克氏梭菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)提高己酸產(chǎn)量

嵇 翔 ， 徐 巖 *， 穆曉清 ， 葛向陽

（1.江南大學(xué) 工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

克氏梭菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)提高己酸產(chǎn)量

嵇 翔1，2， 徐 巖*1，2， 穆曉清1，2， 葛向陽1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)微生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為了提高克氏梭菌8022產(chǎn)己酸的能力，縮短發(fā)酵周期，作者將該株菌與釀酒酵母進(jìn)行了混合培養(yǎng)，并進(jìn)一步分析混合培養(yǎng)體系提高己酸產(chǎn)量的機(jī)理。研究表明：在用發(fā)酵罐對(duì)己酸菌進(jìn)行純培養(yǎng)時(shí)己酸菌產(chǎn)量可達(dá)6.35 g/L，與釀酒酵母共培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)酸達(dá)到7.09 g/L，產(chǎn)酸提高了12.5%，且到達(dá)最大產(chǎn)酸的周期縮短了約48 h。相關(guān)參數(shù)的分析表明，釀酒酵母在共培養(yǎng)過程中主要通過提高乙酸到丁酸的轉(zhuǎn)化速率，從而提高己酸的產(chǎn)量。通過分析溶氧值和微生物生長參數(shù)，表明引起這一變化的主要原因是共培養(yǎng)時(shí)釀酒酵母的生長提高了共培養(yǎng)體系的厭氧水平，促進(jìn)丁酸的生成和轉(zhuǎn)化，從而提高了己酸的產(chǎn)量。

克式梭菌；釀酒酵母；純培養(yǎng)；共培養(yǎng)；己酸

目前文獻(xiàn)報(bào)道的己酸菌[1-3]，主要是克魯氏梭狀芽孢桿菌（Clostridium kluyveri）[4]，簡稱克氏梭菌。 是我國主要香型之一的濃香型白酒中主要產(chǎn)酸微生物，由它代謝產(chǎn)生的己酸與發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇作用生成己酸乙酯，構(gòu)成了濃香型大曲酒的主體香氣物質(zhì)，是影響白酒品質(zhì)的重要因素之一[5-6]。所以克氏梭菌的產(chǎn)酸能力直接影響著濃香型白酒的產(chǎn)品品質(zhì)?？耸纤缶且活惤^對(duì)厭氧的細(xì)菌，細(xì)胞呈現(xiàn)桿狀，帶芽孢，革蘭氏染色陽性，在乙酸鈉培養(yǎng)基中可利用乙醇和乙酸合成丁酸和己酸并產(chǎn)生氫氣[7]。通?？刹捎脜捬跖囵B(yǎng)箱培養(yǎng)，簡單的液態(tài)發(fā)酵則可通過深層培養(yǎng)或提高裝液量的方式來保證其厭氧環(huán)境。

目前，濃香型白酒生產(chǎn)工藝主要是采用固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵工藝和體系較為復(fù)雜，不方便模擬研究。而采用新型的“無土發(fā)酵”即液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酸，可以簡化發(fā)酵流程，縮短周期，對(duì)研究混合菌種產(chǎn)酸非常有效。此前一些研究者報(bào)道了液態(tài)發(fā)酵提高己酸產(chǎn)量的策略，如洋河酒廠將克氏梭菌8022及異常漢遜酵母1295巴氏AS1.41混合培養(yǎng)可使己酸產(chǎn)量達(dá)到4.4 g/L。三井酒業(yè)通過對(duì)發(fā)酵車間窖泥的己酸菌分離純化，篩選到8株己酸菌，最高一株產(chǎn)己酸可達(dá)3.0 g/L。早前的山東曲阜酒廠曾簡要介紹了通過生香酵母和己酸菌共同發(fā)酵能促進(jìn)己酸菌生長和產(chǎn)酸，產(chǎn)酸最高可達(dá)4.5 g/L。一般國內(nèi)的產(chǎn)己酸水平在4～6 g/L，如何通過調(diào)控己酸合成代謝途徑，進(jìn)一步提高己酸產(chǎn)量，是當(dāng)前己酸發(fā)酵的研究重點(diǎn)[8]。

