清肺方對(duì)結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺炎模型大鼠抗纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究

錢(qián)康 范永升

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

清肺方對(duì)結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺炎模型大鼠抗纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究

錢(qián)康1范永升2

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

[目的]通過(guò)博來(lái)霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)建立結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺炎大鼠模型，探討清肺方對(duì)間質(zhì)性肺炎大鼠的抗纖維化作用。[方法]清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性,體質(zhì)量為180～200g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為正常對(duì)照組、間質(zhì)性肺炎模型組、強(qiáng)的松組和清肺方組，每組12只。除正常對(duì)照組外，其余各組通過(guò)氣管內(nèi)灌注5mg·kg-1BLM誘導(dǎo)建立大鼠間質(zhì)性肺炎動(dòng)物模型。用藥28d后，對(duì)比清肺方組與間質(zhì)性肺炎模型組、強(qiáng)的松組、正常對(duì)照組之間的肺組織染色及纖維化評(píng)分，檢測(cè)肺組織羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）含量、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor,TGF-β1）。[結(jié)果]①病理染色發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組比較，間質(zhì)性肺炎模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大塊的纖維組織增生實(shí)變，肺泡腔內(nèi)分布膠原纖維病灶；與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組大鼠肺組織損害減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，纖維組織增生減少，膠原相對(duì)面積較模型組明顯減少。②與正常對(duì)照組比較，各模型組大鼠肺組織HYP含量明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與間質(zhì)性肺炎模型組相比，清肺方組大鼠肺組織HYP含量明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。③與正常對(duì)照組比較，各模型組大鼠肺組織勻漿TNF-α、IL-6、TGF-β1濃度明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組大鼠肺組織勻漿TNF-α、IL-6、TGF-β1濃度明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。[結(jié)論]1.清肺方對(duì)BLM誘導(dǎo)的大鼠間質(zhì)性肺炎、肺纖維化有抑制作用。2.清肺方對(duì)BLM誘導(dǎo)的大鼠間質(zhì)性肺炎的抑制作用機(jī)制可能與TNF-α、IL-6、TGF-β1有關(guān)。

