人G3BP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在食管癌細(xì)胞中的定位分析

張麗娜，黃映輝

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

人G3BP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在食管癌細(xì)胞中的定位分析

張麗娜，黃映輝

北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

目的：構(gòu)建GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白1（G3BP1）的真核表達(dá)載體pEGFP-C3-G3BP1，并觀察其在人食管癌EC109細(xì)胞中的表達(dá)及定位。方法：采用RT-PCR法從EC109細(xì)胞中擴(kuò)增G3BP1 cDNA全長序列，用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物后克隆至pEGFP-C3載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序鑒定；將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，熒光定量RT-PCR和Western印跡檢測G3BP1的表達(dá)，熒光顯微鏡觀察G3BP1的定位。結(jié)果：目的基因G3BP1的序列完全正確，并在EC109細(xì)胞中獲得表達(dá)，熒光顯微鏡觀察顯示G3BP1定位于細(xì)胞質(zhì)。結(jié)論：構(gòu)建了pEGFP-C3-G3BP1真核表達(dá)載體，并在EC109細(xì)胞中過表達(dá)，G3BP1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，形成應(yīng)激顆粒（stress granules，SGs）。為進(jìn)一步探討G3BP1在食管癌細(xì)胞中的功能及其與SGs的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。

GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白1（G3BP1）；EC109細(xì)胞；細(xì)胞定位；應(yīng)激顆粒（SGs）

GTP酶激活蛋白SH3功能區(qū)結(jié)合蛋白1（Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding pro?tein 1，G3BP1）是由Parker等通過免疫共沉淀分離到的第一個RasGAP SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白[1]。G3BP1的相對分子質(zhì)量為68 000，在進(jìn)化過程中高度保守，屬于RNA結(jié)合蛋白家族，在調(diào)控Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用[2]。哺乳動物細(xì)胞中至少存在2種形式的G3BP，即G3BP1和G3BP2。許多證據(jù)表明G3BP1具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡和RNA代謝等過程。

研究表明G3BP1在多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，包括頭頸部癌、肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等，而且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[3-6]，這暗示G3BP1可能是一種腫瘤標(biāo)志物。食管癌是消化系統(tǒng)中一種常見的腫瘤，嚴(yán)重危害人類的身體健康。尋找其有效的基因靶點(diǎn)抑制食管癌細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移并進(jìn)行深入的功能研究，對于提高食管癌患者的生存率和改善食管癌治療具有重要意義。但目前關(guān)于G3BP1與食管癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚不清楚，相關(guān)研究報(bào)道很少。此外，研究證實(shí)在細(xì)胞中過表達(dá)G3BP1可誘導(dǎo)胞質(zhì)中形成應(yīng)激顆粒（stress granules，SGs）[7]。SGs是細(xì)胞應(yīng)對各種毒性刺激反應(yīng)時在胞質(zhì)內(nèi)形成的一種比較大的顆粒，在應(yīng)激反應(yīng)時對mRNA代謝起關(guān)鍵調(diào)控作用，但細(xì)胞中過表達(dá)G3BP1形成SGs的具體機(jī)制也不是很清楚。

蛋白的亞細(xì)胞定位情況往往與其功能密切相關(guān)，因此，我們通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的pEGFP-C3-G3BP1真核表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)染食管癌EC109細(xì)胞，檢測其在EC109細(xì)胞中的表達(dá)，并觀察其在EC109細(xì)胞中的定位，闡明G3BP1的亞細(xì)胞定位特點(diǎn)，為后續(xù)的功能及作用機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

EC109細(xì)胞來源于美國ATCC細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；pEGFP-C3真核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25% Trypsin-EDTA 和 100×Penicillin-Streptomy?cin Solution雙抗購自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑Li?pofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ及T4DNA連接酶購自NEB公司；DNA marker（DL2000和 DL15000）、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳膠回收及純化試劑盒和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購自天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；G3BP1抗體購自GeneTex公司；β-actin抗體購自Cell Signaling Technology（CST）公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購自ABGENT公司；PCR擴(kuò)增酶Ex Taq、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Di?mer Eraser購自大連寶生物工程有限公司；PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光底物購自Millipore公司；PCR擴(kuò)增引物在上海生物工程公司合成。

1.2 G3BP1基因特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI網(wǎng)站的人G3BP1基因堿基序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)針對G3BP1 ORF的特異性擴(kuò)增引物。上游引物為5′-GCCCAAGCTTA TGGTGATGGAGAAGCC-3′（劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn)），下游引物為 5′-ATACGGATCCTCACTGCC GTGGCGCAA-3′（劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）。分別在上、下游引物的5′端加上了HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)及4個保護(hù)堿基，擴(kuò)增1401 bp的人G3BP1全長cDNA序列。

1.3 RT-PCR擴(kuò)增G3BP1基因

用RNA提取試劑盒提取人食管癌EC109細(xì)胞中的總RNA，取1 μg RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此為模板，PCR擴(kuò)增G3BP1的ORF序列1401 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段，按照瓊脂糖凝膠電泳膠回收及純化試劑盒說明書進(jìn)行純化回收。

