T—RFLP技術(shù)在土壤微生物群落多樣性分析中的研究進展

馬琳+張衛(wèi)華+劉淼

摘 要：土壤微生物群落多樣性在保證作物健康生長、提高土壤質(zhì)量、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面都具有十分重要的意義，研究方法的選擇尤為關(guān)鍵，T-RFLP技術(shù)因其能快速獲得大量數(shù)據(jù)、靈敏度高且穩(wěn)定性好，近年來廣泛應用于土壤微生物多樣性研究中，本文從原理方法、重要環(huán)節(jié)及實際應用3個方面介紹T-RFLP技術(shù)，分析其局限性，并對其應用前景進行展望，旨在為土壤微生物群落分析研究提供更可靠、高效的方法。

關(guān)鍵詞：T-RFLP；土壤微生物；多樣性分析

中圖分類號：S182 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170932217

微生物是土壤生物的重要組成部分，極大地影響著土壤中營養(yǎng)元素的循環(huán)、肥力的形成，在改善生態(tài)環(huán)境方面也起著非常重要的作用[1]。開展對土壤微生物多樣性的研究，不僅能了解土壤的養(yǎng)分情況、預測土壤的環(huán)境質(zhì)量變化，還可以知道土壤中微生物的種類及其功能。T-RFLP技術(shù)具有較高的分辨率、精確度和靈敏度，且能夠迅速獲得大量數(shù)據(jù)，準確、快速、真實地反映土壤微生物的多樣性[2]，近年來被廣泛應用于土壤微生物群落多樣性的分析中。

1 T-RFLP技術(shù)的基本原理和方法

末端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism， T-RFLP），是以分子生物學技術(shù)為基礎(chǔ)的較為先進的微生物群落研究方法，它是PCR技術(shù)、熒光標記技術(shù)、DNA限制性酶切技術(shù)和DNA序列自動分析技術(shù)的綜合運用。

該技術(shù)要依據(jù)微生物的比較基因組學信息，確定合適的DNA目的序列，然后根據(jù)基因的保守區(qū)設(shè)計通用引物，其中1個引物的5端用熒光物質(zhì)標記，常用的熒光物質(zhì)有：四氯熒光素TET，綠色的六氯熒光素HEX和藍色的六羧基熒光素6-FAM。提取樣品中的總DNA，以總DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后用四堿基限制性內(nèi)切酶酶切，消化產(chǎn)物在自動測序儀上進行檢測，就可以檢測出末端被熒光標記了的限制性片段，得到末端片段峰，而未用熒光標記的片段是檢測不到的。不同的末端片段峰代表不同種類的微生物，所以通過峰高或峰面積的大小、峰的數(shù)量可以判斷出微生物群落的結(jié)構(gòu)、功能及其變化情況[3]。

2 T-RFLP技術(shù)應注意的環(huán)節(jié)及優(yōu)化

2.1 土壤微生物總DNA的提取

提取土壤中微生物總DNA是運用T-RFLP技術(shù)的關(guān)鍵步驟，總DNA的產(chǎn)量和純度會直接影響實驗結(jié)果。土壤微生物DNA的提取方法有2種，分別是直接提取法和間接提取法。直接提取法是通過化學、物理或酶等手段直接作用于土壤，破壞其微生物細胞，釋放出DNA分子，然后將DNA純化；間接提取法是先將微生物從土壤中分離出來，然后進行DNA的提取和純化。Leff等[4]分析比較了2種提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法各有優(yōu)劣：直接提取法提取的DNA產(chǎn)量較高，但DNA損傷比較嚴重；間接提取法能獲得純度較高的DNA，但產(chǎn)量較低。近年來，土壤DNA提取試劑盒因其提取速度快、效果好、DNA純度高而受到廣泛關(guān)注，用試劑盒提取出來的DNA更適合做PCR擴增分析，因此，在經(jīng)濟允許的條件下，盡量采用試劑盒法提取土壤微生物的總DNA。

