巴氏法聯(lián)合高滲鹽水對(duì)骨與軟組織惡性腫瘤體外滅活研究

高興，顧慶陟，陶開亮，樊雪鵬，李承鐸，李寶劍，李冬，田征*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，新疆 烏魯木齊 830054；3.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154000)

實(shí)驗(yàn)研究

巴氏法聯(lián)合高滲鹽水對(duì)骨與軟組織惡性腫瘤體外滅活研究

高興1，2，顧慶陟1，2，陶開亮1，2，樊雪鵬1，2，李承鐸1，2，李寶劍1，李冬3，田征1，2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，新疆 烏魯木齊 830054；3.佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154000)

目的探討20%高滲鹽水對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的滅活作用及溫度、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，為臨床骨與軟組織惡性腫瘤進(jìn)行自體骨滅活再植保肢手術(shù)提供指導(dǎo)。方法選取四肢及骨盆術(shù)前活檢確診為骨與軟組織惡性腫瘤患者24例，去除4例不符合條件病例，分三組分別在0.9%鹽水、20%高滲鹽水、巴氏法聯(lián)合高滲鹽水處理(15 min、30 min、45 min)，采用光鏡、透射電鏡觀察并計(jì)算腫瘤細(xì)胞滅活率。結(jié)果20%高滲鹽水及巴氏法聯(lián)合法各時(shí)間點(diǎn)腫瘤細(xì)胞滅活較0.9%等滲鹽水存在明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；巴氏聯(lián)合法15 min優(yōu)于20%高滲鹽水組(P<0.01)。結(jié)論20%高滲鹽水滅瘤作用確切，聯(lián)合巴氏法或增加滅瘤時(shí)間能明顯增加腫瘤細(xì)胞壞死率，增加滅瘤時(shí)間至30min以上滅瘤效果達(dá)到最佳。

高滲鹽水；惡性骨腫瘤；滅活；凋亡；骨肉瘤

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集2016年1月至2017年5月我科手術(shù)患者離體腫瘤標(biāo)本24份，骨肉瘤12例，軟骨肉瘤5例，轉(zhuǎn)移癌6例，黏液炎性纖維母細(xì)胞肉瘤1例，女13例，男11例；年齡6～78歲。術(shù)前均經(jīng)病理確診，12例骨肉瘤8例術(shù)前行新輔助化療治療，4例患者化療后切除腫瘤后測(cè)得腫瘤壞死率大于5%，予以剔除，其余病例納入實(shí)驗(yàn)，1例軟骨肉瘤行術(shù)前化療，余術(shù)前未接受化療。

1.1.2 儀器與制劑 JEM-1230透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)，萊卡顯微鏡、萊卡病理組織脫水機(jī)、萊卡石蠟包埋機(jī)、萊卡切片機(jī)、病理圖像采集系統(tǒng)(徠卡微系統(tǒng)有限公司)，水浴箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，伊紅染液、蘇木素染液(北京索萊寶科技有限公司)，EDTA(武漢市蓋云天生物技術(shù)有限公司)20%高滲鹽水(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科)等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)記 每實(shí)驗(yàn)病例準(zhǔn)備10個(gè)標(biāo)本盒，標(biāo)注未處理空白參照一個(gè)；常溫0.9%等滲生理鹽水15 min、30 min、45 min時(shí)間段各一個(gè)標(biāo)記；常溫20%高滲鹽水15 min、30 min、45 min時(shí)間段各一個(gè)標(biāo)記；65℃ 20%高滲鹽水15 min、30 min、45 min時(shí)間段各一個(gè)標(biāo)記。

1.2.2 采集處理組織 在腫瘤組織離體后將腫瘤沿最大縱徑拋開，結(jié)合影像學(xué)及肉眼觀察，選取無壞死組織層面，沿腫瘤同一層面將組織塊分成大小約1 cm×1 cm×1 cm 10份，沖洗組織塊，將1塊組織立即固定，其余9塊分3份分別放入常溫0.9%生理鹽水、常溫20%高滲鹽水、65℃ 20%高滲鹽水恒溫箱內(nèi)分別計(jì)時(shí)至15 min、30 min、45 min，處理后分別放入4%中性甲醛溶液內(nèi)固定，0.9%生理鹽水各時(shí)間點(diǎn)為空白對(duì)照組，甲醛立即固定組織作為生理鹽水組的參考標(biāo)本。