清肺方；結(jié)締組織病；間質(zhì)性肺炎；抗纖維化；HYP；TNF-α；TGF-β1；IL-6

結(jié)締組織疾病（connective tissue disease,CTD）是以機(jī)體針對(duì)自身抗原產(chǎn)生多種自身抗體或致敏淋巴細(xì)胞，通過(guò)各種途徑引起機(jī)體組織損傷或功能異常的一類自身免疫性疾病。不同類型的結(jié)締組織疾病累及組織或器官的數(shù)量和損傷程度不盡相同，但幾乎均可累及呼吸系統(tǒng)。其中，合并間質(zhì)性肺炎(interstitial lung disease,ILD)是影響CTD預(yù)后、增加死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素[1]。近年，隨著基礎(chǔ)研究的深入與臨床檢查水平的不斷提高，結(jié)締組織疾病伴發(fā)間質(zhì)性肺炎(connective tissue disease-interstitial lung disease, CTD-ILD)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，晚期則表現(xiàn)為彌漫性肺間質(zhì)纖維化引起以低氧血癥為主的呼吸衰竭癥狀。CTD患者合并ILD發(fā)病隱匿，機(jī)制復(fù)雜，晚期糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑效果較差，相對(duì)特發(fā)性間質(zhì)性肺炎預(yù)后較差。因此，對(duì)于結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺炎的診治研究就具有非常重要的意義。同時(shí)，在對(duì)該病治療的實(shí)驗(yàn)研究中，動(dòng)物模型的選擇至關(guān)重要。有研究表明，結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺疾病最常見(jiàn)的病理類型是普通型間質(zhì)性肺炎（usual interstitial pneumonitis，UIP）[2-3]，因而在動(dòng)物造模中常參考UIP的動(dòng)物模型進(jìn)行研究。在前期研究中，研究組研究了多種建立間質(zhì)性肺炎動(dòng)物模型的方法，并發(fā)現(xiàn)向大鼠氣管內(nèi)灌注博來(lái)霉素（bleomycin，BLM）的方法能夠成功建立間質(zhì)性肺炎動(dòng)物模型[4]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比清肺方組與間質(zhì)性肺炎模型組的肺組織病理及肺組織羥脯氨酸（hydroxyproline, HYP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor,TGF-β1）等變化，研究清肺方對(duì)大鼠間質(zhì)性肺炎抗纖維化的作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量160～180g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2016-0115。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法抽出12只為正常對(duì)照組，其余大鼠用BLM造模后，按照隨機(jī)數(shù)字表法，將動(dòng)物隨機(jī)分為間質(zhì)性肺炎模型組、強(qiáng)的松對(duì)照組、清肺方組，每組各12只。經(jīng)單因素方差檢驗(yàn)分析，各組大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑藥品 清肺方由太子參12g、沙參15g、麥冬15g、冬瓜子15g、山慈菇30g、浙貝母12g、僵蠶10g、石見(jiàn)穿15g、蘆根15g、蒲公英30g組成，所含中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第一醫(yī)院中藥房提供，并由藥劑室將上述中藥加8～10倍純水浸泡30min，武火煎開(kāi)后，再文火煎煮30min，過(guò)濾，剩余藥渣加入3～5倍純水再次煎25min，藥液過(guò)濾后取過(guò)濾液，將2次過(guò)濾液濃縮成含生藥濃度為1.6g·mL-1的溶液，分裝滅菌，-20℃保存?zhèn)溆?。鹽酸博來(lái)霉素，日本化藥株式會(huì)社，批號(hào)：H20090885；強(qiáng)的松，西安利君沙制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：090302；HYP測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，產(chǎn)品編號(hào)A030-2；Masson染色試劑盒，購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：PT003；10%水合氯醛，批號(hào)：浙藥制字H020100240，浙江中醫(yī)藥大學(xué)校附屬醫(yī)院提供；TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)：ab100747），IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)：ab100722），TGF-β1ELISA試劑盒（批號(hào)：ab119557）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 造模方法 大鼠按 0.35mL·100g-1劑量腹腔注射 10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，取頸前正中切口，切開(kāi)皮膚，逐層分離暴露氣管，氣管插管后，按5mg·kg-1劑量向套管針內(nèi)緩慢注入濃度為3mg·mL-1的BLM溶液，正常對(duì)照組氣管內(nèi)灌注同等體積的生理鹽水，迅速直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻分布于兩肺，縫合創(chuàng)口，動(dòng)物清醒后常規(guī)喂養(yǎng)。造模24h后每組隨機(jī)取1只大鼠進(jìn)行肺組織病理切片，出現(xiàn)肺間質(zhì)病變改變，則造模成功。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥方法 造模成功24h后開(kāi)始灌胃，按照人與動(dòng)物體表面積換算方法換算，清肺方濃度為1.6g·mL-1，大鼠1mL·100g-1/d體質(zhì)量進(jìn)行灌胃。強(qiáng)的松組將藥物稀釋為每mL含強(qiáng)的松含量0.6mg的混懸液，每只大鼠的給藥劑量均為1mL·100g-1體質(zhì)量；正常對(duì)照組與間質(zhì)性肺炎模型組則均給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠均連續(xù)灌胃28d，2次/d。

1.5 取材及病理標(biāo)本制作 造模后連續(xù)灌胃給藥28d，末次給藥后禁食不禁水。末次給藥后24h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，劑量為0.35mL· 100g-1體質(zhì)量。麻醉后，大鼠心尖部取血，離心分離血清，置于-80℃冰箱保存，以備后續(xù)檢測(cè)。沿氣管打開(kāi)胸腔，暴露肺組織，切除雙肺。10%中性甲醛固定后送病理。左肺剪成30mg大小組織塊，準(zhǔn)備HYP測(cè)定。右肺置于-80℃冰箱保存，準(zhǔn)備病理切片染色。

