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    CD19蛋白截短體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞中的表達(dá)

    2017-10-24 00:34:44張崢嶸王嫚娜梁劍青李世崇黃紅艷閆敏陳昭烈劉真真孫強(qiáng)
    生物技術(shù)通訊 2017年5期
    關(guān)鍵詞:共培養(yǎng)質(zhì)粒載體

    張崢嶸,王嫚娜,梁劍青,李世崇,黃紅艷,閆敏,陳昭烈,劉真真,孫強(qiáng)

    1.鄭州大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科,河南 鄭州 450008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;3.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100038

    CD19蛋白截短體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在K562細(xì)胞中的表達(dá)

    張崢嶸1,2,王嫚娜2,梁劍青2,李世崇2,黃紅艷3,閆敏1,陳昭烈2,劉真真1,孫強(qiáng)2

    1.鄭州大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科,河南 鄭州 450008;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;3.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,腫瘤治療性疫苗北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100038

    目的:構(gòu)建胞內(nèi)段缺失的CD19蛋白截短體(CD19t)慢病毒表達(dá)載體pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro,并建立穩(wěn)定表達(dá)CD19t的人紅白血病細(xì)胞系K562/CD19t。方法:合成CD19t基因全長,酶切產(chǎn)物插入慢病毒載體pLVXEF1α-IRES-Puro,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝病毒后感染人紅白血病細(xì)胞系K562,采用Western印跡和免疫熒光技術(shù)檢測CD19t在K562細(xì)胞中的表達(dá),并通過ELISA檢測K562/CD19t與CD19 CAR-Jurkat共培養(yǎng)上清中的IL-2濃度。結(jié)果:酶切鑒定與測序結(jié)果表明成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro;Western印跡和免疫熒光檢測到K562/CD19t細(xì)胞中CD19t的表達(dá);ELISA結(jié)果顯示表達(dá)的CD19t能夠刺激識(shí)別CD19的CAR-Jurkat細(xì)胞分泌IL-2。結(jié)論:構(gòu)建了CD19蛋白截短體慢病毒表達(dá)載體,并在K562細(xì)胞中表達(dá),有助于進(jìn)一步構(gòu)建B細(xì)胞白血病動(dòng)物模型和驗(yàn)證CAR-T效能。

    CD19;基因克??;B細(xì)胞;CAR-T免疫療法

    CD19分子,又名Leu-12或B4,最早于1983年被Naderl等發(fā)現(xiàn)[1]。CD19基因位于第16條染色體短臂16p11.2,由15個(gè)外顯子組成,編碼556個(gè)氨基酸殘基[2]。CD19表達(dá)于正常成熟B細(xì)胞、惡性B細(xì)胞和B前體細(xì)胞,在成熟B細(xì)胞中的表達(dá)量約是未成熟B細(xì)胞中的3倍[3-4]。CD19分子屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白,只有一個(gè)跨膜區(qū),胞內(nèi)段是C端,胞外段是N端[5]。胞外區(qū)包括2個(gè)C2型免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域和1個(gè)N端糖基化位點(diǎn),C2球蛋白結(jié)構(gòu)域間由硫鍵相連。多個(gè)實(shí)驗(yàn)證明,其胞內(nèi)區(qū)域是高度保守的,并且包含3個(gè)具有重要功能的酪氨酸殘基Y391、Y482和Y513[4,6]。

    CD19參與了B細(xì)胞的活化、發(fā)育過程,其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是CD21-CD19-CD81復(fù)合物,該復(fù)合物降低了B細(xì)胞固有或受體依賴的信號(hào)閾值,同時(shí)還能不依賴B細(xì)胞受體的存在,與C3d結(jié)合影響B(tài)細(xì)胞受體信號(hào)途徑[7-9]。近年來,CD19分子作為B細(xì)胞的標(biāo)記分子的作用越來越受到重視:一方面,CD19可以作為白血病免疫細(xì)胞分型依據(jù)[10];另一方面,在B細(xì)胞惡性腫瘤治療領(lǐng)域,CD19能夠作為一個(gè)重要的治療靶點(diǎn),尤其是靶向CD19分子的嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)T細(xì)胞療法在近年的臨床實(shí)驗(yàn)中獲得了很大的成功[11]。

    考慮到CD19全長會(huì)降低慢病毒對(duì)淋巴細(xì)胞的感染效率,我們擬構(gòu)建截短的CD19蛋白(CD19t)慢病毒表達(dá)載體并感染K562細(xì)胞,通過ELISA確定其對(duì)識(shí)別CD19的CAR-Jurkat的刺激作用,為進(jìn)一步研究CD19分子在B細(xì)胞惡性腫瘤中的作用和驗(yàn)證CAR-T的效能奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    Jurkat細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心(采用Hyclones公司的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng));293FT細(xì)胞、K562細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存(293FT細(xì)胞采用Omacgene公司的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),K562細(xì)胞采用Hyclones公司的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng));大腸桿菌Trans10購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒pLVX-EF1α-IRES-Puro購自優(yōu)寶生物公司;CD19截短體對(duì)應(yīng)的核苷酸序列由金斯瑞公司合成,以pUC57的質(zhì)粒形式提供;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自天根公司;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ購自NEB公司;LipofectAMINE LTX&Plus Reagent、嘌呤霉素、抗CD19-N端抗體、抗GAPDH抗體和二抗均購自Invitrogen 公司;Human IL-2 ELISA kitⅡ購自 BD公司。