1.2.3 制作病理切片 將不同處理因素下腫瘤組織充分固定后，骨組織經(jīng)EDTA脫鈣液脫鈣[7]分別將組織脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色等制成病理切片。

1.2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征[8]，細(xì)胞膜破裂，核濃縮、核碎裂、核溶解、胞漿嗜酸性染色加深的細(xì)胞表明已壞死，不納入計(jì)數(shù)；形態(tài)正常、細(xì)胞核和細(xì)胞膜完整的細(xì)胞納入計(jì)數(shù)。每張玻片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野(放大400倍)，取其平均值。

1.2.5 滅活率計(jì)算方法[9]單個(gè)標(biāo)本各時(shí)間點(diǎn)滅活率=(每高倍視野下生理鹽水對(duì)照中的腫瘤細(xì)胞數(shù)一每高倍視野下不同溫度下高滲鹽水各時(shí)間點(diǎn)的腫瘤細(xì)胞數(shù))/每高倍視野下生理鹽水對(duì)照中的腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將20例腫瘤標(biāo)本鏡下觀察數(shù)據(jù)輸入SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，用中位數(shù)、百分位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)類型為成組設(shè)計(jì)，各時(shí)間點(diǎn)滅活率組間比較采用Kruskal Wallis秩和經(jīng)驗(yàn)，兩兩比較用Bonferroni校正法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 滅活骨及軟組織腫瘤HE染色光鏡下觀察 納入標(biāo)本滿視野細(xì)胞壞死率小于等于2%，生理鹽水各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組壞死率無明顯增多，常溫20%高滲鹽15 min，細(xì)胞體積縮小，外圍常見一圍繞細(xì)胞環(huán)狀空白區(qū)，細(xì)胞核及染色質(zhì)濃聚，以核濃縮及裸核為主。30 min，腫瘤壞死為胞核濃縮，胞漿嗜酸性變內(nèi)部胞核濃縮進(jìn)一步增強(qiáng)，核碎裂及核溶解細(xì)胞占比增多。45 min，細(xì)胞壞死仍以核濃縮為主，胞漿嗜酸性進(jìn)一步增強(qiáng)，常可見小于3%片狀無法辨別的伊紅樣嗜酸性染色結(jié)構(gòu)。巴氏法聯(lián)合15 min，腫瘤細(xì)胞仍以核濃縮壞死為主，核染色質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)，可見5%腫瘤壞死呈片狀嗜酸性紅染樣溶解。30 min，細(xì)胞壞死以核濃縮及核碎裂為主，核碎裂及核溶解較15 min時(shí)進(jìn)一步增多。胞漿呈強(qiáng)嗜酸性改變并出現(xiàn)空泡樣改變，片狀無結(jié)構(gòu)壞死進(jìn)一步增多，45 min，細(xì)胞壞死以核濃縮及核碎裂為主，核碎裂及核溶解較30 min時(shí)增多，部分細(xì)胞于核濃縮細(xì)胞內(nèi)可見白色空泡樣變化(見圖1)。

2.2 電鏡下表現(xiàn) 滅活骨及軟組織腫瘤電鏡下表現(xiàn)：常溫下生理鹽水組30 min細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核染色質(zhì)均勻分布，未見明顯溶解破壞，腫瘤細(xì)胞未見明顯壞死。常溫下20%高滲鹽水30 min細(xì)胞基質(zhì)水腫明顯，可見空泡樣變，線粒體明顯腫脹、峭溶解明顯，腫瘤細(xì)胞壞死徹底。65℃ 20%高滲鹽30 min細(xì)胞核染色質(zhì)明顯溶解，細(xì)胞核異染色質(zhì)增生，分布在核膜周圍和核中央?yún)^(qū)域，腫瘤細(xì)胞壞死徹底(見圖2)。

2.3 各組腫瘤壞死率 20份腫瘤標(biāo)本0.9%生理鹽水15 min、30 min、45 min滅活率小于2%，常溫下20%高滲鹽15 min滅活率82.77%，30 min、45 min滅活率100%，巴氏法聯(lián)合組，15 min滅活率92.03%，30 min、45 min滅活率100%(見表1)。

