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    SMCC在不同溶液中的降解行為研究

    2017-10-25 07:33:07姚君亮
    上海醫(yī)藥 2017年19期
    關(guān)鍵詞:水解

    姚君亮

    摘 要 目的:研究SMCC在不同溶液中的降解情況。方法:將SMCC分別用ACN、DMA和DMSO等有機(jī)溶劑溶解并制成一定濃度(約3 mg/ml)的儲備液,再用不同的緩沖液稀釋10倍并混勻作為供試品溶液,采用高效液相色譜法觀察主峰的降解情況。結(jié)果:對于SMCC的水解,堿性環(huán)境以及DMSO或DMA的存在有顯著的促進(jìn)作用,而酸性環(huán)境以及ACN的存在則有一定的抑制作用。結(jié)論:交聯(lián)反應(yīng)可在弱堿環(huán)境下以DMA/DMSO作溶劑,而色譜分析則可在酸性環(huán)境下以ACN作溶劑。

    關(guān)鍵詞 SMCC ADC 水解 HPLC

    中圖分類號:TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1006-1533(2017)19-0073-05

    A study on degradation behavior of SMCC in different solutions

    YAO Junliang*

    (Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd., Shanghai 201203, China)

    ABSTRACT Objective: To investigate the degradation phenomenon of SMCC in different solutions. Methods: Stock solutions of SMCC were prepared in ACN, DMA and DMSO, respectively, to give a final concentration of 3 mg/ml. Working solutions were prepared by 10-fold dilution of stock solutions in several buffer solutions. The degradation of SMCC was monitored by an HPLC method. Results: The hydrolysis of SMCC could be accelerated with the introduction of basic buffer solution or DMA/DMSO, while it could be hindered with the introduction of acidic solution or ACN. Conclusion: Cross-linking reaction could be performed in weakly alkaline condition by using solvent of DMA/DMSO, while HPLC analysis could be carried out in acidic condition by using solvent of ACN.

    KEY WORDS SMCC; ADC; hydrolysis; HPLC

    抗體-藥物偶聯(lián)劑(antibody-drug conjugates, ADC),是由單克隆抗體和化學(xué)藥物分子偶聯(lián)而成的新型生物制劑[1-3],是近年來發(fā)展迅速的一類腫瘤靶向治療藥物[4-5]。ADC通常由一個抗體(antibody),一個彈頭藥物(cytotoxic drug)和一個活性連接子(linker)組成[6](圖1)。其中,連接子通常需要具備以下特性:一是進(jìn)入目標(biāo)細(xì)胞前能夠保證ADC在血漿中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;二是進(jìn)入細(xì)胞后能夠使藥物順利釋放[7-8]。按照細(xì)胞中的藥物釋放行為,可將連接子分為兩大類:可剪切型(Cleavable Linkers)和非剪切型(Non-cleavable Linkers)[9]。前者通過細(xì)胞內(nèi)化學(xué)環(huán)境的變化或酶解作用使其與藥物間的化學(xué)鍵斷裂,從而釋放完整的藥物分子;而后者則是通過蛋白酶的水解作用將抗體部分降解,剩余的藥物分子上通常依然保留著連接子和部分氨基酸殘基[7]。目前僅有的兩個批準(zhǔn)上市的ADC藥物,Adcetris[10]和Kadcyla[11],分別采用了可剪切型連接子vc(valine-citrulline)和非剪切型連接子琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-1羥酸酯(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)。本文將以SMCC為研究對象進(jìn)行相關(guān)的試驗(yàn)和討論。

    Kadcyla(T-DM1)原研藥廠Genentech曾對多個連接子進(jìn)行了篩選,最終SMCC脫穎而出,這也說明其在T-DM1中有獨(dú)到之處[12]。如圖2所示,SMCC主要由三部分組成:右側(cè)為NHS(N-琥珀酰亞胺)活性酯,負(fù)責(zé)與抗體分子中的伯胺生成酰胺鍵結(jié)合;左側(cè)為馬來酰亞胺基,負(fù)責(zé)與藥物分子中的巰基發(fā)生特異性交聯(lián)結(jié)合;中間為環(huán)己烷,可通過位阻效應(yīng)降低其水解作用[7]。雖然其結(jié)構(gòu)特征和交聯(lián)機(jī)理已得到了廣泛的研究[13-14],但有關(guān)其交聯(lián)反應(yīng)化學(xué)環(huán)境以及色譜分析條件的研究卻鮮見報端。因此,本文通過分析化學(xué)的手段初步模擬探討了SMCC在各種介質(zhì)中的穩(wěn)定性,以期對交聯(lián)工藝的篩選和優(yōu)化以及分析和檢測方法的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    SMCC(博瑞生物醫(yī)藥(蘇州)股份有限公司,批號:20150812);乙腈(Fisher,HPLC級,批號:158031,ACN);磷酸(Sigma,HPLC級,批號:STBF-7157V);DMA(Sigma,99.8%,批號:SHBG0465V);DMSO(Merck,HPLC級,批號:K46802100530);其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,純度為AR或GR;水為自制高純水。endprint