    1.2 CD19截短體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

    設(shè)計(jì)的CD19t不包含胞內(nèi)段編碼基因,全長1029 bp。前后分別是EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn),中間由66 bp的信號(hào)肽序列、27 bp的HA標(biāo)簽、915 bp的胞外段與跨膜區(qū)對(duì)應(yīng)序列和終止密碼子組成(圖1)。由金斯瑞公司合成,以pUC57質(zhì)粒形式提供。用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切得到目的片段,膠回收后連入pLVX-EF1α-IRES-Puro載體的EcoRⅠ/BamHⅠ位點(diǎn),構(gòu)建得到pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體(圖2)。

    圖1 CD19蛋白截短體CD19t序列設(shè)計(jì)示意圖

    1.3 病毒包裝、感染

    293FT細(xì)胞按1×106/孔接種于 6孔板,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng),次日將目的慢病毒載體與包裝質(zhì)粒D8.9、VSVG-L用脂質(zhì)體LipofectAMINE LTX&Plus Reagent共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,6 h后換液,于24、48、72 h收取上清,用4.5 μm濾器過濾,將K562細(xì)胞按1×104/孔接種于24孔板,每孔加入1 mL RPMI1640培養(yǎng)基、1 mL病毒上清和1.5 μL聚凝胺,3 d后用嘌呤霉素(0.5 μg/mL)篩選4~5 d,獲得目的細(xì)胞株K562/CD19t。

    圖2 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

    1.4 Western印跡檢測細(xì)胞CD19t蛋白的表達(dá)

    取1×105K562/CD19t細(xì)胞,1000 r/min離心3 min,PBS洗2次,棄去PBS,于冰上加RIPA,冰上孵育振蕩,30 min后12 000 r/min離心20 min,棄沉淀,上清分裝備用。取上清2.5 μL,蛋白定量得其濃度。配膠,加樣,電泳(電泳分離膠濃度為15%,濃縮膠和分離膠分別用100 V/20 min、160 V/1 h);轉(zhuǎn)膜時(shí)設(shè)定100 V,1 h,并用5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉;孵育蛋白一抗,4℃翻轉(zhuǎn)過夜,TBST洗3次;孵育蛋白二抗,1 h,TBST洗3次;與發(fā)光液和穩(wěn)定劑避光孵育2 min,于暗室中顯影、定影。

    1.5 免疫熒光檢測細(xì)胞CD19t蛋白的表達(dá)

    取5×104目的細(xì)胞,400 r/min離心 5 min,甩片后用4%多聚甲醛固定10 min,PBS洗3次,10 min/次;5%BSA室溫封閉1 h,棄去封閉液,加入抗CD19-N端抗體(1∶50稀釋),4℃過夜;PBS洗3次,10 min/次,加入熒光標(biāo)記二抗(1∶200稀釋),室溫孵育 40 min,PBS洗 3次,10 min/次;用含DAPI的封片劑封片保存,熒光顯微鏡觀察。

    1.6 檢測K562/CD19t與嵌合抗原受體Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)上清中IL-2的表達(dá)

    取2×104K562/CD19t細(xì)胞和 1×104識(shí)別 CD19的CAR-Jurkat細(xì)胞,于48孔板中共培養(yǎng)過夜,12 h后取上清,1500 r/min離心3 min,棄沉淀,上清分裝備用。用BD公司的Human IL-2 ELISA KitⅡ試劑盒檢測上清中IL-2的濃度。

    2 結(jié)果

    2.1 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體的構(gòu)建

    將含有CD19t基因的質(zhì)粒pUC57-CD19t用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切,目的片段連入經(jīng)相同酶切的pLVX-EF1α-IRES-Puro載體,隨機(jī)選取2個(gè)克隆,分別用EcoRⅠ/BamHⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定,DNA電泳片段和模式與預(yù)期相符(圖3),序列測定顯示插入序列正確無誤(結(jié)果未示),證明pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達(dá)載體構(gòu)建成功。

    圖3 質(zhì)粒pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro的雙酶切產(chǎn)物電泳圖譜

    2.2 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中CD19t的表達(dá)

    以轉(zhuǎn)染空載體的K562為對(duì)照組,轉(zhuǎn)染pLVXEF1α-CD19t-IRES-Puro載體的 K562/CD19t為實(shí)驗(yàn)組,并以GAPDH為內(nèi)參。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組表達(dá)CD19t而對(duì)照組,差異明顯(圖4)。

    2.3 免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中CD19t的表達(dá)

    CD19t具有跨膜區(qū),理論上會(huì)表達(dá)于細(xì)胞膜表面。因此,我們檢測了CD19t在目的細(xì)胞K562/CD19t中的表達(dá)定位。如圖5所示,CD19t(綠色)高度表達(dá)于K562/CD19t的細(xì)胞膜處,而轉(zhuǎn)染空載體的K562/NC則不表達(dá)。

