腎蕨多糖提取工藝優(yōu)化及其含量測定研究

謝鳳鳳，黎 理，馬雯芳，曾祥燕，蔡 毅*

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

腎蕨多糖提取工藝優(yōu)化及其含量測定研究

謝鳳鳳，黎 理，馬雯芳，曾祥燕，蔡 毅*

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

目的研究腎蕨多糖的最佳提取工藝參數(shù)并對其含量進(jìn)行測定。方法 用苯酚-硫酸比色法考察物料比、提取時間、提取次數(shù)等因素對腎蕨多糖得率的影響，用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定最佳提取參數(shù)并對腎蕨多糖進(jìn)行含量測定。結(jié)果 SPSS正交分析，各因素的主次順序為物料比、提取次數(shù)、提取時間，最佳提取工藝為：水25 mL、提取時間75 min、提取次數(shù)1次；腎蕨多糖含量春季較高。結(jié)論 本方法穩(wěn)定、可靠，重復(fù)性好，靈敏度高，可用于腎蕨多糖提取，為其進(jìn)一步開發(fā)研究提供依據(jù)。

腎蕨；多糖；工藝優(yōu)化；SPSS；含量測定

腎蕨又稱馬騮卵、石黃皮、圓羊齒等，為真蕨目骨碎補(bǔ)科腎蕨Nephrolepis auriculata （Linn.） Trimen.的地下塊莖，為一種極具民族特色的植物藥并具有食用價值[1-2]，近年來受到了人們的關(guān)注，已有鑒別[3]、化學(xué)成分[4-5]、藥理作用[6-7]及藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究等[8-9]多方面文獻(xiàn)報道，并收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第二卷）[10]。本文在延續(xù)已有研究的基礎(chǔ)上[8]，對其多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

SB25-120超聲波清洗機(jī)（寧波新芝）；BP211D電子天平分析天平（德國賽多利斯）；Agilent UV-8453 紫外-可見分光光度計（美國安捷倫）。

1.2 藥材

樣品采自廣西各地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)蔡毅教授鑒定為真蕨目骨碎補(bǔ)科腎蕨Nephrolepis auriculata （Linn.）Trimen.的地下塊莖。

1.3 試藥

葡萄糖對照品（含量測定用 批號：110833-200904 中

國食品藥品檢定研究院）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1mL含0.15mg的溶液，即得。

2.2 測定方法

采用苯酚-硫酸法測定[11]。

2.3 提取條件的考察

2.3.1 提取方法的考察

取本品粉末1 g，精密稱定各4份，分別采用冷浸法、回流提取法、超聲提取法、水煮法對腎蕨藥材進(jìn)行提取，照2.2項下的方法進(jìn)行測定，多糖測得量依次為0.37%、0.43%、0.32%、0.28%，可見超聲提取法提取率較高，且操作簡便，故選擇超聲提取法。

2.3.2 正交試驗方法考察

2.3.2.1 正交表的選擇

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，對提取工藝中的物料比、提取時間、提取次數(shù)進(jìn)行正交試驗，每個因素設(shè)3個水平。選用L9（34）表進(jìn)行正交試驗。見表1。

表1 因素水平表

2.3.2.2 正交試驗

取腎蕨藥材干燥粉末9份，各1g，精密稱定，置100ml具塞錐形瓶中，按L9（34）正交試驗表進(jìn)行實驗。見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3.2.3 提取工藝的確定

通過正交試驗結(jié)果直觀分析及方差分析表明，A、B、C三個因素均對實驗結(jié)果有顯著性影響（P＜0.01），各因素的主次順序為料液比、提取次數(shù)、提取時間（A＞C＞B），最佳提取工藝組合為：A1B3C1。綜合所述，最終提取方法確定如下：精密稱定本品粉末1g，加入蒸餾水25 mL，稱定，超聲處理75min，放至室溫，再稱定，用水補(bǔ)重，濾過，精密量取濾液10ml，加入2倍量乙醇，過夜，離心10 min（3000轉(zhuǎn)/分），沉淀置25 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，即得。

2.4 腎蕨多糖含量測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL刻度試管中，補(bǔ)加蒸餾水至2 mL，照2.2項下的方法進(jìn)行測定，記錄吸光度值?；貧w方程為：Y=49.471X-0.0466，r=0.9990，表明D-無水葡萄糖在60～106μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實驗