3 討 論

高滲鹽滅活機(jī)制是使腫瘤細(xì)胞極度脫水，造成腫瘤細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂、代謝障礙，使腫瘤細(xì)胞不可逆性損害而死亡。對(duì)于滅活骨而言，20%的高滲鹽水不會(huì)使滅活骨深部骨基質(zhì)中的蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)變性，鹽離子在溶液中是高度移動(dòng)的。根據(jù)霍夫邁斯特效應(yīng)，高濃度的鹽可能會(huì)保護(hù)靜電相互作用的蛋白質(zhì)，從而進(jìn)一步改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和它們的熱穩(wěn)定性[10-11]。高滲鹽水被廣泛地用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑和沉淀劑在生物化學(xué)與分子生物學(xué)；所以我們選擇使用高滲鹽水代替生理鹽水作為失活劑在滅瘤同時(shí)更好地保護(hù)蛋白質(zhì)活性。20%的高滲鹽水是臨床使用最佳濃度。高濃度的氯化鈉是一種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑而不是蛋白變性劑[10]，這樣滅活骨內(nèi)參與骨骼重建的細(xì)胞因子及骨誘導(dǎo)蛋白得以保留，斷端骨愈合不僅依靠骨傳導(dǎo)作用，而且還需要骨誘導(dǎo)作用。滅活骨作為“支架”，可激活間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因的表達(dá)，合成并分泌內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白，且呈現(xiàn)出一定階段性，誘導(dǎo)滅活骨周圍肌肉及間充質(zhì)細(xì)胞形成外生骨痂，促進(jìn)修復(fù)愈合，隨著骨傳導(dǎo)不斷進(jìn)行，宿主骨與滅活骨連接界面愈合，逐漸向骨段中間發(fā)展，最終完成骨性連接。

a 0.9%生理鹽水15 min b 0.9%生理鹽水30 min c 0.9%生理鹽水45 min

d 常溫20%高滲鹽15 min e 常溫20%高滲鹽30 min f 常溫20%高滲鹽45 min

g 巴氏聯(lián)合法15 min h 巴氏聯(lián)合法30 min i 巴氏聯(lián)合法45 min

a 常溫等滲鹽水30 min b 常溫20%高滲鹽30 min c 65℃ 20%高滲鹽30 min

圖2 各組處理后電鏡下形態(tài)改變(電鏡，×15 000)

高滲鹽水滅活再植的斷端愈合及力學(xué)強(qiáng)度研究，彭長(zhǎng)亮等[4]在動(dòng)物模型上，用20%高滲鹽水浸泡離體兔尺骨20 min進(jìn)行回植后，行X線、三點(diǎn)彎曲負(fù)荷實(shí)驗(yàn)，再植后3周即可見其近段有骨痂形成，骨外膜側(cè)有直接骨形成；6周時(shí)HE染色顯示骨基質(zhì)內(nèi)可見成堆的幼稚軟骨細(xì)胞增生，骨化而逐漸成骨，即為軟骨化骨。24周已接近正常骨；三點(diǎn)彎曲負(fù)荷實(shí)驗(yàn)力學(xué)測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6、12周生理鹽水對(duì)照側(cè)三點(diǎn)彎曲載荷明顯高于滅活骨，24周兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

