春季西葫蘆日光溫室黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律與防蟲網(wǎng)的防控效果

毛曉紅　于毅　張秀霞

摘要：為探明西葫蘆日光溫室中黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律和防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜對該病毒病的防控效果，于2014、2015年在山東濟南地區(qū)開展田間定點調(diào)查和室內(nèi)PCR檢測試驗。結(jié)果表明，在春季日光溫室西葫蘆生長期，西葫蘆帶毒植株4月中旬開始出現(xiàn)，之后帶毒率逐漸上升，5月下旬達30%左右。黃瓜花葉病毒病的發(fā)生與瓜蚜密度密切相關(guān)，瓜蚜密度達到一定程度后，出現(xiàn)西葫蘆帶毒植株，瓜蚜進入迅速增長期后，西葫蘆帶毒株率亦呈上升趨勢；春季日光溫室中帶毒瓜蚜在4月中旬開始出現(xiàn)，而后帶毒率呈逐漸上升趨勢，5月下旬達3611%～4556%。西葫蘆生長期用100目防蟲網(wǎng)隔離可降低西葫蘆植株帶毒率。該研究能為日光溫室西葫蘆病毒病科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃瓜花葉病毒（CMV）??；發(fā)生規(guī)律；瓜蚜；種群動態(tài)；防蟲網(wǎng)

中圖分類號： S4364211+9文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0096-03

收稿日期：2016-03-26

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201303028）。

作者簡介：毛曉紅（1985—），女，山東煙臺人，研究方向為蔬菜病毒防控。Tel：（0531）83178008；E-mail：315159613@qqcom。

通信作者：張安盛，碩士，研究員，主要從事蔬菜病蟲害防控技術(shù)研究。Tel：（0531）83179542；E-mail：zhangansheng2003@163com。

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，簡稱CMV）隸屬雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus），該病毒寄主范圍廣，可侵染包括葫蘆科、茄科、十字花科、豆科在內(nèi)的1 000多種寄主植物[1-2]。寄主植物被侵染后表現(xiàn)為矮化、花葉、褪綠，同時還表現(xiàn)出斑駁、明脈及過敏性壞死等癥狀。自1916年CMV被首次確定為黃瓜花葉病病原以來，因其發(fā)生的普遍性和危害的嚴重性，已成為世界范圍內(nèi)重要的、研究較多的RNA病毒之一，位居世界第4[3-4]。黃瓜花葉病毒病在自然界主要由蚜蟲以非持久性方式傳播，如瓜蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）等，此類蚜蟲寄主范圍廣，在西葫蘆植株及其他蔬菜上發(fā)生嚴重，為黃瓜花葉病毒病的傳播提供了條件[5]。目前，黃瓜花葉病毒病在山東省蔬菜主產(chǎn)區(qū)日光溫室西葫蘆上發(fā)生面積大、危害嚴重，對日光溫室西葫蘆的安全生產(chǎn)造成了重大影響。

目前國內(nèi)外學(xué)者對黃瓜花葉病毒的研究，主要有病毒的生物學(xué)特性、株系分化、綜合防控技術(shù)[8-10]等，鄭光宇研究了桃蚜對黃瓜花葉病毒新疆株的傳播特性[11]，但關(guān)于瓜蚜對日光溫室中黃瓜花葉病毒的傳播未見報道。本研究對山東省春季西葫蘆日光溫室黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律、發(fā)生規(guī)律與傳毒介體瓜蚜種群動態(tài)的關(guān)系、西葫蘆生長期罩防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜對病毒病的防控效果進行了分析，以期為西葫蘆病毒病的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11試驗地概況

試驗地點為山東省濟南市歷城區(qū)董家鎮(zhèn)張而村西葫蘆日光溫室，試驗地面積均為0067 hm2，西葫蘆品種為優(yōu)美F1。黃瓜花葉病毒病調(diào)查定植時間分別為2014年3月4日、2015年3月12日、2015年9月4日，株行距為60 cm×100 cm，長勢良好。