    圖4 Western印跡檢測CD19t蛋白在K562細(xì)胞中的表達(dá)

    圖5 CD19t蛋白表達(dá)于K562細(xì)胞膜上(熒光顯微鏡,×400)

    2.4 ELISA檢測K562/CD19t和CAR-Jurkat共培養(yǎng)上清中IL-2的表達(dá)量

    根據(jù)設(shè)計(jì),截短體CD19t的胞外區(qū)會(huì)發(fā)揮與CD19胞外區(qū)類似的功能。將轉(zhuǎn)染CD19t和轉(zhuǎn)染空載體的K562細(xì)胞分別與識(shí)別CD19的CAR-Jur?kat共培養(yǎng),取上清檢測IL-2濃度。如圖6所示,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞因子IL-2濃度差異顯著,提示K562/CD19t表達(dá)的CD19t能夠被識(shí)別CD19的CAR-Jurkat有效識(shí)別,并能刺激CAR-Jurkat細(xì)胞分泌IL-2。

    圖6 ELISA檢測K562/CD19t和CAR-Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)上清中IL-2的濃度

    3 討論

    CD19分子主要表達(dá)于B細(xì)胞表面,調(diào)節(jié)B細(xì)胞相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),在臨床診斷和治療方面也具有重要意義。幾乎所有B細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞均表達(dá)CD19,因此以CD19為靶標(biāo)的免疫治療方法具有相當(dāng)程度的治療效果。

    這些免疫治療方法主要有兩類:一類是抗CD19分子的單克隆抗體的應(yīng)用,一類是嵌合抗原受體CART-CD19細(xì)胞療法。前者主要有非結(jié)合抗體、藥物共軛抗體和雙特異性抗體。其中,一種針對(duì)急性淋巴白血病的雙特異性抗體藥物Blinatumomab在36例患者的研究中,除2人外均達(dá)到了緩解。后者,CART-CD19細(xì)胞療法是迄今細(xì)胞治療腫瘤領(lǐng)域效果最顯著的方法,與“免疫檢測點(diǎn)抗體阻斷療法”一起被Science雜志評(píng)為“2013年十大科學(xué)突破之首”[12]。

    我們所構(gòu)建的CD19截短體僅表達(dá)CD19分子的胞外區(qū)和跨膜區(qū),為研究某些功能區(qū)域提供了如下便利:①CD19t基因的長度約為CD19全長的一半,能夠提高表達(dá)目的基因的慢病毒載體對(duì)淋巴細(xì)胞的感染效率;②截短體不表達(dá)CD19分子的胞內(nèi)區(qū),可以與表達(dá)CD19分子全長或CD19胞內(nèi)區(qū)截短體的細(xì)胞系相互比較驗(yàn)證,研究其胞外區(qū)對(duì)細(xì)胞功能的影響;③將來用截短體K562/CD19t細(xì)胞系所構(gòu)建的小鼠移植瘤模型,既具有CD19抗原性,又避免了CD19分子本身對(duì)K562細(xì)胞的影響,并且可以為驗(yàn)證新型結(jié)構(gòu)CART-CD19或靶向CD19的抗體藥物的效能做好準(zhǔn)備。

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    Construction of Lentiviral Expression Vector for CD19 Truncated Protein and its Expression in K562 Cells

    ZHANG Zheng-Rong1,2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
    1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Bioengi?neering,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

    Objective:To construct the lentiviral expression vector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro for truncated CD19(CD19t) in cytoplasmic region,and examine its expression in K562 cells.Methods:CD19tgene was synthe?sized and cloned into pLVX-EF1α-IRES-Puro vector followed by virus packaging in 293FT cells.Human erythro?leukemia K562 cells were infected with recombinant lentivirus containing CD19t to construct K562/CD19t cells.The expression of CD19t was examined by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA was used to ana?lyze the secreted IL-2 in co-culture supernatant of K562/CD19t with CAR-Jurkat.Results:Lentiviral expressionvector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro was confirmed by double enzymatic digestion and sequencing.The expres?sion of CD19t in K562 cells was detected by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA showed that CAR-Jurkat secreted IL-2,which was stimulated by CD19t expression.Conclusion:The lentiviral vector for CD19t expression has been constructed and CD19t expression can be detected in K562/CD19t cells,which would be helpful to make animal model for B cell leukemia and test CAR-T performance.

    CD19;gene cloning;B cells;CAR-T immunotherapy

    Q78

    A

    1009-0002(2017)05-0634-05

    10.3969/j.issn.1009-

    *Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

    2017-03-01

    國家自然科學(xué)基金(81572799,31671432);國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC1303303);北京市自然科學(xué)基金(7162091)

    張崢嶸(1991- ),男,碩士研究生,(E-mail)18703605958@163.com;王嫚娜(1991- ),女,博士研究生;同為第一作者

    劉真真,(E-mail)Liuzhenzhen73@163.com;孫強(qiáng),(E-mail)sunq@bmi.ac.cn

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