滅活再植是一種理想的解決腫瘤切除后大段骨缺損的方法，瘤骨滅活再植的生物重建具有價(jià)格低廉、斷端骨愈合能力良好、恢復(fù)解剖重建等優(yōu)點(diǎn)，但滅活技術(shù)必須在徹底殺滅骨內(nèi)腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，盡可能保留殘存骨力學(xué)強(qiáng)度、再生活性。術(shù)后復(fù)發(fā)及滅活骨出現(xiàn)骨折是亟需解決的問題。國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道液氮冷凍[8]、高溫蒸氣[12]、無水乙醇[13]、輻照滅活、巴氏法[3，6]等，均保證了足夠的腫瘤壞死率，但上述滅活方法中液氮、高溫等方法在滅瘤的同時(shí)嚴(yán)重破壞了骨的力學(xué)強(qiáng)度，術(shù)后骨折發(fā)生率高達(dá)20%～50%。我國(guó)常用的乙醇在骨的滅活中往往不易徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，回植后局部復(fù)發(fā)率高，應(yīng)用于骨肉瘤患者局部復(fù)發(fā)率可達(dá)20%以上，因而近年來已較少使用。實(shí)驗(yàn)證明，骨組織用95%的乙醇浸泡20 min，只有薄層外側(cè)和髓腔皮層被侵及而被滅活，深部的腫瘤細(xì)胞只是被一層死骨殼緊緊包裹，與外界隔絕。乙醇滅活的缺點(diǎn)是滲透性差，滅活不徹底，局部復(fù)發(fā)率高達(dá)20%以上。與乙醇相比，高滲鹽水對(duì)骨的滲透性極強(qiáng)，能夠滲透到腫瘤的深部，從而保證殺死全部腫瘤細(xì)胞，且可以保留滅活骨骨基質(zhì)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其他成骨誘導(dǎo)細(xì)胞因子，這些成骨誘導(dǎo)因子就能發(fā)揮作用誘導(dǎo)成骨，這為以后骨骼重建創(chuàng)造了比較有利的條件。高滲鹽水也廣泛應(yīng)用于肝癌、包蟲病、淋巴瘤等治療，王俊江等[14]報(bào)道應(yīng)用10%～20%高滲鹽聯(lián)合0.125%冰醋酸對(duì)肺包蟲囊內(nèi)原頭蚴作用5 min即有損害作用，10 min損害更加嚴(yán)重，伊紅染色100%壞死，Sun等[15]從病理HE染色證實(shí)射頻聯(lián)合高滲鹽水對(duì)兔子肝臟腫瘤滅活效果確切，Bikowski等[16]應(yīng)用23.4%的高滲鹽水于局限性淋巴瘤患者，注射后患者癥狀明顯緩解，以局部色素沉著為最小副作用為代價(jià)，Gennar等[17-18]報(bào)道應(yīng)用20%高滲鹽水于脊柱骨包蟲的輔助治療取得了滿意的效果，高滲鹽水廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療且獲得滿意效果，文獻(xiàn)中對(duì)高滲鹽水的濃度、時(shí)間、溫度報(bào)道不盡相同，郭衛(wèi)等[2-4]報(bào)道應(yīng)用10%～20%高滲鹽水浸泡20 min、30 min、45 min滅瘤均取得滿意的結(jié)果，文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)滅活時(shí)間多在30 min，在較為廣泛臨床應(yīng)用的同時(shí)文獻(xiàn)中鮮有對(duì)腫瘤滅活時(shí)間相關(guān)的基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)研究報(bào)道，在我們的研究中常溫20%高滲鹽水15 min時(shí)不能完全對(duì)腫瘤細(xì)胞完全滅活，達(dá)到30 min后才可徹底滅活瘤骨，有學(xué)者也報(bào)道當(dāng)高滲鹽水成為腫瘤單一滅活因素時(shí)腫瘤壞死不徹底容易復(fù)發(fā)[5]，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道高滲鹽聯(lián)合20%巴氏法滅活效果更徹底[2，6]，且巴氏法具有對(duì)骨力學(xué)性能達(dá)到最少滅活影響。

巴氏法對(duì)骨相關(guān)惡性腫瘤的滅活是一種行之有效的方法。在此基礎(chǔ)上，一些研究已經(jīng)完成對(duì)這些骨愈合相關(guān)蛋白在滅活骨的活動(dòng)。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白在骨的成骨活性可以得到一定的保留在巴氏法中[19]，這可能會(huì)促進(jìn)骨折愈合時(shí)的成骨。臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，加熱是一種有效的殺滅腫瘤細(xì)胞的方法。Qu等[6]學(xué)者研究65℃ 20%高滲鹽應(yīng)用于27例骨惡性腫瘤30 min后平均隨訪時(shí)間62.8個(gè)月數(shù)據(jù)對(duì)比單純巴氏法、放射、高溫、同種異體骨在骨斷端不愈合率、平均骨愈合時(shí)間、深部感染率、骨折發(fā)生率均優(yōu)于其他滅瘤方法，此滅瘤方法正是巴氏法聯(lián)合高滲鹽的滅瘤方法。