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    XS105DU電子天平(梅特勒),PB-10酸度計(賽多利斯),高效液相色譜儀(Agilent 1260 Infinity)。

    1.3 方法

    1.3.1 色譜條件

    色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(規(guī)格:4.6 mm×250 mm,5 mm),流動相A為0.05%的磷酸水溶液、B為乙腈,洗脫梯度見表1。柱溫30 ℃,流速1.0 ml/min,

    1.3.2 樣品制備與測定方法

    1)SMCC母液 取SMCC樣品約60 mg,精密稱定,置于20 ml容量瓶中,用乙腈/DMA/DMSO(視考察條件而定)溶解并稀釋至刻度,混勻后備用。

    3)測定方法 用移液管準(zhǔn)確移取SMCC母液適量,再用PBS緩沖液稀釋10倍(SMCC濃度為0.3 mg/ml),混勻后迅速進(jìn)樣,記錄色譜圖,每隔0.5 h進(jìn)樣1次,觀察SMCC隨著時間的變化情況。

    4)計算和作圖 將所得圖譜中色譜峰的峰面積與0 h時主峰的峰面積進(jìn)行對比,以所得比值對時間(h)作圖,觀察主峰/雜峰的相對含量隨時間的變化趨勢。

    2 結(jié)果

    SMCC在常溫下不吸潮,不溶于水、甲醇和乙醇,易溶于乙腈,DMSO,DMA等有機(jī)溶劑。SMCC和抗體交聯(lián)時需要在水溶液中進(jìn)行,所以先要用有機(jī)溶劑制成母液,待反應(yīng)時再加入反應(yīng)液。本研究采用若干有機(jī)溶劑聯(lián)合PBS水溶液,模擬考察其在交聯(lián)環(huán)境中的降解情況。

    2.1 SMCC在DMA-H2O/PBS中的變化

    將DMA配制的SMCC母液分別用緩沖液A、B、C和H2O稀釋10倍后,在樣品瓶中連續(xù)進(jìn)樣,記錄SMCC主峰面積的變化情況,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示(圖中緩沖液A、B、C和H2O中情況分別用■、●、△和▼表示)。由圖3可知,SMCC在四種溶液體系里都發(fā)生了明顯的降解,而程度卻明顯不同:在DMAbuffer A和DMA-H2O中降解較緩慢,而在DMA-buffer B和DMA-buffer C中降解極為顯著。上述結(jié)果初步說明SMCC對堿性PBS環(huán)境極其敏感,中性次之,酸性最惰。同時,Buffer B和C的情況說明,鉀和鈉離子類型對其降解影響甚微。

    2.2 SMCC在ACN/DMX/H2O中的變化

    為了進(jìn)一步闡明SMCC的降解機(jī)制,我們也研究了其在不含PBS緩沖液時主峰的變化。如圖4所示,SMCC在ACN-DMA和ACN-H2O體系中穩(wěn)定無降解,而在DMA-H2O和DMSO-H2O均出現(xiàn)了明顯降解。說明在無水參與時,SMCC在上述有機(jī)溶劑中至少6 h內(nèi)穩(wěn)定;有水參與時,ACN條件下依然穩(wěn)定,而DMA和DMSO條件下不穩(wěn)定。因此可以推斷ACN能夠抑制SMCC在水中降解,而DMA和DMSO則促進(jìn)其降解,說明SMCC在水中的降解跟母液溶劑有很大的關(guān)系。

    2.3 SMCC在ACN-PBS中的變化

    在得知ACN可能會抑制SMCC在純水中的降解之后,我們又對酸性和堿性PBS緩沖液中的情況進(jìn)行了對比研究(圖5)。從圖5可以看出,SMCC在ACN-buffer A中基本無降解,在ACN-buffer B和ACN-buffer C中降解劇烈??梢夾CN的存在的確可以抑制SMCC的降解,只不過在酸性至中性條件下顯著,堿性條件下不明顯。

    2.4 SMCC在ACN-NH4 PBS中的變化

    對于PBS緩沖鹽的選擇,除了上述實(shí)驗(yàn)用到的鉀鹽和鈉鹽之外,我們也考察了銨鹽(Buffer D和E)對SMCC降解的影響。圖6中的(●)和(▲)分別表示ACN-buffer D和ACN-buffer E中SMCC主峰的變化趨勢。與ACN-H2O(■)中相比,SMCC在pH 4.0的ACNNH4 PBS體系中出現(xiàn)了較為明顯的降解,而當(dāng)磷酸銨鹽的pH為7.0時,SMCC發(fā)生了劇烈降解,在1 h內(nèi)主峰甚至完全消失。這一結(jié)果表明,銨鹽對SMCC穩(wěn)定性的影響要遠(yuǎn)大于鉀鹽和鈉鹽,因此可以推斷銨離子或游離氨可能直接參與了其降解反應(yīng)。

