大黃素抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的研究

吳丹丹 ，樸仙姬 ，劉暢 ，羅英花 ，孫虎男 ，臧延青 ，金成浩

大黃素抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的研究

吳丹丹1，樸仙姬2，劉暢1，羅英花1，孫虎男1，臧延青1，金成浩1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.哈醫(yī)大五院）

研究大黃素對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖與凋亡的影響。通過MTT法檢測Hela細(xì)胞的存活率，Annexin V-FITC/PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)檢測Hela細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)免疫印記法檢測p-JNK、JNK、Bcl-2、pro-caspase-9、cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)。大黃素對Hela細(xì)胞的增殖抑制效果呈濃度依賴性。Annexin V-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明大黃素能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。蛋白質(zhì)免疫印記法表明，隨著藥物處理時間的增加，p-JNK、cleaved-caspase-3的蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸增加，Bcl-2、procaspase-9的蛋白表達(dá)量逐漸減少。在實驗條件下，大黃素可以抑制Hela細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

大黃素；人宮頸癌Hela細(xì)胞；JNK信號通路；細(xì)胞凋亡

宮頸癌（Cervical Cancer）是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌而位居第二，嚴(yán)重威脅婦女的健康和生命[1]。在我國，宮頸癌占婦女惡性腫瘤的首位，而且其發(fā)病率呈上升趨勢[2]。目前，宮頸癌治療手段一般是以手術(shù)治療、放療為主，化療為輔。但放、化療后的不良反應(yīng)及腫瘤對化療藥物的耐藥性已成為當(dāng)今治療腫瘤的主要問題。因此，尋找治療效果好且不良反應(yīng)小的藥物已成為醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。

大黃素是一種蒽醌類衍生物，主要來源于蓼科植物掌葉大黃根莖，其化學(xué)名稱為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，是中藥大黃的主要有效單體。大黃素除了具有瀉下、抗菌、消炎等作用[3]，還具有抗腫瘤[4-5]藥理作用。大黃素對若干腫瘤細(xì)胞都具有良好的抑制生長的活性，但對不同的細(xì)胞系，抑制生長的機(jī)制有所不同。盡管國內(nèi)外一些學(xué)者對大黃素抗腫瘤的機(jī)理作了一定的研究和探討，但是大黃素對宮頸癌細(xì)胞的藥理作用尚不清楚，國內(nèi)外鮮有報道。通過MTT法，Annexin V-FITC/PI雙染色法，蛋白質(zhì)免疫印記法等生物學(xué)方法闡明大黃素對宮頸癌Hela細(xì)胞的生長抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用及其相關(guān)信號通路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

Hela細(xì)胞（購自上海中科院細(xì)胞研究所），由本實驗室凍存。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：大黃素、DMSO均購自美國Sigma公司，MTT購自美國Amresco公司，DMEM高糖液體培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素雙抗、PBS均購自美國HyClone公司，F(xiàn)BS購自美國Gibco公司，抗體βactin、JNK、p-JNK、Bcl-2、cleaved-caspase-3、procaspases-9、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購自美國Santa Cruz公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Thermo公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋，日本SanYo公司；390302倒置顯微鏡，德國Leica公司；EVOS FL型全自于動智能成像系統(tǒng)，Life Technology公司；MicroChemi4.0型化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR成像系統(tǒng)有限公司；電泳儀、半干轉(zhuǎn)印儀（Bio-rad），美國伯樂公司；FACSCalibvr型流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 宮頸癌Hela細(xì)胞的復(fù)蘇與擴(kuò)增

將Hela細(xì)胞從液氮罐中取出。將凍存管迅速地放入37℃水浴鍋中順時針旋轉(zhuǎn)融化，將凍存管中的細(xì)胞吸出，加入含有預(yù)熱的4 mL DMEM培養(yǎng)液的15 mL離心管中，1 200 rpm，離心3 min。棄上清液后，重新加入10 mL DMEM培養(yǎng)液吹打均勻后，加到10 cm培養(yǎng)皿中晃動使細(xì)胞均勻平鋪于培養(yǎng)皿底，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。時刻觀察細(xì)胞的長勢，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的70%～80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。棄廢液后用PBS洗去培養(yǎng)皿中殘留的血清后，再用0.25%的T/E胰蛋白酶消化貼壁的細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上脫落下來。隨后在細(xì)胞中加入培養(yǎng)液阻斷消化，離心（3 min，1 200 rpm），加培養(yǎng)液吹打均勻后加到10 cm培養(yǎng)皿中前后左右晃動均勻后，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[6]。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率