2.2 限制性內(nèi)切酶的選擇

選擇能夠明顯區(qū)分不同微生物的四堿基限制性內(nèi)切酶，即酶切后產(chǎn)生的末端片段峰的大小有明顯的差別，應盡量避免只相差1個堿基的情況，確保消化反應得到的單峰具有特異性，盡量減少雜峰的產(chǎn)生。需要注意的是，由于雜峰的存在會嚴重影響對樣品微生物的分析和認識，所以不能單純地將產(chǎn)生末端限制性片段的數(shù)量作為限制性內(nèi)切酶的選擇標準，應用純培養(yǎng)物檢驗后再對樣品進行分析，確保選擇到合適的限制性內(nèi)切酶。還可以選用多個限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后綜合不同酶的酶切結(jié)果，這樣可以大大提高檢出效率。采用多種酶進行酶切時，不能將幾個酶在同一個反應體系中進行，需要它們在各自的反應體系中分別進行酶切，因為雙酶切有可能比單酶切產(chǎn)生的TRF還要少[5]。

2.3 圖譜的解讀

DNA測序儀的熒光檢測器可以檢測到帶有熒光標記物質(zhì)的限制性片段（T-RF），對應到T-RFLP圖譜上就是各個“峰”，峰的橫坐標表示片段長度，是在比較各片段與標樣中已知的DNA片段在電泳中的位置后，通過計算得到的；峰的縱坐標表示帶有熒光物質(zhì)T-RF的熒光強度，峰面積則表示片段長度相同的所有T-RF的熒光強度之和，分析圖譜的時候，通常將每個T-RF作為一個“OTU”（operational taxonomic unit），根據(jù)圖譜中OTU的數(shù)目及其豐度計算多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)等指標，進行群落多樣性的分析研究。

3 T-RFLP技術(shù)在土壤微生物多樣性研究中的應用

3.1 T-RFLP圖譜直觀分析

T-RFLP圖譜可以反映出樣品的很多信息，片段長度、熒光強度、豐富度等指標可采用直接觀察法進行直觀分析，一些研究將T-RFLP圖譜進行比較，初步判斷不同處理間是否存在差異：陳冬梅等[6]通過比對白肋煙不同種植年限的T-RFLP圖譜發(fā)現(xiàn)，其根際細菌群落在團棵期和成熟期均呈現(xiàn)明顯差異；張重義等[7]采用該方法分析得出，在塊根膨大期，不同種植年限地黃根際細菌群落存在明顯差異。還有些研究則根據(jù)T-RFLP圖譜判斷物種豐富度的變化趨勢：楊宇虹等[8]將連作煙草根際土壤的T-RFLP圖譜與對照處理進行比較，發(fā)現(xiàn)連作會使煙草根際土壤細菌群落數(shù)量減少，物種豐富度降低，趨于單調(diào)。封曄等[9]研究了8種植物根際細菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)8個T-RFLP圖譜均有較多峰，且峰值間的差異較大，說明8種植物根際細菌的豐富度較高，但在數(shù)量、片段大小上存在一定差異。直接觀察法只能對數(shù)據(jù)進行初步的判斷分析，更深入的數(shù)據(jù)解析如多樣性分析、聚類分析、冗余分析等還需要借助統(tǒng)計學、生物數(shù)學的算法以及Excel、SPSS等數(shù)據(jù)處理軟件。endprint

3.2 微生物多樣性指數(shù)分析

多樣性指數(shù)是土壤微生物群落多樣性的重要指標，可根據(jù)T-RFLP圖譜的OTU數(shù)目及其豐度計算多樣性指數(shù)，然后用Biological Tools軟件對其進行分析。不同的施肥制度會直接影響到農(nóng)作物的生長及其產(chǎn)量，還會使土壤的理化性狀發(fā)生改變，從而改變土壤微生物的數(shù)量、活性及群落結(jié)構(gòu)組成。曾希柏等[10]分析了不同施肥模式下設(shè)施菜地的細菌群落，發(fā)現(xiàn)Shannon指數(shù)、Evenness指數(shù)和Simpson指數(shù)在1/2MNPK處理0～20cm表層土壤中數(shù)值最大，說明不同施肥處理細菌的豐度及優(yōu)勢種群有顯著差異，且表層土壤的微生物比較豐富。不同植物的根系分泌物對不同種類的土壤微生物有不同的影響，比如某個植物的根系分泌物會促進一些土壤微生物的生長，而對其他土壤微生物產(chǎn)生抑制作用。封曄等[9]分別計算了8種植物根際細菌的Shannon指數(shù)和Evenness指數(shù)，結(jié)果表明，六道溝流域內(nèi)樹種的不同是導致根際細菌多樣性出現(xiàn)差異的因素之一。秦越等[11]對馬鈴薯連作栽培土壤進行微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)連作栽培馬鈴薯后土壤細菌和真菌DNA仍具有較高的T-RFLP多態(tài)性，但不同連作年限的根際土壤，其優(yōu)勢T-RFs片段不同，且長年連作會導致某些T-RFs消失。

