基于HPLC-MSn和化學(xué)計(jì)量學(xué)的指紋圖譜在毛訶子鞣質(zhì)部位質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

陳文靜，梁文儀，李 師，吳玲芳，崔雅萍，亓 旗，葉 婷，梁林金，張?zhí)m珍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

基于HPLC-MSn和化學(xué)計(jì)量學(xué)的指紋圖譜在毛訶子鞣質(zhì)部位質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

陳文靜，梁文儀，李 師，吳玲芳，崔雅萍，亓 旗，葉 婷，梁林金，張?zhí)m珍＊

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的：建立毛訶子鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜。方法：采用Atlantic T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30℃。采用相似度軟件和SPSS、SIMCA軟件對(duì)11批毛訶子鞣質(zhì)部位的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析。結(jié)果：標(biāo)定出20個(gè)共有峰。結(jié)果顯示11批毛訶子鞣質(zhì)部位相似度在0.832-0.973之間，只有新疆產(chǎn)地藥材的鞣質(zhì)部位的相似度在0.9以下。聚類分析將鞣質(zhì)部位大致分為3類，與主成分分析結(jié)果一致。偏最小二乘判別分析找到1、13和14號(hào)峰可能是鑒別毛訶子樣品最主要的色譜峰。采用HPLC-MSn方法總結(jié)出毛訶子鞣質(zhì)部位中14個(gè)化合物的液質(zhì)信息。結(jié)論：將毛訶子鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)采用化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法進(jìn)行分析，方法快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可作為藏藥毛訶子鞣質(zhì)部位質(zhì)量控制有效方法之一。

毛訶子 鞣質(zhì)部位 化學(xué)計(jì)量學(xué) 指紋圖譜

毛訶子始載于《新修本草》，是使君子科植物毗黎勒 Terminalia billerica（Gaertn.）Roxb.的干燥成熟果實(shí)[1]。又名均保奈、噶拉珠瑪、作貝相、莫合、如卡、次木西、巴那、納合、曼吉德，都離、帕肉拉等[2]，是常用藏藥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，毛訶子具有抗氧化、降血栓、抗糖尿病等多種藥理活性[3-5]。

毛訶子主要含有鞣質(zhì)類成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明鞣質(zhì)類成分具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗菌等藥理活性[6-9]，與毛訶子藥理作用基本一致。本課題組前期報(bào)道了不同產(chǎn)地毛訶子藥材的指紋圖譜和4個(gè)主成分含量測(cè)定[10]，發(fā)現(xiàn)成分含量的差異性較大，為減少藥材產(chǎn)地帶來(lái)的質(zhì)量差異、擴(kuò)大藥材產(chǎn)地來(lái)源，本課題組采用大孔樹脂富集工藝對(duì)毛訶子鞣質(zhì)部位進(jìn)行了富集純化，鞣質(zhì)部位含量均能達(dá)到50%以上。本實(shí)驗(yàn)建立了毛訶子鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜，采用HPLC-MSn和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法進(jìn)行研究，對(duì)所收集的11批毛訶子鞣質(zhì)部位進(jìn)行聚類分析、主成分分析、偏最小二乘分析，為毛訶子的開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（2487型DAD檢測(cè)器，Breeze軟件）；25 μL進(jìn)樣器（國(guó)別+公司全稱）；LTQOrbitrap高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；HWs26型電熱恒溫水浴鍋（常州榮華儀器有限公司）。

試藥：沒食子酸（批號(hào)141109）購(gòu)自成都普菲德生物科技有限公司、柯里拉京（批號(hào)15101404）、鞣花酸（批號(hào)15091807）均購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%。乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。毛訶子藥材分別購(gòu)自北京市藏醫(yī)院、安徽亳州藥材市場(chǎng)和河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系劉春生教授鑒定為使君子科植物毗黎勒Terminalia billerica（Gaertn.）Roxb.的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[10]

色譜柱：Atlantic T3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%乙酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0-20 min，5%-10%A；20-30 min，10%-15%A；30-60 min，15%-20%A；60-75 min，20%-25%A；75-85 min，25%-50%A；85-95 min，50%-90%A。流速：1 mL·min-1，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對(duì)照品5.01 mg，柯里拉京對(duì)照品3.04 mg于10 mL量瓶中加50%甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度分別為0.501、0.304 mg·mL-1；另精密稱取鞣花酸對(duì)照品4.22 mg，于10 mL量瓶中加DMSO溶解稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度為0.422 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

按照毛訶子鞣質(zhì)部位提取純化工藝制備各產(chǎn)地毛訶子鞣質(zhì)部位，稱取毛訶子鞣質(zhì)部位粉末約5 mg，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，待分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取毛訶子鞣質(zhì)部位（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。選擇12號(hào)峰為參照峰，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.08%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%，表明儀器精密度良好。

表1 鞣質(zhì)部位藥材產(chǎn)地

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取毛訶子鞣質(zhì)部位（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在制樣后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣。以12號(hào)峰為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)的RSD均小于1.01%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性考察