取同一份D-無水葡萄糖對照品溶液（0.0060 mg?ml－1），按2.2項擬定的測定條件，連續(xù)測定6次。結(jié)果表明6次測定的D-無水葡萄糖吸光度平均值為0.30970，RSD＝0.43%（n＝6），試驗表明本法的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性實驗

取同一批（SJ-1）樣品粉末6份，各1 g，精密稱定，照2.3.2.4項下的方法制備供試品溶液，照2.2方法下測定，記錄吸光度值，并計算含量。實驗結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，RSD為2.73%。

2.4.4 加樣回收試驗

精密稱取D-無水葡萄糖對照品29.07 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為D-無水葡萄糖對照品貯備液。

精密稱取已知含量（多糖含量為0.58%）的供試品（SJ-1）粉末約0.5 g，共6份，分別精密量取上述D-無水葡萄糖對照品貯備液1 mL，按2.2項擬訂的方法測定，計算加樣回收率，多糖平均回收率為102.29%，RSD為1.29%（n=6）。見表3。

表3 加樣回收實驗結(jié)果

2.5 樣品測定

取腎蕨藥材8批，按“2.3.2.4”項下最佳提取工藝制成供試品溶液。精密移取供試品溶液0.5ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下的方法，對廣西產(chǎn)8批腎蕨藥材中的多糖進(jìn)行測定。見表4。

表4 多糖含量測定結(jié)果（n=3）

3 討 論

多糖幾乎存在于所有的植物中，為天然存在數(shù)量最多的大分子化合物，多具有抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病、抗病毒、抗輻射、調(diào)節(jié)性功能、調(diào)血脂等活性，越來越多地引起了人們的重視[12]。了解其在植物體中變化趨勢，可為進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

近年來，超聲波在中藥提取中的應(yīng)用屢見不鮮[13-17]，常用于多糖類、黃酮類、生物堿類的提取，具有省時、節(jié)能、提取效率高等特點和優(yōu)點，廣泛應(yīng)用在中藥材有效成分提取研究及中藥復(fù)方提取的研究，隨著超聲提取技術(shù)在不斷完善和提高，在中藥領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。本文在提取方法考察中，超聲提取法得率最高，故選擇此法進(jìn)行實驗。

多糖的提取受多種因素影響，本文以超聲提取法，通過正交試驗方法考察，腎蕨多糖最佳提取工藝為：取樣1 g，加水量25 mL，超聲提取75 min，超聲提取提取1次。

藥用部位為地下貯藏器官者，通常采收多在秋冬季節(jié)，但按照最佳提取工藝試驗所得數(shù)據(jù)，表明腎蕨多糖含量在（2～4月）春季較高，能否確定為最佳采收季節(jié)，尚需結(jié)合臨床療效進(jìn)一步驗證。

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Research on the zhuang medicine Nephrolepis auriculata (Linn.)Trimen polysaccharide extraction process optimization and Content determination

XIE Feng-feng, LI Li, MA Wen-fang, ZENG Xiang-yan, CAI Yi*
(Guang xi University of Chinese Medicine, Guang xi Nanning 530200, China)

ObjectiveTo study the optimum craft condition with polysaccharide content for extracting Nephrolepis auriculata (Linn.) Trimen. Methods Selecting factors with the ratio of water to sample,extract time and extract times and using target with polysaccharide content in pick-up liquid as investigation index by L9(34)orthogonal design with SPSS,and all of the data dealt with SPSS.Results The optimum craft conditions of extracting polysaccharide in Nephrolepis auriculata (Linn.) Results The ratio of water to sample1:25,extract time 75 min,extract one times.The polysaccharide content between 0.68%～1.73%.Conclusion SPSS can be convenient for the experimentation,and also for optimizing the experimentation design.The optimum craft condition of extracting polysaccharide in Nephrolepis auriculata (Linn.) Trimen was simple,rapid,accurate.

Nephrolepis auriculata (Linn.); Trimen; Polysaccharide content; Extraction; SPSS; Determination

R284.2

B

ISSN.2095-8242.2017.041.7933.03

壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心（桂教科研2013[20]號）；廣西壯瑤藥重點實驗室（桂科基字2014[32]號）；廣西重點學(xué)科（壯藥學(xué)桂教科研2013[16]號；八桂學(xué)者中藥創(chuàng)新理論與藥效研究。

蔡毅（1962-），男，教授，從事中藥與民族藥品種品質(zhì)評價及資源開發(fā)利用，E-mail：caiyi118@126.com

本文編輯：吳玲麗