重組人胸腺素β4生物學(xué)活性測(cè)定方法的建立

徐宏偉，張俊英，馬杉姍，湯曉闖，馬素永，2，聶李亞，2，許松山，2

1.北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司，北京 100085；2.北京市裸質(zhì)?；蛑委熕幬锕こ碳夹g(shù)研究中心，北京 100085

技術(shù)方法

重組人胸腺素β4生物學(xué)活性測(cè)定方法的建立

徐宏偉1，張俊英1，馬杉姍1，湯曉闖1，馬素永1，2，聶李亞1，2，許松山1，2

1.北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司，北京 100085；2.北京市裸質(zhì)粒基因治療藥物工程技術(shù)研究中心，北京 100085

目的：建立適用于重組人胸腺素β4（rhTβ4）體外質(zhì)量控制的生物學(xué)活性測(cè)定方法，用于該制品的生物學(xué)活性評(píng)價(jià)。方法：利用ECV304細(xì)胞遷移法，摸索細(xì)胞密度、玻連蛋白（Vn）濃度、rhTβ4濃度等影響因素，并對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化及方法驗(yàn)證。結(jié)果：細(xì)胞密度為0.5×104/孔、Vn濃度為12.5 μg/mL、rhTβ4濃度為200 nmol/L、孵育時(shí)間24 h和細(xì)胞遷移時(shí)間4 h時(shí)，細(xì)胞遷移率較高。結(jié)論：建立了rhTβ4生物學(xué)活性測(cè)定方法，該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高，可用于rhTβ4生物學(xué)活性測(cè)定。

重組人胸腺素β4；活性檢測(cè)；細(xì)胞遷移

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一種在多種組織均有表達(dá)的多肽，廣泛分布于各組織、器官和細(xì)胞中，作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)一種主要的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)分子，對(duì)受損組織的再生、重塑和愈合起重要作用[1-2]。研究表明，Tβ4具有多方面生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)創(chuàng)傷區(qū)域表皮的細(xì)胞遷移、血管的生成和膠原沉積，具有消炎和促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的功效，在治療皮膚、角膜創(chuàng)傷，心肌梗死，抗腫瘤等方面有著廣闊的應(yīng)用前景[3-5]。

目前Tβ4的制備方法有化學(xué)合成和基因工程兩種，化學(xué)合成方法成本較高，而利用基因工程技術(shù)獲得重組人Tβ4（recombinant human Tβ4，rhTβ4），并將其開(kāi)發(fā)成為治療用生物制品Ⅰ類(lèi)新藥，具有成本低、技術(shù)成熟、可大量生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)。

由于沒(méi)有已上市品種的參照，因此需要從頭建立rhTβ4的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的重要指標(biāo)，生物學(xué)活性檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化尤為必要。文獻(xiàn)報(bào)道的Tβ4活性檢測(cè)方法多種多樣：Tβ 4可促進(jìn)多種細(xì)胞（如臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞及皮膚角化細(xì)胞）遷移；Tβ4具有促進(jìn)血管生成的作用，可在E-玫瑰花結(jié)實(shí)驗(yàn)中觀察其免疫活性[6-8]。本實(shí)驗(yàn)室在表達(dá)rhTβ4的基礎(chǔ)上，建立、優(yōu)化并驗(yàn)證了采用臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)定rhTβ4生物學(xué)活性的方法，為rhTβ4的進(jìn)一步藥用開(kāi)發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304和rhTβ4供試品由北京諾思蘭德生物技術(shù)股份有限公司保存或制備。DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青工程材料有限公司）；玻連蛋白（vit?ronectin，Vn）（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；Transwell（孔徑 8 μm）（Corning公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，接種密度為1×104/孔，24 h后將培養(yǎng)液替換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)過(guò)夜。棄掉培養(yǎng)液，加入新鮮的含5%胎牛血清和160 nmol/L rhTβ4的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞遷移

用100 μg/mL Vn溶液包被24孔細(xì)胞遷移板并孵育2 h，棄上清，加入同體積的含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培養(yǎng)基，再用含0.1%BSA的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至適宜的細(xì)胞密度，將細(xì)胞加入Transwell的上室培養(yǎng)4 h。用95%甲醇/5%PBS固定5 min，然后擦除遷移孔內(nèi)膜表面未遷移的細(xì)胞，染色5 min，漂洗干凈。以細(xì)胞遷移指數(shù)（實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)的比值）來(lái)判定本品對(duì)細(xì)胞遷移的作用，選用光學(xué)顯微鏡低倍物鏡（×4）選取細(xì)胞分布均勻的視野區(qū)域，再在20倍物鏡下用目鏡中附加的網(wǎng)格隨機(jī)挑選5個(gè)視野（鐘表圓心和3、6、9、12點(diǎn)位置）進(jìn)行拍照，用IPP軟件統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞，取其平均值為該孔的計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.4 細(xì)胞遷移中重要影響因素的篩選

