糖痛方對高糖誘導(dǎo)RSC96細(xì)胞凋亡與增殖的影響

劉曉星++朱曉云++韋茂英

摘要：目的 篩選中藥糖痛方的體外作用最佳劑量。方法 采用含5～125 mmol/L不同濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RSC96細(xì)胞，檢測不同濃度（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mg/mL）糖痛方高糖培養(yǎng)RSC96細(xì)胞增殖。采用含100、125 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)RSC96細(xì)胞72 h后，AV/PI凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，計算細(xì)胞凋亡率；CCK-8法檢測不同時點RSC96細(xì)胞增殖。結(jié)果 RSC96細(xì)胞在100、125 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)下發(fā)生凋亡，凋亡率分別為（7.46±0.96）%、（16.53±1.01）%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同濃度糖痛方可明顯改善高糖對RSC96細(xì)胞增殖的抑制作用，24 h起效濃度為0.25 mg/mL；0.5、1.0、1.5 mg/mL 3個劑量糖痛方可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與125 mmol/L高糖組比較，細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 在3個不同劑量中，1.5 mg/mL糖痛方抑制細(xì)胞凋亡作用最佳。

關(guān)鍵詞：糖痛方；RSC96細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.012

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）10-0049-04

Effects of Tangtong Formula on RSC96 Schwann Cells Apoptosis and Proliferation Induced by High Glucose LIU Xiao-xing， ZHU Xiao-yun， WEI Mao-ying， DENG Lan， LI Ming-di （Department of Endocrinology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）

Abstract： Objective To screen the optimal dose of Tangtong Formula in vitro. Methods RSC96 Schwann Cells were cultivate by DMEM mediums which contains different concentrations of glucose （5–125 mmol/L）. The prevention effects of Tangtong Formula at different concentrations （0.25， 0.5， 0.75， 1.0， 1.5， 2.0， 3.0， 5.0 mg/mL） on the proliferation of RSC96 Schwann Cells induced by high glucose were detected. After the RSC96 Schwann Cells were cultivated in 100 mmol/L and 125 mmol/L high glucose mediums for 72 h， the apoptosis of RSC96 Schwann Cells was detected by flow cytometry Annexin V/PI， and the apoptosis rate was calculate； the proliferation situation of RSC96 Schwann cells in different times was detected by CCK-8 method. Results RSC96 Schwann cells were in apoptosis after being intervened by 100 mmol/L and 125 mmol/L high glucose mediums. The apoptosis rates were respectively （7.46±0.96）% and （16.53±1.01）%， with statistical significance compared with control group （P<0.01）. Different concentrations of Tangtong Formula could alleviate the inhibitory effect of high glucose on the proliferation of RSC96 Schwann cells， and the threshold concentration of Tangtong Formula in 24 h was 0.25 mg/mL. The concentrations of Tangtong Formula in 0.5 mg/mL， 1.0 mg/mL， and 1.5 mg/mL could inhibit the apoptosis of RSC96 Schwann cells induced by high glucos， compared with 125 mmol/L high glucose group， the apoptosis rate of RSC96 Schwann cells decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Among three different doses， when the dose of Tangtong Formula is in 1.5 mg/mL， the effects on inhibiting apoptosis are the best.endprint

Key words： Tangtong Formula； RSC96 Schwann cells； apoptosis； proliferation

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿病最為常見的慢性并發(fā)癥之一，可引起不同程度的感覺和運動神經(jīng)功能損害，先后出現(xiàn)肢端

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81473464）

通訊作者：李鳴鏑，E-mail：mdlee2009@126.com

感覺異常、肌力減弱甚至肌萎縮等，嚴(yán)重影響患者的生存和生活質(zhì)量。糖痛方是本院內(nèi)分泌科林蘭教授治療DPN的經(jīng)驗方，前期臨床應(yīng)用療效較好[1-2]。課題組前期藥理研究表明，糖痛方可提高Bcl-2，降低Caspase-9、Caspase-3活性的表達(dá)，抑制雪旺細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖[3-4]。但糖痛方抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)增殖的最佳劑量前述實驗并未進(jìn)行深入研究。本實驗對糖痛方的有效治療劑量進(jìn)行了相關(guān)研究，為今后研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

RSC96細(xì)胞系，美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC。

1.2 藥物及制備

糖痛方（黃芪30 g，桂枝10 g，白芍10 g，細(xì)辛3 g，土鱉蟲10 g，姜黃15 g，川芎10 g），飲片由康美藥業(yè)提供，煎取水煎液，濃縮為約1 g/mL，本院煎藥室提供。冷卻后3000 r/min離心15min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾，烘干，收集藥粉，每50 mg分裝于1.5 mL EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基（美國Gibco），胎牛血清（FBS，美國Gibco），CCK-8檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）。