4 T-RFLP技術(shù)的局限性及應用前景

T-RFLP技術(shù)在研究土壤微生物群落多樣性領(lǐng)域中，不論是從技術(shù)本身的靈敏度和精確度來看，還是從實驗經(jīng)費方面考慮，都具有很大的優(yōu)勢，但也存在一些局限性：T-RFLP技術(shù)前期需要進行PCR擴增和限制性內(nèi)切酶酶切，如果近緣種微生物在擴增片段靠近熒光標記端的切點一樣時，T-RFLP圖譜上的1個峰就有可能代表多種微生物，因此無法區(qū)分近緣種微生物[12]；T-RFLP技術(shù)只能根據(jù)原始數(shù)據(jù)計算出每個片段的相對豐度，因而得到的結(jié)果只能看出各類微生物所占比例，并不能確定某一生態(tài)系統(tǒng)中各類微生物的絕對含量，即便某些微生物在數(shù)量上有所改變，單從相對比例上也無法準確地看出其變化趨勢；在原始數(shù)據(jù)的處理時，片段長度范圍的確定、噪聲峰的去除及大小相近的片段合并都會對結(jié)果造成影響，尤其是片段的合并存在很大的人為因素，不同的人處理的數(shù)據(jù)會有所差異，導致結(jié)果出現(xiàn)偏差，不能非常準確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

盡管T-RFLP技術(shù)在某些方面存在一定的局限性，但綜合來看，該技術(shù)仍是分析土壤微生物群落多樣性的理想方法之一。近年來核酸測序技術(shù)的不斷發(fā)展、數(shù)據(jù)庫中核酸序列的不斷豐富，因此利用分子手段分析土壤微生物群落多樣性已成為必然趨勢。隨著T-RFLP技術(shù)自身參數(shù)的不斷優(yōu)化，再結(jié)合實時熒光定量PCR、克隆等定量分析技術(shù)，該技術(shù)必將會在土壤微生物群落分析研究中發(fā)揮更大的作用。

參考文獻

[1]徐萬里，唐光木，葛春輝，等.長期施肥對新疆灰漠土土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能多樣性的影響[J].生態(tài)學報，2015， 32（2）：468-477.

[2]羅佳捷，李麗立，張彬.T-RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009（7）：75-78.

[3]余素林，吳曉磊，錢易.環(huán)境微生物群落分析的T-RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施[J].應用與環(huán)境生物學報，2006，12（6）：861-868.

[4] Leff LG，Dana JR，Mcarthur JV，et al.Comparison of methods of DNA extraction from stream sediments[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，61（3）：1141-1143.

[5] Dunbar J，Ticknor LO，Kuske CR.Phylogeneticspecificity and reproducibility and newmethod foranalysis of terminal restriction fragment profiles of 16SrRNAgenes frombacterial communities[J].Applied and Environmental Microbiology， 2001，67（1）：190-197.

[6]陳冬梅，柯文輝，陳蘭蘭，等.連作對白肋煙根際土壤細菌群落多樣性的影響[J].應用生態(tài)學報，2010，21（7）：1751-1758.

[7]張重義，陳慧，楊艷會，等.連作對地黃根際土壤細菌群落多樣性的影響[J].應用生態(tài)學報，2010，21（11）：2843-2848.

[8]楊宇虹，陳冬梅，晉艷，等.連作煙草對土壤微生物區(qū)系影響的T-RFLP分析[J].中國煙草學報，2012，18（1）：40-45.

[9]封曄，唐明，陳輝，等.黃土高原六道溝流域8種植物根際細菌與AMF群落多樣性研究[J].環(huán)境科學，2012，33（1）：314-322.

[10]曾希柏，王亞男，王玉忠，等.不同施肥模式對設(shè)施菜地細菌群落結(jié)構(gòu)及豐度的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（1）：69-79.

[11]秦越，馬琨，劉萍.馬鈴薯連作栽培對土壤微生物多樣性的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2015，23（2）：225-232.

[12]賈俊濤，宋林生，李筠.T-RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應用[J].海洋科學，2004（03）：64-68.endprint