近年來，混合培養(yǎng)體系，特別是與酵母菌混合培養(yǎng)的產(chǎn)酸、產(chǎn)酶體系引起了廣泛的關(guān)注。研究表明，在與酵母菌共培養(yǎng)的混合發(fā)酵體系中，通過其中的協(xié)同作用機(jī)制，達(dá)到促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物合成的目的。而關(guān)于和釀酒酵母共培養(yǎng)提高產(chǎn)酸卻少見報(bào)道。為了進(jìn)一步提高克氏梭菌的己酸合成能力，作者將己酸菌和釀酒酵母進(jìn)行了混合培養(yǎng)，明顯提高了該株菌的己酸合成速率，通過發(fā)酵罐液態(tài)發(fā)酵的方法比較了在己酸菌純培養(yǎng)和與酵母共培養(yǎng)[9-12]的情況下，其產(chǎn)酸和其他參數(shù)的變化情況，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，初步探究了產(chǎn)酸提高的機(jī)理，為進(jìn)一步研究和優(yōu)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 克氏梭菌8022：江蘇洋河酒廠股份有限公司窖泥中分離得到，江南大學(xué)釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：江南大學(xué)釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 乙酸鈉改良培養(yǎng)基（g/dL）：NaAc 0.6，酵母膏 0.5，K2HPO30.04，MgSO40.02，（NH4）2SO40.05;乙醇體積分?jǐn)?shù)2%（培養(yǎng)基滅菌后加入），pH 7.0，121℃滅菌20 min。

YPD 培養(yǎng)基（g/dL）：酵母膏 1，蛋白胨 2，葡萄糖2，115℃滅菌 30 min。

1.1.3 主要試劑 叔戊酸（GR）:美國SIGMA公司；乙酸鈉 （AR）:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（GR）:上海安普科學(xué)儀器有限公司；正己酸（GR）:美國SIGMA公司；正丁酸（GR）:美國SIGMA公司；磷酸氫二鉀（AR）:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（AR）:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨（AR）:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要設(shè)備和儀器 天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；恒溫培養(yǎng)箱：華粵行儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY KOGYO公司；氣相色譜儀 7890A：安捷倫公司；紫外可見分光光度計(jì)：光尼柯（上海）儀器有限公司；漩渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司;發(fā)酵罐（7L）：New Brunswick，Eppendorf BioFlo/CelliGen 115。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 己酸菌發(fā)酵培養(yǎng) 將己酸菌發(fā)酵液以體積分?jǐn)?shù)10%接入乙酸鈉培養(yǎng)基中，于37℃下恒溫培養(yǎng)。由于己酸菌是厭氧菌，發(fā)酵液裝瓶量應(yīng)控制在90%以上并使錐形瓶密閉。己酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)：將己酸菌發(fā)酵液以體積分?jǐn)?shù)10%接入乙酸鈉培養(yǎng)基中，于37℃下恒溫培養(yǎng)4 d后，保藏在4℃冰箱中。

1.2.2 酵母培養(yǎng)方法 挑單菌落接入經(jīng)滅菌的YPD培養(yǎng)基100 mL/500 mL三角瓶，溫度30℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵16 h，加無菌水稀釋使得酵母菌液濃度為108～2×108CFU/mL，取適量菌液離心后加入醋酸鈉培養(yǎng)基，接種體積分?jǐn)?shù)20%。

1.2.3 氣相法測揮發(fā)酸條件 GC[13]條件：柱型號(hào)CP-WAX57CB（50 m長，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.2 mm）；柱溫：采用程序升溫，初始溫度為50℃，保持2 min，升溫速率為15℃/min，終止溫度為230℃，保持15 min；進(jìn)樣器溫度為150℃，檢測器溫度為250℃；載氣（高純氮）流速為44 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣的流速為400 mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。前處理方法為取適量發(fā)酵液，加0.1 mol/L稀硫酸調(diào)至pH 2，膜濾（0.22 μL水系）加1%內(nèi)標(biāo)叔戊酸，振蕩混勻放入1 mL離心管，存于4℃冰箱。

1.2.4 高效液相色譜測乙醇 檢測器：示差折光檢測器；流動(dòng)相：0.05 mmol/L濃硫酸，流速0.6 mL/min，洗脫時(shí)間30 min。前處理方法為：取樣品0.5 mL加1 mL 三氯乙酸，4 ℃沉淀 30 min，過膜（0.22 μL 水系）[15-16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 己酸菌純培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酸情況

如圖1所示，克氏梭菌8022純培養(yǎng)時(shí)，前體物質(zhì)丁酸大約第96 h開始產(chǎn)生，從第120 h開始合成己酸，此時(shí)，丁酸的生成速率大于其消耗速率，故此階段丁酸濃度逐步上升，直至約120 h。而己酸產(chǎn)生直至240 h左右趨于穩(wěn)定。產(chǎn)物丁酸從開始產(chǎn)生到第130 h左右達(dá)到峰值，約4.5 g/L。此后，丁酸的消耗速率大于生成速率，開始呈現(xiàn)下降趨勢，大約144 h左右趨于穩(wěn)定。從圖中可以看出，本菌株在純培養(yǎng)條件下的己酸最大產(chǎn)量可達(dá)6.35 g/L。