12試驗儀器

TP600PCR儀（日本TaKaRa公司）；RXZ-280D-LED光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；5804R低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；凝膠成像儀（美國Alpha Innotech公司）；DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠）；25～1 000 μL移液器（德國Eppendorf公司）；MDF-U4086S -80 ℃冰箱（日本SANYO公司）；MLS-3020高壓滅菌鍋（日本SANYO公司）；HD-920超凈工作臺（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；MDF-U4086S -80 ℃冰箱（日本SANYO公司）。

13試驗材料

植物RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：DP432]；反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：KR107]；Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：KT201]；TRIzol（美國Invitrogen公司）；DL2000Marker（ProbeGene公司）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；100目防蟲網(wǎng)（浙江省臺州市路橋區(qū)德農(nóng)防蟲網(wǎng)廠，加工成100 cm×100 cm×100 cm 防蟲網(wǎng)罩，用于西葫蘆生長期罩網(wǎng)）。

14試驗方法

141西葫蘆植株和瓜蚜體內(nèi)黃瓜花葉病毒PCR檢測

單頭蚜蟲RNA提?。簩晤^蚜蟲置于15 mL離心管中，放入液氮中冷卻，用微型小杵研磨均勻；加入250 μL TRIzol試劑，室溫放置5 min；加入50 μL三氯甲烷混合物[三氯甲烷 ∶異戊醇（體積比）=24 ∶1]，振蕩混勻3 min；4 ℃、12 000 r/min離心 10 min，移上清至另一離心管中（約125 μL），加入等體積異丙醇（-20 ℃預(yù)冷），室溫放置10 min（夏天放于-20 ℃冰箱中預(yù)冷30 min），4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入70%預(yù)冷的乙醇（250 μL）洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心 5 min，待乙醇揮發(fā)后加入8 μL RNase-Free ddH2O。

植物基因組RNA提?。簩⑽骱J葉片在液氮中磨碎；每50～100 mg組織加1 mL裂解液RZ，用勻漿儀進行勻漿處理；將勻漿樣品在室溫中放置5 min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，轉(zhuǎn)入1個新的無RNase的離心管中。 加入200 μL三氯甲烷，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；4 ℃、12 000 r/min離心1 min，緩慢加入05倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現(xiàn)沉淀）；將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，4 ℃、12 000 r/min 離心30 s，棄掉收集管中的廢液，將CR3放入收集管中，向吸附柱CR3中加入700 μL漂洗液RW，室溫靜置2 min，4 ℃、 12 000 r/min離心30 s，棄廢液，重復(fù)操作步驟，將吸附柱放入2 mL收集管中，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，去除殘余液體，將吸附柱CR3轉(zhuǎn)入1個新的15 mL離心管中，加 30 μL RNase-Free ddH2O，室溫放置2 min，4℃、12 000 r/min 離心2 min，RNA于-80 ℃凍存。

反轉(zhuǎn)錄體系共20 μL：模板RNA 10 μL、Random 1 μL、dNTP 1 μL、Mix 1 μL，5×First-Stranf Buffer 4 μL、RNase-free ddH2O 3 μL，將所有試劑輕輕混勻后，按照程序（25 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min）進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后cDNA于-20 ℃凍存。

PCR反應(yīng)：使用CMV特異引物（上游引物5′-GATGGACAAATCTGAATCAACCAG-3′；下游引物5′-AACTGGGAGCACCCCAGATGTG-3′）進行擴增，反應(yīng)體系為10 μL：cDNA 2 μL，F(xiàn)端、R端引物各05 μL，2×PCR MasterMix 5 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行15%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

142春季日光溫室西葫蘆植株上黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律與瓜蚜種群動態(tài)的關(guān)系