1.4 pEGFP-C3-G3BP1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將pEGFP-C3載體與G3BP1基因PCR回收產(chǎn)物分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，37℃酶切4 h；瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收線性載體和目的基因片段；在T4DNA連接酶作用下，將pEGFPC3和G3BP1目的片段于16℃反應(yīng)2 h，然后將連接產(chǎn)物加入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，立即轉(zhuǎn)入冰中靜置5 min，加入無抗LB 培養(yǎng)基800 μL，在 37℃搖床上振蕩培養(yǎng)1 h（200 r/min），最后將菌液均勻涂布在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取單菌落，用G3BP1克隆引物進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增目的片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒pEGFP-C3-G3BP1，陽性克隆經(jīng)雙酶切鑒定后測序，測序正確后進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，大量提取重組質(zhì)粒DNA。

1.5 EC109細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及熒光觀察

6孔板的各孔接種2×105EC109細(xì)胞，放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)70%～80%。將6孔板中含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipo?fectAMINE 2000將pEGFP-C3-G3BP1重組質(zhì)粒和pEGFP-C3對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至6孔板的細(xì)胞培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡觀察GFP在EC109細(xì)胞中的分布。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞G3BP1 mRNA的表達(dá)

用0.25%胰酶消化收集轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3對照質(zhì)粒和pEGFP-C3-G3BP1重組質(zhì)粒的EC109細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Dimer Eraser檢測，反應(yīng)體系為20 μL（10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，上、下游引物各 0.8 μL，0.4 μL Rox Reference DyeⅡ，ddH2O 6 μL，2 μL cDNA模板），混勻，放入Strat?agene MX3005P熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃熱激活 5 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)。G3BP1上游引物序列為 5′-ATGCAGTCTACGGACAGAAAGA-3′，下游引物序列為 5′-GAGCATCAACATGGCGAATCT-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-CGCTCTCTGCTCC TCCTGTT-3′，下游引物序列為 5′-ATGCAGTCTA CGGACAGAAAGA-3′。 通 過 2-ΔΔCt法 計(jì) 算 G3BP1 mRNA在EC109細(xì)胞中的相對表達(dá)量。

1.7 Western印跡檢測轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞G3BP1蛋白的表達(dá)

用0.25%胰酶消化收集轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3對照質(zhì)粒和pEGFP-C3-G3BP1重組質(zhì)粒的EC109細(xì)胞，加入RIPA全細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，然后加入4×SDS緩沖液沸水煮10 min使蛋白變性。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣40 μg總蛋白，100 V恒壓電泳2 h，90 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，然后用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，分別加入G3BP1抗體（1∶1000）和 β-actin抗體（1∶5000），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶6000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，2組間的統(tǒng)計(jì)比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05時認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 獲取G3BP1基因全長序列

以食管癌細(xì)胞EC109的cDNA文庫為模板，用G3BP1基因特異引物擴(kuò)增出目的基因的完整ORF，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段約為1400 bp，符合要求（圖1）。

圖1 G3BP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 雙酶切及測序鑒定

重組質(zhì)粒pEGFP-C3-G3BP1經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約5.0 kb的線性載體片段（未酶切的環(huán)狀pEGFP-C3空質(zhì)粒大小為4.7 kb）和1401 bp的目的片段，與PCR結(jié)果一致，表明目的片段插入成功（圖2）。對重組質(zhì)粒pEGFP-C3-G3BP1進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)與人G3BP1基因的ORF序列完全相同。

圖2 pEGFP-C3-G3BP1重組質(zhì)粒的HindⅢ/BamHⅠ雙酶切電泳圖譜

2.3 G3BP1在EC109細(xì)胞中的表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒pEGFP-C3-G3BP1和對照質(zhì)粒pEGFP-C3轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，48 h后消化收集細(xì)胞，分別提取總RNA和總蛋白。通過熒光定量RT-PCR檢測G3BP1在EC109細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒相比，G3BP1的表達(dá)水平顯著升高，表達(dá)量升高大于100倍（圖3A）。通過Western印跡檢測G3BP1在EC109細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)G3BP1的表達(dá)水平也明顯增高（圖3B）。說明pEGFP-C3-G3BP1重組質(zhì)粒在EC109細(xì)胞中獲得表達(dá)。

圖3 G3BP1在EC109細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平表達(dá)結(jié)果