為獲得高滲鹽水最佳滅瘤時(shí)間和效果，做了上述實(shí)驗(yàn)研究，認(rèn)為20%高滲鹽水15 min時(shí)不能完全對(duì)腫瘤細(xì)胞完全滅活，聯(lián)合巴氏法對(duì)腫瘤細(xì)胞滅活明顯增強(qiáng)，但仍然不能達(dá)到最佳滅瘤效果，30 min及以上時(shí)滅活均可以達(dá)到滿意滅瘤效果，但聯(lián)合巴氏法滅瘤效果更加確切，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷更加徹底，聯(lián)合巴氏法15 min，腫瘤細(xì)胞仍以核濃縮壞死為主，核染色質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)，可見5%腫瘤壞死呈片狀嗜酸性紅染樣溶解。30 min、45 min，細(xì)胞壞死以核濃縮及核碎裂為主，核碎裂及核溶解較15 min時(shí)明顯增多。胞漿內(nèi)可見大量氣泡樣變性，且無結(jié)構(gòu)樣片狀壞死明顯增多，進(jìn)一步在電鏡下對(duì)細(xì)胞壞死進(jìn)行驗(yàn)證，細(xì)胞核染色質(zhì)明顯溶解，細(xì)胞質(zhì)明顯腫脹，線粒體腫脹呈氣球樣變，得出腫瘤細(xì)胞壞死徹底。

本研究也存在一些不足之處：a)標(biāo)本納入量較少，由于骨與軟組織腫瘤發(fā)病率較低，百萬基數(shù)中可能病發(fā)幾例患者，發(fā)病率低給實(shí)驗(yàn)造成了困難。b)納入疾病種類不一，在對(duì)骨與軟組織腫瘤高滲鹽水研究過程中，發(fā)病率低致使很難收集單一腫瘤進(jìn)行研究，各種腫瘤細(xì)胞可能對(duì)高滲鹽水的生存抵抗存在著差異，對(duì)這種差異在混合病種研究中不能發(fā)現(xiàn)。c)研究時(shí)間跨度較大，考慮到巴氏法滅菌是60～65℃加熱30 min才能達(dá)到聯(lián)合作用，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了時(shí)間15 min、30 min、45 min 3個(gè)時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)得出30 min即可達(dá)到理想效果，在縮短滅活時(shí)間至20 min時(shí)可能也會(huì)達(dá)到相同效果，今后我們會(huì)針對(duì)上述不足繼續(xù)改進(jìn)收集較多病理標(biāo)本，精準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間繼續(xù)探索研究。

滅活瘤骨移植具有廉價(jià)、解剖重建、力學(xué)性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)可以作為一個(gè)良好的選擇，20%高滲鹽30 min及以上對(duì)離體骨與軟組織惡性腫瘤可以完全滅活，聯(lián)合巴氏法可使瘤細(xì)胞滅活更徹底，20%高滲鹽是一種良好及有效的滅活再植方法。良好的滅瘤結(jié)果和可接受的并發(fā)癥發(fā)生率使它成為一個(gè)合適的替代金屬假體修復(fù)節(jié)段性骨缺損的方法。未來隨著高滲鹽水的研究更加深入，高滲鹽水可能廣范應(yīng)用于骨與軟組織惡性腫瘤滅活再植治療中，同時(shí)也可用于骨巨細(xì)胞瘤等良性腫瘤的輔助治療，高滲鹽水安全、易得、價(jià)廉，在各層次醫(yī)院均較易獲得，為我國(guó)廣大基層醫(yī)院治療骨與軟組織良惡性腫瘤提供更多的治療選擇。

[1]康曉征，閆萬璞，楊永波，等.骨與軟組織肉瘤肺轉(zhuǎn)移的單中心大樣本外科治療結(jié)果及預(yù)后分析[J].中國(guó)肺癌雜志，2016，19(5)：299-306.

[2]郭衛(wèi)，楊榮利，湯小東，等.復(fù)合移植重建惡性骨腫瘤切除后骨缺損[J].中華骨科雜志，2003，23(4)：13-16.

[3]楊毅，郭衛(wèi)，楊榮利，等.腫瘤骨滅活再植重建骨盆腫瘤切除后骨缺損的臨床研究[J].中華外科雜志，2014，52(10)：754-759.