2.2 克氏梭菌8022與與釀酒酵母共培養(yǎng)條件下己酸合成

如圖2所示，克氏梭菌8022與釀酒酵母共同培養(yǎng)后，前體物質(zhì)丁酸的產(chǎn)酸時(shí)間由原來的第96 h變?yōu)榈?8 h，最大己酸產(chǎn)量也由原來的120 h提前為96 h左右。最大己酸產(chǎn)量提高到約7.09 g/L左右。

圖1 克氏梭菌純培養(yǎng)產(chǎn)酸過程曲線Fig.1 Acid yield curve of pure culture

圖2 共培養(yǎng)對(duì)產(chǎn)酸水平的影響Fig.2 Acid yield curve of co-culture

2.3 共培養(yǎng)提高產(chǎn)酸的作用機(jī)制初步分析

為了進(jìn)一步分析混合培養(yǎng)體系提高己酸產(chǎn)量的機(jī)理，作者進(jìn)一步分析了共培養(yǎng)過程中克氏梭菌與釀酒酵母菌數(shù)的變化及整體生物量的關(guān)系。

圖3 共培養(yǎng)對(duì)生物量和菌數(shù)的影響Fig.3 Biomass and microbial content of co-culture

從圖3可以看出，前期由于酵母接種體積分?jǐn)?shù)較大，因此酵母數(shù)量占優(yōu)勢，鏡檢發(fā)現(xiàn)大量圓球狀酵母以及梭狀己酸菌。隨后釀酒酵母菌數(shù)量開始逐步減少，而且前72 h左右數(shù)量迅速遞減，這可以歸結(jié)于釀酒酵母難以利用培養(yǎng)基中碳源。而此時(shí)，己酸菌開始生長，鏡檢結(jié)果顯示到48 h時(shí)能觀察到游動(dòng)的梭狀桿菌，并且數(shù)量逐步增加。此后己酸菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期開始大量增殖，并于120 h左右菌數(shù)達(dá)到最大值，約1.4×108cfu/mL，之后己酸菌進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)酵母已基本趨于穩(wěn)定，鏡檢顯示始終有少量酵母存在發(fā)酵液體系中。這也說明了己酸菌改良培養(yǎng)基不適合酵母菌的生長，但是在共培養(yǎng)的條件下能少量存活，而且外加的酵母對(duì)己酸菌的生長沒有明顯負(fù)面影響。

前期三角瓶實(shí)驗(yàn)已初步驗(yàn)證酵母共培養(yǎng)提高產(chǎn)酸不是由于乙醇和營養(yǎng)物質(zhì)的緣故 （數(shù)據(jù)未提供），我們用發(fā)酵罐在線監(jiān)測手段觀測其發(fā)酵過程的參數(shù)變化，主要包括pH和溶氧值DO的變化，見圖4-5?？梢钥闯觯耸纤缶?022純培養(yǎng)的溶氧值波動(dòng)較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明共培養(yǎng)的溶氧普遍低于純培養(yǎng)時(shí)的值，整個(gè)厭氧環(huán)境的不同很可能導(dǎo)致了產(chǎn)酸和代謝上的差異，這也說明深層發(fā)酵產(chǎn)酸明顯優(yōu)于低裝液量發(fā)酵。無論哪種培養(yǎng)方式，兩種培養(yǎng)方式的pH都呈現(xiàn)較緩慢的下降趨勢，并最終穩(wěn)定在5.9左右，這與在500 mL小三角瓶中的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。

圖4 發(fā)酵罐純培養(yǎng)的溶氧和pH變化曲線Fig.4 DO and pH curve of pure culture

圖5 發(fā)酵罐共培養(yǎng)溶氧和pH變化曲線Fig.5 DO and pH curve of co-cuture

從圖6可以看出，初始乙醇質(zhì)量濃度約為16 g/L，此后因消耗而逐步下降，但是無論純培養(yǎng)還是共培養(yǎng)，乙醇的變化趨勢沒有明顯差異。結(jié)果表明酵母無氧呼吸產(chǎn)生的乙醇不是提高己酸產(chǎn)量的主要因素。圖7表明了底物乙酸的消耗情況。當(dāng)克氏梭菌8022純培養(yǎng)的時(shí)候，乙酸作為底物在前240小時(shí)呈現(xiàn)整體下降中間略有回升的趨勢，這主要?dú)w結(jié)于部分乙醇被氧化為乙酸的緣故?？耸纤缶?022與釀酒酵母共培養(yǎng)時(shí)，乙酸消耗速率和最終向己酸的轉(zhuǎn)化率都有所提高，第80小時(shí)開始乙酸快速消耗轉(zhuǎn)化為丁酸，由此可見厭氧環(huán)境的改善也一定程度促進(jìn)了乙酸的轉(zhuǎn)化率[17]。

