ELISA方法在獻血者血液檢測中的應用及注意事項

邵家幼

【中圖分類號】R446.1 【文獻標識碼】B 【文章編號】2095-6851（2017）10--01

血液質量是當前輸血管理工作中一項重要課題。為了保證血液質量，確保臨床輸血安全有效，遏制經(jīng)血傳播疾病的發(fā)生，衛(wèi)生主管部門規(guī)定各采供血機構，應分別對獻血者采用ELISA法進行HBs—Ag、抗一HCV、抗一HIV、TP等各項指標的檢測，并制定了各種質量標準、操作規(guī)程和技術規(guī)范。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有敏感性高、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，是目前采供血機構對獻血者血液標本進行安全性指標檢測主要的方法。近年來，各種自動化檢測儀器設備在血站檢驗科得到了普遍應用，人員素質及檢測試劑質量不斷提高，檢驗質量得到了充分保證。但仍有一些困擾實驗室人員的問題需要注意及解決，現(xiàn)探討如下。

1 ELISA的基本原理

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種具有高特異性和高敏感性的實驗技術，幾乎所有的可溶性抗原一抗體系統(tǒng)均可用以檢測，它的最小可測值達ng甚至pg水平。該方法的基本原理如下：（1）將抗原或抗體結合到某種固相載體（目前以聚苯乙烯微量滴定板最為常用）表面，并保持其免疫活性。此步驟稱為“固相載體的包被”，在商品化試劑盒中均已完成。（2）再將抗原或抗體與某種酶（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）連接成酶標抗原或酶標抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。檢測時，按相應順序加入待檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或酶標抗體，使其與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應。以洗滌的方法洗去各步驟中過量的未結合物質，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。（3）最后加入酶反應的底物，底物即被酶催化生成有色產(chǎn)物，而有色產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定量分析。此種顯色反應可通過酶標儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。

2 ELISA的分類

ELISA方法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體。根據(jù)樣本中待測物質的種類及性質不同，可以設計出各種不同類型的檢測方法。臨床檢驗工作中用到的ELISA方法主要分為以下幾種類型：（1）用于檢測抗原的：雙抗體夾心法和競爭法；（2）用于檢測抗體的：雙抗原夾心法、間接法、競爭法及捕獲包被法等。

3 ELISA檢測的操作要點

在ELISA操作中有以下幾個步驟較為關鍵：（1）加樣：加樣要準確，試劑應垂直滴加，不得傾斜、人為的加大試劑量。使用一次性吸頭，防止交叉污染。定期校準加樣器。標本應加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要濺出及產(chǎn)生氣泡。（2）溫育：96孔酶標板結構特別，易產(chǎn)生邊緣效應，抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍孔與內部孔的升降溫速率不同，造成周邊與內部孔結果有差異。因此，溫育過程中應該用封板膜封閉整塊板，盡量避免邊緣效應的產(chǎn)生。溫箱溫度必須嚴格控制，溫育時間也應按說明書規(guī)定力求準確。（3）洗板：冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對結果影響較大，半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結果。洗滌時確認洗液注滿每個板孔，但不可溢出板孔，棄液后將孔內液體在吸水紙上拍干。為了洗滌效果更好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次，或適當增加洗板的次數(shù)。（4）顯色終止：顯色時間應嚴格按說明書的規(guī)定。應在顯色終止15min內進行酶標儀讀取。

4 ELISA檢測中常見問題

4.1 ELISA測定中存在的“灰區(qū)”問題

ELISA是一種定性試驗，必須在“陽性”與“陰性”之間有一條明確的分界線，也就是所謂的“陽性判斷值”（Cutoff），樣本的吸光度值（A）大于等于Cutoff值就判讀為陽性，否則則判讀為陰性。然而在實際工作中經(jīng)常會出現(xiàn)樣本的吸光度值（A）低于但接近Cutoff值的情況，即ELISA檢測中的“灰區(qū)”。對于這種情況，為輸血安全考慮，常常將這些血液報廢。在實際工作中可將“灰區(qū)”設在Cutoff值的70%，即對于樣本的吸光度值（A）在Cutoff值的70%到陽性判斷值之間的將其報廢。通過灰區(qū)的設定，血液安全能得到更好的保障。

