共同致力于菌種資源基礎(chǔ)研究以及自有核心技術(shù)創(chuàng)新，推動(dòng)符合健康需求的產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)。為了及時(shí)掌握國內(nèi)外釀造科學(xué)與產(chǎn)業(yè)信息的最新進(jìn)展，促進(jìn)科技界與產(chǎn)業(yè)界的交流與融合，中國微生物學(xué)會(huì)釀造分會(huì)將于2017年10月31-11月3日（31日?qǐng)?bào)道，1-2日會(huì)議，3日離會(huì)）在北京舉辦以“釀造科學(xué)與健康”為主題的釀造分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)。本次會(huì)議將就釀造領(lǐng)域相關(guān)的科學(xué)理論和技術(shù)展開報(bào)告及研討，并適時(shí)組織參觀相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)。

Protective Activities of Soyasaponin I，II and Soyasapogenol B Against Aflatoxin B1 and Benzo[a]Pyrene-Induced Mutagenicity

GUANG Cuie1，2， GAN Jianping1， YANG Hongfei2， LI Zhigang2
（1.Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization，Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang Normal University，Huanggang 438000，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Inhibitory activities of soyasaponin I，II and their aglycone for aflatoxin B1 （AFB1） and benzo[a]pyrene（B[a]P）-induced mutagenicity were investigated.In the Ames assay，Salmonella typhimurium strains TA98 and TA100 were selected for frameshift and base substitution mutations，respectively.Three compounds showed remarkable protection against AFB1 and B[a]P-induced mutations，with the exception that at the low concentration of 0.3 mg/plate soyasaponins I and II did not significantly inhibit the frameshift mutation.Three compounds also effectively protected againstthe formation of AFB1-DNA adduct in HepG2 cells and B[a]P-DNA adduct in BEAS-2B cells，with the exception that at the low concentration of 5 g/ml soyasaponins I and II showed no significant inhibition for the binding of B[a]P to DNA.Generally，soyasapogenol B more effectively suppressed AFB1 and B[a]P-induced frameshift and base substitution mutations and showed stronger inhibitory activities in the formation of adducts than soyasaponins I and II.These results indicate that three bioactives not only inhibit gene mutations but also protect against mutagen-induced DNA damage.

soyasaponins，aflatoxin B1，benzo[a]pyrene，Ames test，DNA adduct

R 992

A

1673—1689（2017）08—0814—05

10.3969/j.issn. 1673-1689.2017.08.005

2015-07-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201289）；經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心聯(lián)合開放基金項(xiàng)目（2017AW01）。

光翠娥（1976—），女，湖北仙桃人，工學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事食品營養(yǎng)與功能因子研究。E-mail：guang1226@hotmail.com

光翠娥，干建平，楊紅飛，等.大豆皂苷I與II及苷元B對(duì)黃曲霉毒素B1和苯并芘突變效應(yīng)的拮抗[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（08）：814-818.