圖6 培養(yǎng)方式對(duì)乙醇消耗量的影響Fig.6 Effect of culture mode on ethanol consumption

圖7 培養(yǎng)方式對(duì)乙酸消耗量的影響Fig.7 Effect of culture mode on acetic acid consumption

為了進(jìn)一步明確共培養(yǎng)體系中己酸的合成代謝機(jī)制，我們以發(fā)酵前240小時(shí)底物產(chǎn)物皆基本趨于穩(wěn)定時(shí)為終點(diǎn)，計(jì)算了純培養(yǎng)和共培養(yǎng)條件下，乙醇、乙酸、丁酸、己酸的平均消耗速率[18]和最大值。

從表1可以看出，純培養(yǎng)體系中己酸的合成速率普遍低于共培養(yǎng)的速率。其中，乙酸和丁酸的轉(zhuǎn)化速率有明顯差異，共培養(yǎng)比純培養(yǎng)提高了50%以上，乙醇的轉(zhuǎn)化速率有較小影響，最終的結(jié)果是促進(jìn)了己酸的產(chǎn)生，由原來的6.35 g/L提高到7.09 g/L，產(chǎn)酸速率從 0.60 g/（L·d）提高到 0.69 g/（L·d）。 這說明厭氧環(huán)境對(duì)乙酸轉(zhuǎn)化為丁酸，丁酸轉(zhuǎn)化為己酸這一代謝途徑有比較大的影響，而乙醇不是主要影響因素。

表1 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)產(chǎn)（底）物反應(yīng)速率及峰值Table 1 Reaction rate and peak of product（substrate）when pure colture and co-colture

3 結(jié) 語

克氏梭菌是絕對(duì)厭氧細(xì)菌，在傳統(tǒng)白酒窖池體系中，它是以混合菌種形式存在于窖泥中。傳統(tǒng)白酒很早就提出“以糟養(yǎng)窖、以窖養(yǎng)糟”的說法，其實(shí)質(zhì)就是窖泥中克氏梭菌與酒醅中酵母的協(xié)同作用機(jī)制。作者將克氏梭菌和釀酒酵母共同培養(yǎng)，并通過發(fā)酵罐試驗(yàn)，在線監(jiān)測DO、pH等值，并通過氣相液相色譜離線測定產(chǎn)物底物的質(zhì)量濃度以及混合培養(yǎng)體系生物量的分析，初步證明了酵母對(duì)克氏梭合成己酸的提高機(jī)制：主要是改善了厭氧環(huán)境，促進(jìn)了乙酸及丁酸的轉(zhuǎn)化率，而不是乙醇的轉(zhuǎn)化率，即乙酸到丁酸和丁酸到己酸的代謝途徑通過厭氧環(huán)境的改善得到了強(qiáng)化，最終使己酸的最大產(chǎn)量從6.35 g/L提高到7.09 g/L，提高了11.7%，到達(dá)最大產(chǎn)酸的周期縮短了48 h。本研究為白酒液態(tài)發(fā)酵技術(shù)的改造與提升提供重要的參考依據(jù)。

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Improvement of Caproic Acid Production in the Mixed Culture of Clostridium kluyveri and Saccharomyces cerevisiae

JI Xiang1，2， XU Yan*1，2， MU Xiaoqing1，2， GE Xiangyang1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to enhance the caproicacid productionof Clostridium kluyveri and shorten thefermentation period，this strain was co-colturedwith Saccharomyces cerevisiae and themechanism of enhancing caproic acid production in the mixed culture system was furtherly analyzed.Studies have revealed that：caproicacid yieldin the fermentation tank with pure colture of Clostridium kluyveri reached 6.35 g/L.However，caproic acid production with co-cultured system reached 7.09 g/L，which was 12.5%higher than that of the pure culture system and thetime reaching peak of caproic acid production was shortenedfor approximately 48 h.Relative data indicated that when co-culture wit Saccharomyces cerevisiae，thecaproic acid production of Clostridium kluyveriwas improved byincreasing the conversion rate of acetic acid to butyric acid.Analysis of dissolved oxygen values and microbial growth parameters indicated that the main reason for this change was that the growth of Saccharomyces cerevisiae improved the anaerobiclevel of co-culture system，whichpromoted the formation and transformation of butyric acid，hence the caproic acid production was enhanced.

Clostridium kluyveri，Saccharomycescerevisiae，purecolture co-culture，caproic acid

TS 261.1

A

1673—1689（2017）09—0922—05

2015-02-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31530055）。

*通信作者：徐 巖（1962—），男，浙江慈溪人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事釀造微生物學(xué)與工業(yè)酶學(xué)方面的研究。E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn

嵇翔，徐巖，穆曉清，等.克氏梭菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)提高己酸產(chǎn)量[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（09）：922-926.