日光溫室西葫蘆植株黃瓜花葉病毒病調(diào)查時間分別為2014年、2015年3月中旬至5月下旬（3月12日—5月26日），每10 d左右調(diào)查1次，每年調(diào)查8次。調(diào)查方法：在日光溫室東、西兩側(cè)分別保留2行西葫蘆作保護行，將日光溫室自東向西平均分為5個小區(qū)，在每個小區(qū)的中間位置選取西葫蘆2行，在每行西葫蘆的南、中、北各固定2株代表性西葫蘆，共固定60株西葫蘆；每次均調(diào)查固定西葫蘆植株上、中部5張葉片上瓜蚜數(shù)量；同時采集固定西葫蘆植株的葉片和30～40頭瓜蚜，室內(nèi)用PCR方法檢測西葫蘆植株、瓜蚜對黃瓜花葉病毒的帶毒率。

15日光溫室西葫蘆生長期罩防蟲網(wǎng)對西葫蘆病毒病的防控效果

試驗時間為2015年9月上旬至11月中旬，西葫蘆定植時（2015年9月4日）用防蟲網(wǎng)將供試西葫蘆植株罩網(wǎng)隔離，共罩防蟲網(wǎng)罩36個，1個防蟲網(wǎng)罩對應(yīng)西葫蘆苗2株。分別在西葫蘆定植后10、20、30、40 d揭掉防蟲網(wǎng)罩，每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)3個防蟲網(wǎng)罩；分別在揭防蟲網(wǎng)罩后5 min、10 d、20 d、30 d PCR檢測原先防蟲網(wǎng)內(nèi)西葫蘆植株的帶毒率。

2結(jié)果與分析

21春季西葫蘆日光溫室黃瓜病毒病發(fā)生與瓜蚜種群動態(tài)的關(guān)系

圖1表明，2014、2015年3月中旬至5月下旬調(diào)查結(jié)果顯示，2年中日光溫室西葫蘆瓜蚜種群動態(tài)、黃瓜花葉病毒病發(fā)生規(guī)律基本相似，即單葉瓜蚜數(shù)量、西葫蘆帶毒株率整體均呈逐漸增長的趨勢。2年中西葫蘆帶毒植株均于4月中旬開始出現(xiàn)（病株率333%～500%），而后西葫蘆帶毒株率逐漸提高，到5月下旬達到高峰，2014、2015年帶毒株率分別為3167%、3000%；2014、2015年瓜蚜則分別于4月上旬、3月下旬開始出現(xiàn)，但此時瓜蚜數(shù)量較低，平均蚜量分別僅為217、021頭/張；4月中旬以后瓜蚜數(shù)量迅速增長，5月下旬達到最高值，平均蚜量分別為2689、2311頭/張。

從西葫蘆病毒病發(fā)生與瓜蚜種群動態(tài)關(guān)系來看，瓜蚜沒有發(fā)生或發(fā)生數(shù)量較低時，西葫蘆植株不帶毒；隨著瓜蚜數(shù)量的增長，西葫蘆帶毒植株開始出現(xiàn)；瓜蚜進入迅速增長期后，西葫蘆帶毒株率亦呈上升趨勢，西葫蘆植株帶毒率的提高與瓜蚜種群動態(tài)的增長密切相關(guān)。

22西葫蘆日光溫室瓜蚜帶毒率檢測

室內(nèi)檢測結(jié)果顯示，春季日光溫室西葫蘆植株上，瓜蚜對黃瓜花葉病毒的帶毒率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢：3月下旬至4月上旬，日光溫室瓜蚜帶毒率為0，4月中、下旬，瓜蚜帶毒率小幅度上升（222%～1389%），5月中旬至下旬，瓜蚜帶毒率迅速升高，2014、2015年5月下旬瓜蚜帶毒率分別達 3611%、4556%（表1）。