[4]彭長(zhǎng)亮，楊毅，孫馨，等.高滲鹽水滅活自體骨再植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，44(6)：950-953.

[5]彭秋平，汪森明，張積仁.高滲鹽水注射提高對(duì)小鼠肝癌冷凍療效的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代診斷與治療，2002，1(1)：14-16.

[6]Qu H，Guo W，Yang R，et al.Reconstruction of segmental bone defect of long bones after tumor resection by devitalized tumor-bearing bone[J].World J Surg Oncol，2015，13(1)：282.

[7]趙雨坤，鄭康，郭晴晴，等.一種基于EDTA脫鈣法的改良骨組織脫鈣方法[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22(11)：17-19.

[8]劉斌.深低溫冷凍滅活技術(shù)在骨肉瘤保肢治療中的應(yīng)用及進(jìn)展[J].中國(guó)癌癥防治雜志，2016，8(1)：66-68.

[9]張劍英，周滋霞，顧則娟，等.無水乙醇滅活體外腫瘤細(xì)胞的時(shí)間效應(yīng)研究[J].中華護(hù)理雜志，2012，47(4)：339-340.

[10]MT Record，Jr W Zhang，CF Anderson.Analysis of effects of salts and uncharged solutes on protein and nucleic acid equilibria and processes：a practical guide to recognizing and interpreting polyelectrolyte effects，hofmeister effects，and osmotic effects of salts[J].Adv Protein Chem，1998(51)：281-353.

[11]DL Beauchamp，M Khajehpour.Studying salt effects on protein stability using ribonuclease T1as a model system[J].Biophys Chem，2012(161)：29-38.

[12]陳秉耀，韋興，李南，等.微波消融治療下肢長(zhǎng)骨骨肉瘤15例隨訪報(bào)告[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志，2014，12(4)：272-276.

[13]許宋鋒，劉江，聶鑫，等.酒精滅活瘤段骨在重建惡性骨腫瘤骨缺損中的應(yīng)用[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)雜志，2015，4(5)：354-360.

[14]王俊江，田征.高滲鹽水在惡性骨腫瘤治療中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2016，96(11)：910-912.

[15]Sun YX，Cheng W，Han X，et al.In vivo experimental study on the effects of fluid in increasing the efficiency of radiofrequency ablation[J].Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(14)：5799-5804.

[16]Bikowski JB，Dumont AM.Lymphangioma circumscriptum：treatment with hypertonic saline sclerotherapy[J].J Am Acad Dermatol，2005，53(3)：442-444.

[17]Gennari A，Almairac F，Litrico S，et al.Spinal cord compression due to a primary vertebral hydatid disease：a rare case report in metropolitan france and a literature review[J].Neurochirurgie，2016，62(4)：226-228.

[18]Togral G，Arikan SM，Ekiz T，et al.Musculoskeletal hydatid cysts resembling tumors：a report of five cases[J].Orthop Surg，2016，8(2)：246-252.

[19]Takata M，Sugimoto N，Yamamoto N，et al.Activity of bone morphogenetic protein-7 after treatment at varioustemperatures：freezing vs.pasteurization vs.allograft[J].Cryobiology，2011，63(3)：235-239.

InVitroInactivationoftheMalignantTumorsofBoneandSoftTissuebyPasteurizationCombinedwithHypertonicSaline

Gao Xing1，2，Gu Qingzhi1，2，Tao Kailiang1，2，et al

(1.Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

ObjectiveTo study the effect of 20% hypertonic saline on the in vitro inactivation of tumor cells and its relationships with temperature and time，and to provide guidance for the inactivation of autologous bone and limb salvage operation in the treatment of clinical malignant tumors of bone and soft tissue.Methods24 patients who were diagnosed with malignant tumors of bone and soft tissue according to the biopsy of limbs and pelvis before operation were chosen，and 4 patients who didn’t meet the requirement were removed.The samples were treated with 0.9% saline，20% hypertonic saline，and pasteurization treatment combined with hypertonic saline (15，30，45 min) and were observed by optical microscope，transmission electron microscope.The inactivation rate of the tumor cells were calculated.ResultsInactivated tumor cells at 20% hypertonic saline and pasteurization combined with hypertonic saline at each time were obviously different compared with 0.9% isotonic saline，and the difference was statistically significant (P<0.01).The effect of inactivating of 15 min pasteurization combined with hypertonic saline was better than 20% hypertonic saline group (P<0.01).ConclusionThe effect of 20% hypertonic saline on tumor elimination is reliable，and combining with pasteurization or increasing the time of killing tumor cells can obviously increase the necrosis rate of tumor cells.The time of killing tumor cells is more than 30 min，and the effect of killing tumor will be best.