1.6 肺組織HYP測(cè)定 HYP的測(cè)定按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。簡(jiǎn)而言之，取60mg肺組織，加入1mL水解液在100℃裂解20min，用活性炭吸附有色雜質(zhì)后，離心，取上清1mL，依次加入試劑1、2、3,充分反應(yīng)后，取上清lmL在550nm處測(cè)光密度（optical density，OD）。

1.7 肺組織TGF-β1、IL-6及TNF-α濃度的測(cè)定肺組織勻漿TGF-β1、IL-6及TNF-α濃度的測(cè)定按照Abcam公司試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作步驟操作。測(cè)量450nm及630nm波長(zhǎng)處各個(gè)孔的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔的OD值及濃度，使用Curve Expert1.3擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得公式，代入各樣品孔的OD值，計(jì)算濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，求得樣本濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性，符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊性時(shí)用LSD-t檢驗(yàn)組間兩兩比較分析，方差不齊時(shí)用Dunnett's T3檢驗(yàn)比較分析。以P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理HE染色 正常對(duì)照組大鼠肺組織病理HE染色可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)清晰完好，肺泡間隔細(xì)且均勻，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、充血及水腫，無(wú)明顯纖維組織增生。間質(zhì)性肺炎模型組大鼠肺組織病理HE染色可見(jiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞，重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大塊的纖維組織增生實(shí)變，肺間質(zhì)纖維化明顯，可見(jiàn)實(shí)變病灶，局部有充血。清肺方組及強(qiáng)的松組大鼠肺組織病理HE染色均可見(jiàn)肺組織損害減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，纖維組織增生減少，無(wú)實(shí)變病灶。說(shuō)明清肺方及強(qiáng)的松均能抑制大鼠肺間質(zhì)纖維化。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(400×)Fig.1 HE staining in lung tissue of rats in each group(400×)

2.2 肺組織病理Masson染色 光鏡下可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠肺泡間隔無(wú)明顯膠原纖維增生，血管及氣道壁少量深色膠原纖維沉積；間質(zhì)性肺炎模型組大鼠肺組織可見(jiàn)支氣管、血管周邊大量深色膠原沉積，肺泡腔內(nèi)分布膠原纖維病灶，有大量的深色膠原沉積，深色膠原相對(duì)面積較正常對(duì)照組明顯增加；與間質(zhì)性肺炎模型組相比，清肺方組及強(qiáng)的松組肺泡間隔及血管、支氣管周邊可見(jiàn)少量深色膠原纖維沉積，膠原相對(duì)面積較間質(zhì)性肺炎模型組明顯減少?？梢?jiàn)清肺方及強(qiáng)的松均能抑制BLM誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠肺組織Masson染色(400×)Fig.2 Masson staining in lung tissue of rats in each group(400×)

2.3 肺組織HYP含量 與正常對(duì)照組比較，各模型組大鼠肺組織HYP含量明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與間質(zhì)性肺炎模型組相比，清肺方組、強(qiáng)的松組大鼠肺組織HYP含量明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。清肺方組與強(qiáng)的松組大鼠肺組織HYP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明清肺方及強(qiáng)的松均能抑制BLM誘導(dǎo)的大鼠間質(zhì)性肺纖維化。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺組織HYP含量比較（±s，μg·mg-1，n=11）Tab.1 Comparison of the Hydroxyproline content in lung tissue in each group（±s，μg·mg-1，n=11）

表1 各組大鼠肺組織HYP含量比較（±s，μg·mg-1，n=11）Tab.1 Comparison of the Hydroxyproline content in lung tissue in each group（±s，μg·mg-1，n=11）

注：與正常對(duì)照組比較，▲▲P＜0.01；與間質(zhì)性肺炎模型組比較，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲▲P＜0.01;Compared with model group,**P＜0.01.