取毛訶子鞣質(zhì)部位（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣。以12號(hào)峰為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.63%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.95%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 毛訶子鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

分別取11批毛訶子鞣質(zhì)部位，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定。采用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）對(duì)11批毛訶子鞣質(zhì)部位色譜數(shù)據(jù)（圖1）進(jìn)行分析。標(biāo)定共有峰20個(gè)，選擇峰面積較大且穩(wěn)定存在的12號(hào)峰鞣花酸為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。毛訶子鞣質(zhì)部位以S1樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，相似度在0.832-0.973之間（表2），表明各產(chǎn)地鞣質(zhì)部位均有良好的相似性。

圖1 不同批次毛訶子鞣質(zhì)部位HPLC指紋圖譜

表2 11個(gè)批次毛訶子鞣質(zhì)部位指紋圖譜相似度結(jié)果

2.6 HPLC-MSn法指認(rèn)毛訶子鞣質(zhì)部位主要色譜峰

采用已報(bào)道毛訶子藥材的HPLC-MSn質(zhì)譜條件進(jìn)行負(fù)離子模式檢測(cè)[10]，根據(jù)毛訶子鞣質(zhì)部位總離子流圖（見圖2）各色譜峰的保留時(shí)間和各色譜峰的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，并結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)和對(duì)照品圖譜，初步推斷出14個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

圖2 毛訶子鞣質(zhì)部位總離子流圖

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 聚類分析

以相似度評(píng)價(jià)所標(biāo)定的20個(gè)共有峰的峰面積為變量，采用IBM SPSS22.0軟件對(duì)毛訶子鞣質(zhì)部位進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。由聚類分析結(jié)果可知，毛訶子鞣質(zhì)部位大致分為3大類，I類包括S3、S4、S6；I類包括S8、S11、S2、S9，S1，S10，S7；III類包括S5，結(jié)果見圖3。結(jié)合相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果與聚類分析結(jié)果較為一致。

2.7.2 主成分分析

以11批毛訶子鞣質(zhì)部位的20個(gè)共有峰的峰面積為變量，使用IBM SPSS 22.0和SIMCA-P+11分析軟件進(jìn)行主成分分析。以主成分的特征根和貢獻(xiàn)率作為選擇主成分的依據(jù)，提取到6個(gè)主成分的特征根大于1的主成分，且它們的累積方差貢獻(xiàn)率大于91.814%。PCA碎石圖可以看出率先提取出來(lái)的6個(gè)主成分的坡度較為陡峭。說明所提取的6個(gè)主成分可以代表毛訶子鞣質(zhì)部位的質(zhì)量。6個(gè)主成分特征值分別為5.454、4.218、3.308、2.192、1.798、1.392，方差貢獻(xiàn)率分別為27.272%、21.091%、16.541%、10.961%、8.990%、6.959%。用SIMCA-P+11分析軟件得到PCA得分圖，可以看出樣品被分為3類，與聚類分析結(jié)果一致。結(jié)果見圖4。

毛訶子鞣質(zhì)部位主成分分析的公共因子載荷矩陣見表4，每一個(gè)載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)，經(jīng)計(jì)算可得主成分的模型如下：

F1=0.0788x1+0.0069x2+0.1276x3-0.1923x4+0.3344x5+0.2950x6-0.2368x7+0.1118x8+0.2424x9+0.3066x10-0.2616x11+0.2826x12-0.3199x13+0.1396x14+0.0505x15+0.2458x16+0.3259x17+0.1619x18+0.2261x19+0.0625x20

F2=-0.3029x1+0.2274x2+0.3462x3+0.2990x4-0.2094x5-0.0764x6+0.0769x7+0.3725x8+0.0419x9+0.1665x10+0.3287x11+0.2405x12+0.2892x13+0.1568x14+0.0180x15+0.2021x16+0.2103x17+0.1315x18+0.0234x19-0.2147x20

表3 毛訶子鞣質(zhì)部位化學(xué)成分HPLC-MSn數(shù)據(jù)

圖3 11個(gè)批次毛訶子鞣質(zhì)部位聚類分析結(jié)果

F3=0.3255x1+0.4014x2+0.1985x3+0.3392x4+0.1820x5+0.2425x6+0.3684x7+0.0737x8+0.0462x9-0.2782x10-0.0247x11+0.0088x12-0.0654x13-0.3057x14-0.1787x15+0.1688x16+0.0203x17-0.1380x18+0.0434x19+0.2936x20

F4=0.0601x1+0.1486x2-0.0027x3-0.0817x4+0.1196x5-0.1702x6+0.0905x7-0.3553x8+0.4208x9-0.1013x10+0.1945x11-0.2864x12+0.0432x13+0.4438x14-0.4242x15+0.1587x16+0.0142x17+0.2796x18-0.0176x19-0.0176x20

圖4 主成分分析結(jié)果

F5=-0.2506x1+0.1775x2-0.3721x3+0.0336x4-0.0395x5+0.2588x6+0.2297x7+0.0887x8+0.3706x9+0.0895x10+0.1894x11-0.2215x12+0.0552x13-0.0679x14+0.3893x15+0.4020x16-0.1797x17-0.0224x18+0.0328x19+0.2282x20