4.2 “鉤狀效應”（Hookeffect）問題

“鉤狀效應”系指在一步法ELISA中，測定顯色隨著待測標本中抗原或抗體濃度的增加而升高至一定程度后，測定吸光度即隨抗原或抗體濃度的增加而開始下降直至不顯色，而出現(xiàn)假陰性結果的問題。在血液篩查中，有可能因“鉤狀效應”的存在而出現(xiàn)假陰性的主要是HBsAg和抗HIV的檢測。目前，國內HBsAg的檢測均為一步雙抗體夾心法，抗HIV有一些采用了雙抗原夾心法。盡管試劑生產(chǎn)廠家在固相和標記抗體或抗原的選擇匹配上，采取了結合位點遠離或含多個可結合位點的方法，在很大程度上，可以避免或減輕“鉤狀效應”，但如果某一批試劑外理不好或是特定的標本，仍有可能出現(xiàn)由“鉤狀效應”所致的假陰性。解決“鉤狀效應”的最好的辦法，就是采用兩步法試劑盒，其次就是對每一批試劑盒使用前，采用能得到的最強陽性的標本，進行有關“鉤狀效應”的質檢。

4.3 試劑盒的質檢、初檢和復檢試劑的選用

試劑盒從廠家到用戶手中，還會出現(xiàn)運輸和貯存過程中對試劑盒質量有影響的問題。因此，試劑盒在使用前必須進行質檢，質檢的重點包括試劑盒的有效期、測定下限、抗干擾能力以及對特殊標本的檢出能力等方面。如何選擇初、復檢試劑，也是值得注意的一個問題。比如，HCV感染者血循環(huán)中存在針對HCV不同蛋白的抗體，而具體針對某種蛋白抗體是否出現(xiàn)、出現(xiàn)的時間、持續(xù)時間長短均有所差異，因此，ELISA測定時所使用的包被抗原必須全面，才能有效地檢出所存在的抗體。但在實際工作中，由不同的抗HCVELISA試劑盒生產(chǎn)廠家所使用的HCV抗原的來源、質量及包被濃度各有差異，使測定中對同一份樣本所測定的結果有時會出現(xiàn)很大的差異，尤其是對較弱陽性的樣本或僅出現(xiàn)針對HCV單個蛋白成分的抗體的樣本。因此，在選擇初檢和復檢試劑盒時，最好選擇在測定不同HCV蛋白抗體上有互補性的試劑盒，從而最大程度的避免漏檢。

4.4 標本的影響

標本因素包括標本溶血、被污染、標本保存時間過長和標本凝固不全等。

4.4.1 標本溶血 血紅蛋白中含鐵血紅素有類過氧化物酶活性，因此以辣根過氧化物酶為標記的酶聯(lián)免疫吸附試驗測定中，如血清中血紅蛋白濃度較高，很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的辣根過氧化物酶反應顯色，造成假陽性。因此在采血過程中應注意，采集血液標本時應讓血液自動靠負壓注入試管以防標本溶血。

4.4.2 標本被污染 菌體可能含有內源性過氧化物酶，可出現(xiàn)非特異性顯色，因此宜用新鮮標本，如有特殊情況，應冰箱保存或冰凍保存，并應加蓋保存。

4.4.3 標本的保存 標本在冰箱中保存時間過長，可能造成污染或效價降低，可引起假陰性，因此應盡量用新鮮標本。冰凍標本應避免反復凍融，因冰凍標本的反復凍融產(chǎn)生的機械力對標本中的蛋白分子有破壞作用，可引起假陰性。

4.4.4 標本凝固不全 凝固不全的血清中有部分纖維蛋白原，影響結果。

4.5. 環(huán)境因素

實驗室環(huán)境也是保證結果可靠的因素之一，應做好以下控制：①通風、采光與防塵；②環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異，應使用系統(tǒng)空調進行控溫，并控制環(huán)境濕度在要求的范圍內；③消除噪音與電磁干擾；④實驗過程中應采用蒸餾水（純水）。

5 小結

ELISA檢測受多方面因素的影響，檢測人員應提高工作責任心，加強質量控制意識，努力學習業(yè)務理論知識，提高專業(yè)技術水平，不斷總結經(jīng)驗，避免人為因素對實驗結果的影響，加強各環(huán)節(jié)質量管理，嚴格控制關鍵控制點，保證血液檢驗分析前、分析中、分析后各階段質量，不斷改進提高檢驗質量，確保臨床輸血的安全性和有效性。endprint