2.4 肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-6檢測(cè)

2.4.1 肺組織TGF-β1檢測(cè) 與正常對(duì)照組比較，間質(zhì)性肺炎模型組、清肺方組、強(qiáng)的松組大鼠肺組織勻漿TGF-β1濃度明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組、強(qiáng)的松組TGF-β1濃度均明顯降低，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。清肺方組與強(qiáng)的松組之間肺組織勻漿TGF-β1濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?jiàn)清肺方及強(qiáng)的松均能抑制BLM誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺炎大鼠的肺組織TGF-β1，其抑制大鼠肺纖維化的作用機(jī)制與肺組織TGF-β1有關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1濃度比較（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.2 Comparison of the TGF-β1in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1濃度比較（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.2 Comparison of the TGF-β1in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

注：與正常對(duì)照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與間質(zhì)性肺炎模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;Compared with model group,*P＜0.05，**P＜0.01.

組別肺組織T G F -β 1濃度正常對(duì)照組間質(zhì)性肺炎模型組強(qiáng)的松組清肺方組2 8 9 9 7 5 8 7 ± 5 6 4 2 . 1 1 3 6 7 5 8 2 . 6 3 1 ± 7 8 4 3 . 2 5 5▲▲4 8 6 5 3 . 6 2 2 ± 9 6 7 3 . 4 6 8▲▲* 4 8 0 3 6 . 5 2 4 ± 8 7 6 6 . 5 9 7▲**

2.4.2 肺組織TNF-α檢測(cè) 與正常對(duì)照組比較，間質(zhì)性肺炎模型組、清肺方組、強(qiáng)的松組大鼠肺組織勻漿TNF-α濃度明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組、強(qiáng)的松組TNF-α濃度均明顯降低，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。清肺方組與強(qiáng)的松組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示清肺方及強(qiáng)的松均能抑制BLM誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺炎大鼠的肺組織TNF-α，其抑制大鼠肺纖維化的作用機(jī)制與肺組織TNF-α有關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肺組織TNF-α濃度比較（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.3 Comparison of the TNF-α in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

表3 各組大鼠肺組織TNF-α濃度比較（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.3 Comparison of the TNF-α in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

注:與正常對(duì)照組相比，▲P＜0.05；與間質(zhì)性肺炎模型組相比，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲P＜0.05;Compared with model group,**P＜0.01.

組別T N F -α濃度正常對(duì)照組間質(zhì)性肺炎模型組強(qiáng)的松組清肺方組1 8 2 . 7 6 9 ± 2 . 8 2 1 1 9 4 . 3 6 3 ± 5 . 7 4 1▲1 8 7 . 9 2 8 ± 4 . 5 5 1▲** 1 8 7 . 6 1 9 ± 2 . 7 5 0▲**

2.4.3 肺組織IL-6檢測(cè) 與正常對(duì)照組比較，間質(zhì)性肺炎模型組、清肺方組、強(qiáng)的松組大鼠肺組織勻漿IL-6濃度明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與間質(zhì)性肺炎模型組比較，清肺方組、強(qiáng)的松組IL-6濃度均明顯降低，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。清肺方組與強(qiáng)的松組之間肺組織勻漿IL-6濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？梢?jiàn)清肺方及強(qiáng)的松均能抑制BLM誘導(dǎo)的間質(zhì)性肺炎大鼠的肺組織IL-6，其抑制大鼠肺纖維化的作用機(jī)制與肺組織IL-6有關(guān)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肺組織IL-6濃度比較（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.4 Comparison of the IL-6 in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

表4 各組大鼠肺組織IL-6濃度比較（±s，pg·mL-1，n=11）Tab.4 Comparison of the IL-6 in lung tissue in each group（±s，pg·mL-1，n=11）

注:與正常對(duì)照組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與間質(zhì)性肺炎模型組相比，**P＜0.01。Note:Compared with normal group,▲P＜0.05，▲▲P＜0.01;compared with model group,**P＜0.01.