2.4 G3BP1在EC109細(xì)胞中的定位

將測序正確的重組質(zhì)粒pEGFP-C3-G3BP1和對照質(zhì)粒pEGFP-C3轉(zhuǎn)染EC109細(xì)胞，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，綠色熒光代表GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染pEGFPC3對照質(zhì)粒的細(xì)胞中，綠色熒光遍布整個細(xì)胞，且核質(zhì)中分布比較均勻（圖4A）；而轉(zhuǎn)染pEGFPC3-G3BP1重組質(zhì)粒的EC109細(xì)胞中，綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中沒有看到綠色熒光，即G3BP1與GFP的融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。同時，還觀察到30%左右轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞中出現(xiàn)了彌散的綠色熒光顆粒分布，即形成了SGs（圖4C）。上述結(jié)果表明在EC109細(xì)胞中過表達(dá)G3BP1會在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生SGs，這與文獻(xiàn)報(bào)道的在其他細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步證明過表達(dá)G3BP1是應(yīng)激顆粒的一個標(biāo)志物。

圖4 G3BP1在EC109細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位（×200）

3 討論

G3BP1作為第一個RasGAP SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，在Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要調(diào)控作用。越來越多的研究表明G3BP1具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、分化、凋亡、RNA代謝和誘導(dǎo)胞質(zhì)中應(yīng)激顆粒的形成[8-11]。早期研究表明G3BP1在多種腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞H1299中下調(diào)G3BP1表達(dá)能通過抑制Src/FAK相關(guān)的信號通路來抑制肺癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲。同樣，在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中也發(fā)現(xiàn)下調(diào)G3BP1的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長，并能提高化療藥物的療效[13]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)G3BP1能通過Smad信號通路參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移[14]。Dou等[15]在肝癌中的研究表明G3BP1通過上調(diào)Slug表達(dá)而促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果提示G3BP1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能是一個潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。

蛋白的表達(dá)具有時間和空間特異性，大量研究顯示蛋白質(zhì)的功能與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，因而闡明蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或不同生理、病理狀態(tài)下的定位情況，將為其功能研究提供重要線索和理論依據(jù)。G3BP1是一種胞質(zhì)蛋白，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，Tourriere等[7]報(bào)道G3BP1蛋白在Cos和CCL39細(xì)胞內(nèi)主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，核內(nèi)未見明顯表達(dá)，而且在胞質(zhì)中形成應(yīng)激顆粒。但G3BP1在腫瘤細(xì)胞中的定位與正常細(xì)胞中是否有差異，是否也會誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中形成SGs，這些問題有待深入研究。

我們構(gòu)建了帶有GFP標(biāo)簽的pEGFP-C3-G3BP1重組真核表達(dá)載體，分析G3BP1在食管癌EC109細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況。熒光定量RTPCR和Western印跡結(jié)果表明G3BP1在EC109細(xì)胞中過表達(dá)，熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染pEGFPC3-G3BP1重組質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)，綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，核內(nèi)未見明顯表達(dá)，而且有一部分細(xì)胞的胞質(zhì)中綠色熒光呈斑點(diǎn)狀分布，即形成了SGs。綜上，我們構(gòu)建了pEGFP-C3-G3BP1真核表達(dá)載體，證實(shí)G3BP1是胞質(zhì)蛋白，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞SGs的形成，但并不是所有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都形成SGs，可能是因?yàn)橹亟M質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染以及細(xì)胞處于不同發(fā)育周期而造成的差異。本研究為進(jìn)一步探討G3BP1在食管癌中的功能及其與SGs的相關(guān)性提供了途徑和線索。

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Construction of the Eukaryotic Expression Vector for Hu?man G3BP1 Gene and Analysis of its Cellular Localization in Esophageal Cancer Cells

ZHANG Li-Na,HUANG Ying-Hui*
College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Objective:To construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-C3-G3BP1 and to inves?tigate the expression and cellular localization of Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1（G3BP1） in human esophageal cancer cell line EC109.Methods:The cDNA of G3BP1 was amplified from EC109 cells by RT-PCR method.The PCR products were digested with restriction endonucleasesHindⅢandBamHⅠ and subcloned into pEGFP-C3 vector.After transformation intoE.coliDH5α,the postive clones were picked for plasmid extraction and identified by double digestion and sequencing analysis.The recombinant plasmid was transfected into EC109 cells by liposome transfection method,and then the expression of G3BP1 was detected by fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot analysis.The cellular localization of G3BP1 was observed by fluorescence microscopy.Results:The sequence of G3BP1 gene was correct and expressed in EC109 cells.G3BP1 was localized in the cytoplasm of EC109 cells.Conclusion:Eukaryotic expression vector pEGFP-C3-G3BP1 was constructed and expressed in EC109 cells.G3BP1 protein was mainly localized in the cytoplasm of EC109 cells and induced the formation of stress granules（SGs）.These findings can help to further study on the functions of G3BP1 in esophageal cancer cells and its correlation with SGs.

Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1（G3BP1）;EC109 cells;cellular local?ization;stress granules（SGs）

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）05-0623-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yhuang@bjut.edu.cn

2017-02-20

北京市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（Z151100003915073）；北京市博士后工作經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（2016ZZ-33）

張麗娜（1986- ），女，博士，講師，（E-mail）lnzhang@bjut.edu.cn

黃映輝，（E-mail）yhuang@bjut.edu.cn