收集處于對數(shù)期的細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度后種入96孔板中使得每孔細(xì)胞數(shù)量在1×104個左右。置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱里孵育16～24 h，之后用含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)液血清饑餓培養(yǎng)2 h左右，每孔分別加入1 μL不同濃度的大黃素（1、3、10、30、100 μmol·L-1），并設(shè)置對照組（加入等量的1 μL DMSO），每組設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)置空白調(diào)零孔（加入100 μL DMSO）。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，每孔加入15～20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1，即 0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 2 h。 將培養(yǎng)液吸出，用PBS洗1～3次，每孔加入100 μL DMSO顯色，在搖床上混勻15 min，用酶標(biāo)儀測量吸光度（A570）值，計算細(xì)胞存活率[7]。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測凋亡

將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種在6孔板中（1×105個·孔-1），當(dāng)細(xì)胞滿度達(dá)到70%時按時間梯度（0、3、6、12、24 h） 加入濃度為 30 μmol·L-1的大黃素處理。棄上清后，用PBS洗1～3次，每孔加入194 μL Annexin V-結(jié)合液。 加入 2 μL Annexin V-FITC，輕輕地混勻，再加入4 μL碘化丙啶（PI）染色液，染色10～15 min后在熒光顯微鏡下觀察照相。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞計數(shù)法，將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種在6孔板中（1×105個·孔-1），貼壁生長24 h后，按時間梯度（0、3、6、12、24 h）每孔加濃度為 30 μmol·L-1的大黃素。使用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，6 000 rpm離心5 min。棄上清，1 mL PBS漂洗后，再次離心。用195 μL的Annexin V結(jié)合液重選細(xì)胞。加入3 μL Annexin VFITC和2 μL PI，輕輕混勻，避光孵育15 min。 加入300 μL PBS緩沖液后，立即通過流式細(xì)胞儀檢測分析[8]。

1.3.5 Western blot方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量變化

將對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞接種在6孔板中（1×105個·孔-1），培養(yǎng) 16～24 h 后，按時間梯度（0、6、12、24 h） 每孔加30 μmol·L-1濃度的大黃素。 棄掉上清液，加100 μL細(xì)胞裂解液（含有4種蛋白酶抑制劑AEBSF、pepstatin、leupeptin 和 aprotinin，lysis buffer，β-ME）冰浴裂解細(xì)胞后，12 000 rpm、4 ℃離心30 min。取上清液，用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。取30 μg蛋白與5×buffer混合后，煮沸5 min。用12%SDSPAGE電泳分離，半干轉(zhuǎn)印到NC膜上，5%脫脂乳封閉1 h， 分別與p-JNK、JNK、Bcl-2（稀釋比例為1∶2 500）、β-actin（稀釋比例為 1∶4 000）、cleaved-caspase-3、pro-caspase-9（稀釋比例為 1∶2 500）4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗5次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記山羊抗 兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗（稀釋比例為1∶2 000）室溫孵育2 h。TBST洗5次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，然后利用DNR化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)照相，內(nèi)參采用β-actin[9]。

蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度=目標(biāo)蛋白表達(dá)強(qiáng)度/β-actin蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用spss17.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001）。

2 實驗結(jié)果

2.1 大黃素對Hela細(xì)胞生長的影響

MTT 法 結(jié) 果 顯 示 ， 不 同 濃 度（1、3、10、30、100 μmol·L-1）的大黃素處理 Hela 細(xì)胞 24 h，發(fā)現(xiàn)大黃素對Hela細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并且呈一定的劑量分布，大黃素的濃度越高，細(xì)胞存活率越低，與對照組（0 μM）比較具有顯著差異（P＜0.001）。經(jīng)計算大黃素對Hela細(xì)胞的IC50值為15.59 μmol·L-1（圖 1）。

圖1 不同濃度大黃素對Hela細(xì)胞殺傷作用Fig.1 Lethal effect of emodin of different content on Hela cells

2.2 大黃素對Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，用30 μmol·L-1濃度的大黃素處理 Hela細(xì)胞（0、3、6、12、24 h）后，在顯微鏡下進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，隨著藥物處理時間的增加，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的體積變小，皺縮，核質(zhì)濃縮，核碎裂以及凋亡小體的形成等凋亡形態(tài)學(xué)特征（圖2）。

2.3 大黃素對Hela細(xì)胞熒光染色的影響

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果表明，用30 μmol·L-1的大黃素處理細(xì)胞（0、3、6、12、24 h）后，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增加，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，凋亡細(xì)胞越多，與對照組（0 h）比較具有顯著性差異。說明大黃素對Hela細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡的作用（圖3）。

圖2 Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察（100×）Fig.2 Morphology observation of Hela cells（100×）

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡情況（200×）Fig.3 Apoptotic effect of emodin on Hela cells by Annexin V-FITC/PI double staining