組別I L -6濃度正常對(duì)照組間質(zhì)性肺炎模型組強(qiáng)的松組清肺方組3 0 6 7 . 1 7 6 ± 7 2 3 . 4 3 8 6 2 3 4 . 6 3 ± 1 7 6 4 . 3 2 9▲▲5 0 2 2 . 3 9 8 ± 1 3 2 7 . 3 5 7▲▲** 4 7 2 8 . 2 2 9 ± 1 6 7 4 . 7 9 1▲**

3 討論

結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺炎的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。當(dāng)代多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為，結(jié)締組織病合并間質(zhì)性肺炎可以歸為中醫(yī)“肺痹”“肺痿”的范疇[5]。清肺方是根據(jù)導(dǎo)師在臨床治療風(fēng)濕病相關(guān)間質(zhì)性肺炎的經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)出的方劑，以“培土生金”為主要治法，太子參益氣健脾，生津潤(rùn)肺；沙參養(yǎng)陰清肺，益胃生津；麥冬養(yǎng)陰潤(rùn)肺，益胃生津；冬瓜子潤(rùn)肺化痰，消癰利水；山慈菇清熱解毒，化痰散結(jié)；浙貝母清熱散結(jié)，化痰止咳；僵蠶息風(fēng)止痙，祛風(fēng)止痛，化痰散結(jié)；石見(jiàn)穿活血化瘀，清熱利濕，散結(jié)消腫；蘆根清熱生津，除煩止嘔，利尿；蒲公英清熱解毒，利尿散結(jié)，全方共奏益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀、化痰散結(jié)之效。契合結(jié)締組織病伴間質(zhì)性肺炎之氣陰兩虛，痰瘀互結(jié)之病機(jī)?，F(xiàn)代藥理研究證明，太子參[6]、北沙參[7]、麥冬[8]、冬瓜子[9]等均具有一些明顯的抗氧化作用的成分，抑制肺纖維化的形成。

HYP是膠原纖維中的特有成分，約占膠原蛋白13.4%，其他除彈性蛋白含少量HYP(約1%)外，均不含HYP，因此HYP含量的測(cè)定已成為研究組織膠原代謝的重要方法。膠原是器官纖維化時(shí)細(xì)胞處基質(zhì)（extracellular matrixc,ECM）的主要成分，所以組織中HYP含量能反應(yīng)器官纖維化的程度，可作為衡量其膠原組織代謝的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中清肺方組大鼠肺組織病理改變明顯輕于間質(zhì)性肺炎模型組，且清肺方組大鼠肺組織HYP含量低于間質(zhì)性肺炎模型組，說(shuō)明清肺方可抑制大鼠肺組織纖維化。

TGF-β1、TNF-α、IL-6等是與肺間質(zhì)纖維化發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子。TGF-β1可以通過(guò)Smads通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂增殖并合成大量膠原蛋白，造成ECM調(diào)節(jié)失衡，因此抑制TGF-β1可以抑制肺纖維化的形成及發(fā)展[10]。同時(shí)，TGF-β1和氧化損傷、炎癥因子密切相關(guān)。一項(xiàng)研究報(bào)道[11]，TGF-β1可刺激上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞(EMT)，從而促進(jìn)纖維化發(fā)展。而且，在TGF-β1等細(xì)胞因子的刺激下，成纖維細(xì)胞分化形成肌成纖維母細(xì)胞(myofibroblast)，不僅僅使產(chǎn)生膠原的能力大大提高，合成大量膠原蛋白，而且具有收縮性，造成ECM調(diào)節(jié)失衡[12]，肺組織結(jié)構(gòu)破壞[13]。因此抑制TGF-β1可以抑制肺纖維化的形成及發(fā)展。CTD-ILD患者的血清TNF-α濃度高于RA患者，可見(jiàn)CTD并發(fā)ILD也與TNF-α有關(guān)，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確。有研究表明博來(lái)霉素導(dǎo)致的肺纖維化與TNF-α有關(guān)[14]。IL-6由T、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和幾種腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生。現(xiàn)在認(rèn)為是一種多功能細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)急性期反應(yīng)、免疫應(yīng)答和炎癥。臨床及實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)在間質(zhì)性肺炎中IL-6是一種促炎癥反應(yīng)因子。在患有間質(zhì)性肺炎的人和動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)，IL-6的含量增多。Madam等[15]研究證明血漿中IL-1，IL-6，IL-8和IL-10的水平與CTD-ILD相關(guān)。肺組織中TGF-β1、TNF-α和IL-6的水平逐漸升高，這就說(shuō)明肺組織中這些因子表達(dá)比其血漿水平更加直接反應(yīng)問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明清肺方對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠間質(zhì)性肺炎的作用機(jī)制與肺組織TGF-β1、TNF-α、IL-6濃度有關(guān)。由此可見(jiàn)，清肺方降低TGF-β1、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)，可能是減輕間質(zhì)性肺炎、抗肺纖維化的分子機(jī)制。