    2.5 SMCC降解雜質(zhì)統(tǒng)計

    上述實(shí)驗(yàn)中我們主要考察了SMCC在多種溶液環(huán)境中主峰的變化趨勢,在此本文將進(jìn)一步對其降解雜質(zhì)進(jìn)行簡單的研究。表2中列出了各降解實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生雜質(zhì)的相對保留時間,結(jié)果表明SMCC的降解雜質(zhì)主要有4種,相對保留時間分別為0.16,0.42,0.60和0.67,我們依次命名為Imp-1,Imp-2,Imp-3和Imp-4。為了更直觀地展示降解情況,我們將各條件下反應(yīng)2 h后SMCC主峰和雜質(zhì)峰的含量作柱形圖對比(圖7)。圖中顯示,除了DMA-ACN、ACN-H2O和ACN-buffer A之外,SMCC在其他條件下均有降解,只是雜質(zhì)產(chǎn)生情況各有不同,說明其在不同溶液中的降解機(jī)理可能有所差異。endprint

    3 討論

    如前所述,我們通過高效液相色譜法分別研究了SMCC在多種溶液環(huán)境中的降解情況??傮w來看,其降解反應(yīng)只在有水相存在時才會發(fā)生,因此可以推斷該反應(yīng)屬于水解反應(yīng),這一點(diǎn)也可以通過其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)加以印證。SMCC分子中兩側(cè)的NHS酯和馬來酰亞胺都可以在一定條件下發(fā)生水解,從而阻礙交聯(lián)進(jìn)程,因此在與抗體和藥物交聯(lián)時要盡量控制SMCC的水解程度。

    實(shí)驗(yàn)中,我們引入了不同的有機(jī)溶劑(DMA,DMSO,can)、水和緩沖溶液(buffer A-F),所有最終的反應(yīng)液中均含90%的水相和10%的有機(jī)相。結(jié)果表明SMCC的水解不僅與水相有關(guān),也和有機(jī)相密切相關(guān),當(dāng)有機(jī)相為DMA/DMSO,水相為堿性時,水解更容易發(fā)生。推測可能是因?yàn)镈MA/DMSO在NHS酯水解過程中起催化劑的作用,而堿性則利于水解反應(yīng)平衡的正向移動。

    不同的反應(yīng)產(chǎn)生不同的雜質(zhì),因此可以根據(jù)雜質(zhì)類型逆推水解機(jī)制。配合表2和圖7,我們可以大致將反應(yīng)類型分為以下幾類:①只生成Imp-1和Imp-4的反應(yīng),推測可能是NHS酯的水解,因?yàn)槠浠钚暂^馬來酰亞胺強(qiáng),在弱酸性至中性時就可以發(fā)生;②同時生成Imp-1、Imp-3和Imp-4的反應(yīng),推測可能是NHS酯和馬來酰亞胺同步水解的反應(yīng),因?yàn)樵趬A性較強(qiáng)時出現(xiàn),強(qiáng)堿環(huán)境突破馬來酰亞胺的穩(wěn)定臨界點(diǎn),其水解動力學(xué)曲線非線性亦側(cè)面折射出可能為兩步反應(yīng);③出現(xiàn)雜質(zhì)Imp-2的反應(yīng),可能是NH3參與的酰胺化反應(yīng),因?yàn)樵趐H 7.0的銨溶液中含量極高,而在其他條件下均未出現(xiàn)。由于本研究旨在探討適宜的檢測和交聯(lián)環(huán)境,并非研究詳細(xì)的降解機(jī)理,因此未對各雜質(zhì)做進(jìn)一步的鑒定研究。

    綜上所述,對于交聯(lián)過程來說,一方面應(yīng)避免強(qiáng)堿和銨鹽環(huán)境,以防水解過快而無法交聯(lián);另一方面也不宜在酸性條件進(jìn)行,使得SMCC活性低交聯(lián)困難。同時有機(jī)助溶劑則宜采用DMA和DMSO等既不易使蛋白變性又能高效溶解SMCC的溶劑。對于色譜分析來說,稀釋劑宜采用ACN等溶解度高且有利于SMCC結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的溶劑,流動相則宜控制在酸性,不可用銨鹽。此外,我們在實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn),SMCC在反應(yīng)時需注意其濃度和環(huán)境溫度,在溫度較低濃度較高時容易產(chǎn)生絮狀沉淀,大大影響反應(yīng)進(jìn)程。

    參考文獻(xiàn)

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