2.4 大黃素對Hela細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，用終濃度為30 μmol·L-1的大黃素處理 Hela細(xì)胞不同時間（0、3、6、12、24 h）后，Hela細(xì)胞出現(xiàn)明顯的早期凋亡現(xiàn)象，隨著藥物處理時間的延長，與對照組（0 h）比較，凋亡峰逐漸右移，且處理藥物時間越長，凋亡峰右移越顯著，說明大黃素可以誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈時間依賴性（圖 4）。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測大黃素對Hela細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 The apoptotic effect of emodin on Hela cells by Flow cytometer

2.5 大黃素對Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

Western blot結(jié)果表明， 用終濃度為 30 μmol·L-1的大黃素處理 Hela細(xì)胞不同時間（0、6、12、24 h）后，磷酸化的JNK、被剪切的cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著升高；大黃素終濃度為 30 μmol·L-1時，顯著降低未活化的pro-caspase-9及Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，并呈濃度依賴性，與對照組（0 h）比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。說明大黃素可以通過JNK信號途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖5）。

3 討論

c-Jun氨基末端激酶（JNK）家族是促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族成員之一，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是哺乳動物體內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）超家族的一員[10]。諸多研究表明，JNK能介導(dǎo)多種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)的凋亡，參與許多細(xì)胞凋亡的發(fā)生，如細(xì)胞應(yīng)激，生長因子[11]。JNK信號通路主要通過調(diào)控胞漿中的底物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如磷酸化并激活Bax等促凋亡因子或磷酸化并抑制Bcl-2、Bcl-xl等抗凋亡的Bcl-2家族成員，激活線粒體依賴的細(xì)胞凋亡通路[12]。早期研究發(fā)現(xiàn)，多種促炎因子可以激活Hela細(xì)胞中的p38/MAPK信號通路，促進(jìn)抑癌基因c-myc的表達(dá)，從而啟動Hela細(xì)胞的凋亡[13]。實驗通過MTT法檢測大黃素對Hela細(xì)胞的生長起抑制作用，且呈濃度依賴性，藥物濃度越高，細(xì)胞存活率越低（圖1）。通過大黃素對Hela細(xì)胞處理后的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著時間的增加，細(xì)胞明顯出現(xiàn)體積變小，皺縮，核質(zhì)濃縮，核碎裂以及凋亡小體的形成等凋亡形態(tài)學(xué)的改變（圖2）。Annexin V-FITC/PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步驗證發(fā)現(xiàn)，隨著藥物處理時間的增加，熒光強(qiáng)度越明顯，凋亡峰右移越明顯。說明大黃素對Hela細(xì)胞有促進(jìn)凋亡的作用（圖3、圖4）。實驗Western blot結(jié)果顯示促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的剪切的cleaved-caspase-3、磷酸化的JNK的蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸增加，而抑制凋亡作用的Bcl-2、pro-caspase-9的蛋白質(zhì)表達(dá)量逐漸減少，與先前的研究相符（圖5）。研究結(jié)果說明，大黃素是通過JNK介導(dǎo)的線粒體依賴性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。

圖5 Western blot檢測大黃素對Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.5 Effect of emodin on the proteins associated with Hela cells apoptosis by western blot

4 結(jié)論

綜上所述，研究結(jié)果闡明大黃素可抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。這僅是對大黃素抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡影響的初步研究，尚需展開進(jìn)一步研究，為今后宮頸癌及其他癌癥的治療提供理論基礎(chǔ)。

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Effects of Emodin on Proliferation and Apoptosis of Cervical Cancer Hela Cells Lines

Wu Dandan1，Piao Xianji2，Liu Chang1，Luo Yinghua1，Sun Hu'nan1，Zang Yanqing1，Jin Chenghao1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319;2.Department of Gynaecology and Obstetrics，The fifth Affiliated Hospital of Harbin Medical University）

To investigate the inhibitory effect of emodin on the proliferation of human cervical cancer，the viability of Hela cells was determined by MTT assay.Cells apoptosis were observed by Annexin V-FITC/PI staining and FCM.The expression levels of p-JNK，JNK，Bcl-2，pro-caspase-9 and cleaved-caspase-3 were determined by Western blotting.Emodin could inhibit the proliferation of Hela cells and in a dose-dependent manner.Annexin V-FITC/PI double staining and FCM results showed that emodin induced Hela cell apoptosis.In addition，it was suggested that western blot results showed that the expressions of p-JNK，cleaved-caspase-3 kept increasing，while Bcl-2，pro-caspase-9 decreased.Under this experimental condition，emodin could inhibit the proliferation of Hela cells and induce apoptosis by up-regulation JNK signaling pathway.

emodin;human cervical carcinoma Hela cells;JNK pathway;apoptosis

Q78

A

1002-2090（2017）05-0069-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.017

2016-07-25

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目（YJSCX2016-Y52）；黑龍江省自然基金項目（LC2015036）；黑龍江省博士后科研啟動項目（LBH-Q13132）；學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動計劃項目（XYB2013-24）。

吳丹丹（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院2014級碩士研究生。

金成浩，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：jinchenghao3727@qq.com。