對(duì)細(xì)胞密度、Vn濃度和rhTβ4濃度在細(xì)胞遷移中的影響進(jìn)行篩選。分別設(shè)定細(xì)胞密度為5×104、1×104和 0.5×104/孔，Vn 濃度為 25、50 和 100 μg/mL，rhTβ4濃度為0、1.6、16和160 nmol/L，根據(jù)上述細(xì)胞遷移方法進(jìn)行篩選。

1.5 細(xì)胞遷移試驗(yàn)條件的優(yōu)化

采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行細(xì)胞遷移試驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要影響因素包括細(xì)胞密度、rhTβ4濃度和Vn濃度，每個(gè)因素分為3個(gè)水平，具體試驗(yàn)條件見(jiàn)表1。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表

1.6 專(zhuān)屬性測(cè)定

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定實(shí)驗(yàn)條件為細(xì)胞密度 0.5×104/孔、rhTβ4濃度 200 nmol/L、Vn濃度12.5 μg/mL、rhTβ4孵育時(shí)間24 h、細(xì)胞遷移時(shí)間4 h，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？疾斐善份o料對(duì)rhTβ4活性的干擾，實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置對(duì)照組、供試品組和成品輔料組，分別進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。

1.7 重復(fù)性測(cè)定

選用與專(zhuān)屬性測(cè)定同樣的試驗(yàn)條件。將供試品分別采用3株細(xì)胞并在同樣代次下重復(fù)檢測(cè)3次，連續(xù)測(cè)定3個(gè)細(xì)胞代次，然后分別計(jì)算重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果的平均值和變異系數(shù)（CV）。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：同時(shí)復(fù)蘇3株細(xì)胞，分別傳至第3代，進(jìn)行批內(nèi)3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；取上述細(xì)胞的其中1支繼續(xù)傳代，分別于細(xì)胞的第4代和第5代進(jìn)行批間3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)；不同批次的成品和原液分別測(cè)定3次；分別計(jì)算批內(nèi)、批間重復(fù)性和不同樣品的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果的平均值和CV。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遷移中重要影響因素的篩選結(jié)果

2.1.1 細(xì)胞密度篩選結(jié)果 在細(xì)胞遷移試驗(yàn)中不同細(xì)胞密度的試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。細(xì)胞密度為0.5×104/孔時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞遷移數(shù)目差異顯著，而細(xì)胞密度為5×104/孔和1×104/孔時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組差異不顯著。

2.1.2 Vn濃度篩選結(jié)果 在細(xì)胞遷移試驗(yàn)中不同Vn密度的試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。Vn濃度為25 μg/mL時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞遷移數(shù)目差異顯著，而Vn濃度為100和50 μg/mL時(shí)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組差異不顯著。

2.1.3 rhTβ4濃度篩選結(jié)果 在細(xì)胞遷移試驗(yàn)中不同rhTβ4濃度的試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。細(xì)胞遷移指數(shù)隨rhTβ4濃度升高而增大，rhTβ4濃度為160 nmol/L時(shí)細(xì)胞遷移指數(shù)最大。

圖1 不同細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞遷移數(shù)的影響

圖2 不同Vn濃度對(duì)細(xì)胞遷移數(shù)的影響

圖3 不同rhTβ4濃度對(duì)細(xì)胞遷移數(shù)的影響

2.2 細(xì)胞遷移試驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了細(xì)胞密度、Tβ4濃度、Vn濃度等3個(gè)因素。細(xì)胞遷移指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，在細(xì)胞密度為0.5×104/孔、rhTβ4濃度為200 nmol/L、Vn濃度為12.5 μg/mL時(shí)細(xì)胞遷移指數(shù)最高，達(dá)1.96±0.39。對(duì)3種影響因素的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，本試驗(yàn)的影響因素主次為rhTβ4濃度＞Vn濃度＞細(xì)胞密度。

2.3 專(zhuān)屬性測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，供試品組細(xì)胞遷移量為359±16，成品輔料組為148±10，對(duì)照組為152±19。成品輔料組和對(duì)照組的細(xì)胞遷移量差異不大，證明成品輔料對(duì)本試驗(yàn)無(wú)干擾，該方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