hypertonic saline；malignant bone tumor；inactivation；apoptosis；osteosarcoma

1008-5572(2017)10-0899-05

R738.6

A

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014211C034)；*本文通訊作者：田征

高興，顧慶陟，陶開亮，等.巴氏法聯(lián)合高滲鹽水對(duì)骨與軟組織惡性腫瘤體外滅活研究[J].實(shí)用骨科雜志，2017，23(10)：899-903.

2017-07-17

高興(1990- )，男，研究生在讀，新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，830054。

骨與軟組織肉瘤屬于罕見疾病[1]，僅占成人所有癌種的0.2%，以兒童及青少年發(fā)病居多，新輔助化療及Enneking外科分期概念的推廣，保肢手術(shù)已成為治療惡性骨與軟組織腫瘤的經(jīng)典術(shù)式。保肢手術(shù)有人工假體置換、同種異體骨移植、自體骨滅活再植等方法，人工假體價(jià)格昂貴，同種異體骨因我國(guó)缺乏大型骨庫且供體較少，常不能實(shí)現(xiàn)，自體骨滅活再植相對(duì)廉價(jià)、且無免疫排斥等問題，是一種重要的重建術(shù)式，滅瘤方法主要有：高壓蒸氣、液氮、輻照或無水乙醇、高滲鹽水化學(xué)滅活后植回原位，然后輔助內(nèi)固定裝置達(dá)到解剖上的重建，高滲鹽水有著操作方便、使用安全、滅活后對(duì)移植骨的力學(xué)強(qiáng)度影響較小等特點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)高滲鹽水的臨床應(yīng)用研究較為廣泛，多數(shù)研究集中在包蟲病的輔助滅活，肝、腎、淋巴等實(shí)體腫瘤的注射滅瘤，均取得了較為滿意效果。高滲鹽水在骨與軟組織惡性腫瘤治療中應(yīng)用較少，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)高滲鹽的研究自2000年起主要以北京大學(xué)人民醫(yī)院骨與軟組織腫瘤治療中心郭衛(wèi)等[2-4]報(bào)道10%～20%高滲鹽浸泡離體負(fù)瘤骨行滅活再植，高滲鹽水應(yīng)用時(shí)間在10～30 min之間滅瘤均取得滿意的效果，國(guó)外學(xué)者對(duì)高滲鹽水在骨與軟組織惡性腫瘤鮮有報(bào)道，目前研究者對(duì)高滲鹽水在骨與軟組織滅瘤再植的滅活時(shí)間尚沒有定論，臨床應(yīng)用多集中在30 min，尚缺乏高滲鹽水滅瘤后時(shí)間因素腫瘤壞死率的基礎(chǔ)研究，為獲得高滲鹽水最佳滅活時(shí)間及對(duì)細(xì)胞壞死形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)研究，本研究針對(duì)不同時(shí)間20%高滲鹽水進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，希望為臨床骨與軟組織腫瘤離體滅活再植縮短手術(shù)時(shí)間，避免因長(zhǎng)時(shí)間手術(shù)增加相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生率，提供有力理論依據(jù)，同時(shí)有學(xué)者報(bào)道當(dāng)高滲鹽水成為腫瘤單一的滅活因素時(shí)腫瘤壞死不徹底容易復(fù)發(fā)[5]，有學(xué)者提出增加溫度至65℃成為聯(lián)合巴氏法滅瘤方法，效果將進(jìn)一步增強(qiáng)[3，6]，但兩種方法均缺少基礎(chǔ)研究的報(bào)道，為探究20%高滲鹽水是否滅瘤效果確切且聯(lián)合巴氏法進(jìn)一步增強(qiáng)滅瘤效果，特進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。