F6=0.1373x1-0.0907x2+0.0873x3+0.0949x4+0.0865x5-0.0432x6+0.0568x7+0.0687x8-0.0407x9-0.1399x10-0.0127x11-0.0924x12-0.1449x13-0.0322x14+0.3356x15-0.0339x16+0.2229x17+0.5272x18-0.6645x19+0.0627x20

表4 公共因子載荷矩陣結(jié)果

圖5 PLS-DA結(jié)果

F1、F2、F3、F4、F5、F6分別表示6個(gè)主成分，其中F1是第一主成分，是“信息量”最多的峰。第一主成分中各色譜峰系數(shù)的大小反映了成分貢獻(xiàn)率的大小，前5名變量對(duì)應(yīng)的色譜峰分別是：5、17、10、6、12號(hào)色譜峰，通過與對(duì)照品比對(duì)確定10號(hào)共有峰為訶子鞣酸，6號(hào)共有峰為柯里拉京，12號(hào)共有峰為鞣花酸，5、17號(hào)共有峰待指認(rèn)。

2.7.3 偏最小二乘判別分析

采用SIMCA-P+11軟件對(duì)11批樣品色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析，結(jié)果見圖5。PLS-DA得分圖可以看出11批樣品被分為3類，與聚類分析和主成分分析結(jié)果相一致。PLS-DA還常用于尋找區(qū)分不同批次樣品的化學(xué)成分。在PLS-DA模型中，VIP圖可反映出每個(gè)峰的貢獻(xiàn)程度，并從高到低進(jìn)行排序。以VIP值大于1.2為標(biāo)準(zhǔn)，1、14、13號(hào)峰可能是鑒別毛訶子樣品最主要的色譜峰，經(jīng)指認(rèn)1號(hào)峰為沒食子酸。

3 總結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)選擇的11批毛訶子鞣質(zhì)部位的相似度在0.832-0.973之間，只有新疆產(chǎn)地制備的鞣質(zhì)部位在0.9以下，表明不同產(chǎn)地的毛訶子鞣質(zhì)部位具有一定的差異性，但大多數(shù)具有較好的相似性。與藥材相比，鞣質(zhì)部位的相似度發(fā)生變化，可能是由于提取過程中成分的部分水解造成的。

主成分分析得分圖和偏最小二乘判別分析得分圖均將樣品被分為3類，與聚類分析結(jié)果較為一致，表明說明聚類分析與主成分分析和偏最小二乘判別分析的結(jié)合能對(duì)指紋圖譜進(jìn)行更好地識(shí)別。本實(shí)驗(yàn)指認(rèn)共有峰中的沒食子酸，柯里拉京，鞣花酸等成分，藥理實(shí)驗(yàn)研究表明這些成分具有良好的抗氧化，護(hù)肝活性，與毛訶子的藥理活性一致而且含量較高，可作為毛訶子的主要指標(biāo)成分。

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Quality Evaluation of Terminalia billerica(Gaertn.)Roxb.Tannins Fraction from Different Habitats by HPLC Fingerprint Based on HPLC-MSnand Chemometrics

Chen Wenjing,Liang Wenyi,Li Shi,Wu Lingfang,Cui Yaping,Qi Qi,Ye Ting,Liang Linjin,Zhang Lanzhen
(School of Chinese Pharmacology,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China)

This paper was aimed to establish the HPLC fingerprint of T.Billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction.The analysis was performed on Atlantic T3(250 mm × 4.6 mm,5 μm)C18 column.The mobile phase was acetonitrile-0.2%glacial acetic acid aqueous solution with gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The injection size was 20 μL.The temperature was maintained at 30℃.Eleven batches of T.Billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction of chromatographic data was analyzed by similarity of chromatographic data,SPSS software and SIMCA software.There were 20 common peaks in the diagram.The similarity analysis of 11 samples revealed that the similarities were between 0.832 and 0.973.Only the similarity of tannin parts from Xinjiang was below 0.9.The cluster analysis classified the tannin parts into 3 types,which shared the similar results as the principal components analysis(PCA).PLS-DA found that peak 1,13 and 14 may be the main chromatographic peaks to identify tannins fraction.The HPLC-MSninformation of 14 compounds in T.billerica(Gaertn.)Roxb.was summarized.It was concluded that chemometrics analysis method can be used to analyze the HPLC fingerprint of T.billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction.This method was rapid,simple,and reproducible.It can be used as one of the effective methods for the quality control of T.billerica(Gaertn.)Roxb.tannin fraction.

Terminalia billerica(Gaertn)Roxb.,tannin parts,chemometrics,HPLC,fingerprints

10.11842/wst.2017.07.024

R917

A

2017-05-02

修回日期：2017-06-01

＊ 通訊作者：張?zhí)m珍，本刊編委，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制研究。

（責(zé)任編輯：陳 寧，責(zé)任譯審：王 晶）