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Experimental Study on the Effect of Qingfei Decoction in Antifibrosis in Rats with Connective Tissue Disease Related Interstitial Pneumonia

QIAN Kang1，F(xiàn)AN Yongsheng21.Hangzhou First Peoples`Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006)，China;2.Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To establish a rat model of connective tissue disease associated interstitial pneumonia induced by bleomycin,and explore the effect of Qingfei Decoction on interstitial pneumonia and its effect on antifibrosis.[Methods]48 male SD rats,weight 180～200g.All the rats were fed adaptivelly for one week and the rat model of interstitial lung disease were established by means of pour 5mg·kg-1BLM into trachea.Divided these rats into 4 groups: the normal control group,the interstitial pneumonia model group，the predmisone group and the Qingfei Decoction group.In addition,each group 12 rats. After 28 days’medication,compare the pathological difference between Qingfei Decoction group with the interstitial pneumonia model group,the predmisone group and the normal control group,and the difference in the expressions of TNF-α,IL-6,TGF-β1in lung tissue,and the expression of hydroxyproline in lung tissue.[Result]①Pathological staining showed that:compared with the normal control group,the destruction of lung tissue structure of rats pneumonia,severe inflammatory cell infiltration,fibrous tissue hyperplasia massive consolidation,alveolar distribution of collagen fiber lesions in model groups;compared with interstitial pneumonia model group,Qingfei Decoction group reduced lung tissue damage,reduce inflammation cell infiltration,fibrous tissue hyperplasia reduced collagen relative area decreased compared with model group.②Compared with normal control group,the lung tissue of HYP rats was significantly increased,and the difference was statistically significant the model group(P＜0.01);Compared with interstitial pneumonia in the model group,the content of HYP in lung tissue of rats Qingfei Decoction group decreased significantly,and the difference was statistically significant(P＜0.01).③Compared with normal control group,the model group of rat lung tissue IL-6,TNF-alpha,TGF-beta1concentration increased significantly(P＜0.05,P＜0.01);compared with the model group,interstitial pneumonia,Qingfeifang lung tissue homogenate TNF-alpha,TGF-beta 1,IL-6 concentration decreased significantly(P＜0.05,P＜0.01).[Conclusion]1.Qingfei Decoction has inhibition effect to the bleomycin induced interstitial pneumonia.2.The treatment mechanism of Qingfei Decoction to BLM-ILD maybe related to TNF-α,IL-6,TGF-β1.

Qingfei Prescription;connective tissue disease;interstitial lung disease;antifibrosis;hydroxyproline;tumor necrosis factor-α;transforming growth factor-β1;interleukin-6

R331 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5509（2017）10-0784-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.10.002

杭州市衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017A02）

Fund project：Program on medical and health technology of Hangzhou（2017A02）

范永升，E-mail：fyszjtcm＠163.com

2017-05-08）