23西葫蘆生長期罩網(wǎng)隔離瓜蚜對西葫蘆病毒病的控制效果

表2表明，日光溫室西葫蘆罩100目防蟲網(wǎng)，罩防蟲網(wǎng)時間越長，揭防蟲網(wǎng)后相同時間內(nèi)西葫蘆發(fā)病率越低。揭防蟲網(wǎng)后5 min采樣檢測，罩防蟲網(wǎng)40、30、20、10 d處理西葫蘆均未發(fā)病；揭防蟲網(wǎng)后10 d采樣檢測，罩防蟲網(wǎng)40、30、20 d處理的西葫蘆均未發(fā)病，罩防蟲網(wǎng)10 d處理的西葫蘆發(fā)病率為1667%，但4個處理無顯著差異；揭防蟲網(wǎng)后 20 d 采樣檢測，罩防蟲網(wǎng)40 d西葫蘆仍未發(fā)病，30 d處理的西葫蘆發(fā)病率為1667%，顯著低于罩防蟲網(wǎng)10、20 d處理（西葫蘆發(fā)病率10000%）；揭防蟲網(wǎng)后30 d采樣檢測，罩防蟲網(wǎng)40 d西葫蘆發(fā)病率為1667%，極顯著低于罩防蟲網(wǎng)10、20、30 d處理（西葫蘆發(fā)病率8333%～10000%）。

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在005水平上差異顯著，不同大寫字母表示在001水平上差異顯著。

3結(jié)論與討論

本研究表明，春季日光溫室西葫蘆植株瓜蚜數(shù)量呈逐漸增長趨勢，西葫蘆植株對黃瓜花葉病毒的帶毒率呈逐漸上升趨勢，西葫蘆黃瓜花葉病毒病的發(fā)生與瓜蚜種群動態(tài)密切相關(guān)，即蚜蟲密度達到一定程度后，會導(dǎo)致西葫蘆帶毒植株的出現(xiàn)并且發(fā)病率持續(xù)上升。春季日光溫室西葫蘆植株帶毒瓜蚜出現(xiàn)時間為4月中旬，之后帶毒率逐漸上升；西葫蘆帶毒株率出現(xiàn)時間為4月中旬，帶毒株率也呈上升趨勢，進一步說明日光溫室西葫蘆病毒病的發(fā)生與帶毒瓜蚜密切相關(guān)。

在日光溫室西葫蘆中，被黃瓜花葉病毒入侵的帶毒瓜蚜取食健康西葫蘆使西葫蘆植株帶毒，其他健康瓜蚜取食帶毒西葫蘆植株后又成為帶毒瓜蚜，這些帶毒瓜蚜取食過程中又引起其他健康西葫蘆植株發(fā)病，這種惡性循環(huán)會導(dǎo)致日光溫室西葫蘆帶毒率越來越高。因此，阻斷外來瓜蚜入侵和殺滅日光溫室內(nèi)部已有的瓜蚜是防控西葫蘆病毒病的關(guān)鍵。本研究表明，日光溫室西葫蘆生長期罩100目防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜，可有效降低西葫蘆植株帶毒率，西葫蘆植株受帶毒瓜蚜危害越晚，發(fā)病株率越低，進一步說明日光溫室罩防蟲網(wǎng)切斷外來帶毒瓜蚜的入侵，是防治日光溫室西葫蘆病毒病的有效措施之一。

本研究明確了日光溫室西葫蘆病毒病發(fā)生規(guī)律、發(fā)生規(guī)律與傳毒介體瓜蚜種群的動態(tài)關(guān)系及西葫蘆生長期罩防蟲網(wǎng)隔離瓜蚜對病毒病的防控效果，為西葫蘆病毒病的科學(xué)有效防治提供了理論依據(jù)。但要實現(xiàn)對日光溫室西葫蘆病毒病徹底有效的防治，尚須開展大量工作，須要加強對西葫蘆抗病毒品種選育，以及對西葫蘆病毒病、瓜蚜與寄主之間的互作關(guān)系，特別是瓜蚜對病毒病的傳毒機制等的深入研究。

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