本試驗(yàn)批內(nèi)、批間、原液和成品重復(fù)性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。不同批內(nèi)、批間、原液和成品的細(xì)胞遷移指數(shù)均為1.61～1.72，細(xì)胞遷移指數(shù)的變異系數(shù)為3.63%～10.91%，均小于15%，提示本試驗(yàn)重復(fù)性較好。

表2 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

表4 批內(nèi)、批間、原液和成品檢測(cè)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

我們建立了rhTβ4生物活性測(cè)定方法。研究結(jié)果表明，rhTβ4能夠促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，且在實(shí)驗(yàn)條件為細(xì)胞密度0.5×104/孔、Tβ4濃度 200 nmol/L、Vn濃度 12.5 μg/mL時(shí)，細(xì)胞遷移指數(shù)最高。與Kozaczuk等[6]的研究結(jié)果比較，rhTβ4使用濃度基本一致，但本試驗(yàn)降低了Vn濃度和細(xì)胞密度，而且采用肉眼觀察的方法判定細(xì)胞遷移效果，采用計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞遷移數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞遷移指數(shù)，提高了結(jié)果判定的準(zhǔn)確性。

本試驗(yàn)首先對(duì)細(xì)胞遷移試驗(yàn)中單個(gè)影響因素分別進(jìn)行了篩選，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)條件，初步建立了檢測(cè)方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。根據(jù)方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果可知，ECV304細(xì)胞遷移法檢測(cè)rhTβ4生物學(xué)活性，操作簡(jiǎn)便，且專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高。本試驗(yàn)結(jié)果為建立rhTβ4生物學(xué)活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1]張珍,游顏杰,李維娜,等.重組人胸腺素基因的克隆、表達(dá)、純化、鑒定及活性檢測(cè)[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(16):1451-1454.

[2]徐天嬌,張昭,舒震,等.重組人胸腺素β4二串體蛋白的原核表達(dá)、純化及生物活性[J].生物技術(shù)通訊,2012,23(3):329-332.

[3]李憲奎.人胸腺素β4在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及生物學(xué)活性鑒定[D].北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2008.

[4]丁大有,馬素永,許松山,等.胸腺素β4與藥物開(kāi)發(fā)[J].生命的化學(xué),2012,32(1):67-70.

[5]劉羽佳,李集臨.胸腺素β4研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,16(4):38-44.

[6]Kozaczuk A,Selmi A,Bednarek R.Bacterial expres?sion,purification and angiogenesis-promoting activity of human thymosin β4[J].Protein Expr Purif,2013,90(2):142-152.

[7]Selmi A,Malinowski M,Brutkowski W,et al.Thymo?sin β4 promotes the migration of endothelial cells without intracellular Ca2+elevation[J].Exp Cell Res,2012,318(14):1659-1666.

[8]Freeman K W,Bowman B R,Zetter B R.Regenera?tive protein thymosin-4 is a novel regulator of puriner?gic signaling[J].FASEB J,2011,25(3):907-915.

Development of a Biological Activity Detection Method for Recombinant Human Thymosin β4

XU Hong-Wei1,ZHANG Jun-Ying1,MA Shan-Shan1,TANG Xiao-Chuang1,MA Su-Yong1,2,NIE Li-Ya1,2,XU Song-Shan1,2*
1.Beijing Northland Biotech.Co.,Ltd.,Beijing 100085;2.Beijing Naked Plasmid Gene Therapy Drug Engineering Technology Research Center,Beijing 100085;China

Objective:To control the quality of recombinant human thymosin beta 4（rhTβ4）in vitro,the biologi?cal activity detection method was developed and evaluated.Methods:The ECV304 cell migration method was used to detect the biological activity of rhTβ4.The key factors including cell density,vitronectin（Vn） concentra?tion,rhTβ4 concentration were screened to establish the optimal migration conditions.Results:The highest cell mi?gration rate was observed under the conditions of the cell density 0.5×104/well,Vn concentration 12.5 μg/mL,rhTβ 4 concentration 200 nmol/L,incubation time 24 h and cell migration time 4 h.Conclusion:The developed biologi?cal activity detection method of rhTβ4 has high specificity,accuracy and repeatability,and it can be used for the quality control of rhTβ4.

recombinant human thymosin β4;biological activity detection;cell migration

Q502;Q24

A

1009-0002（2017）05-0661-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:xusongshan@northland-bio.com

2017-02-23

徐宏偉（1979- ），女，本科學(xué)歷，（E-mail）xuhw0711@163.com

許松山，（E-mail）xusongshan@northland-bio.com