1.4 儀器

LP400型全自動酶標(biāo)儀（法國巴斯德公司），熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems），AV/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD），流式細(xì)胞儀（美國BD）。

2 實驗方法

2.1 RSC96細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

從液氮罐中快速取出RSC96細(xì)胞，37 ℃水浴快速解凍約1 min，將細(xì)胞懸浮液（1 mL）吸入15 mL離心管內(nèi)并加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，混勻后1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 mL含10%FBS、1%雙抗、5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培養(yǎng)基；置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察復(fù)蘇的RSC96細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好且鋪滿T25培養(yǎng)瓶的90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代。1～2 d換液1次，2～4 d傳代。取對數(shù)生長期的RSC96細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 分組

細(xì)胞增殖實驗：對照組（含糖5.5 mmol/L、10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基）、高糖組（含25、50、75、100、125 mmol/L的葡萄糖），以2000個/孔的密度接種于96孔板，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h檢測細(xì)胞增殖。高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實驗：根據(jù)細(xì)胞增殖實驗結(jié)果分為對照組（含糖5.5 mmol/L、10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基）、高糖組（分別含糖100、125 mmol/L及10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基），以5×104/孔濃度接種于6孔板，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。劑量篩選實驗Ⅰ：對照組（含糖5.5 mmol/L）、高糖組（含糖125 mmol/L）、糖痛方組（含糖125 mmol/L+糖痛方0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、5.0 mg/mL），培養(yǎng)24、48、72 h。劑量篩選實驗Ⅱ：根據(jù)實驗Ⅰ結(jié)果分為對照組（含糖5.5 mmol/L）、高糖組（含糖125 mmol/L）、糖痛方組（含糖125 mmol/L+糖痛方0.5、1.0、1.5 mg/mL），培養(yǎng)24、48、72 h。以2000個/孔的密度接種于96孔板，每組6個復(fù)孔。糖痛方誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實驗：對照組（含糖5.5 mmol/L、10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基）、高糖組（含糖125 mmol/L、10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基）、糖痛方（含糖125 mmol/L+糖痛方0.5、1.0、1.5 mg/mL），以5×104/孔濃度接種于6孔板，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)72 h。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將96孔板加入CCK-8試劑，作用30 min，用酶標(biāo)儀于波長450 nm處測定吸光度（OD），按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4 AV/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞，PBS洗2次，每組收集1×105～5×105個細(xì)胞，1000 r/min離心5 min；加500 μL稀釋1倍的Binding Buffer并輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻，再加入5 μL PI混勻，室溫下避光反應(yīng)10～15 min后篩網(wǎng)過濾；1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。應(yīng)用流式軟件分析結(jié)果，左上象限為壞死細(xì)胞，左下象限為正常細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞。實驗重復(fù)3次。計算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)÷（凋亡細(xì)胞數(shù)+正常細(xì)胞數(shù)）×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 不同濃度高糖培養(yǎng)基對RSC96細(xì)胞增殖的影響

RSC96細(xì)胞在低糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)36～48 h時生長最快，在不同濃度高糖培養(yǎng)基RSC96細(xì)胞均能生長，但隨著高糖濃度的增加，生長速度逐漸下降，在同一高糖濃度下生長速率亦有變化。在48～60 h各高糖組生長速率均減慢，而60～72 h又較前升高。60 h后，各高糖組與對照組比較，RSC96細(xì)胞增殖明顯降低（P<0.05，P<0.01），在72 h時差異最明顯。結(jié)果見表1。endprint

4.2 不同濃度高糖培養(yǎng)基對RSC96細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，培養(yǎng)72 h后，100、125 mmol/L高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.01），125 mmol/L高糖組細(xì)胞凋亡率升高更明顯（P<0.05），凋亡細(xì)胞以晚期凋亡為主。結(jié)果見表2。

4.3 糖痛方干預(yù)高糖培養(yǎng)RSC96細(xì)胞劑量篩選實驗Ⅰ結(jié)果

經(jīng)24、48、72 h多次重復(fù)檢測，125 mmol/L高糖組RSC96細(xì)胞增殖呈現(xiàn)明顯抑制狀態(tài)。給予糖痛方后，高糖對RSC96細(xì)胞增殖抑制作用減弱，表明糖痛方對高糖抑制RSC96細(xì)胞增殖有保護(hù)作用。24 h起效濃度0.25 mg/mL，隨糖痛方劑量增加，糖痛方對高糖抑制細(xì)胞增殖的保護(hù)作用增強，但當(dāng)糖痛方濃度超過2.0 mg/mL時，其保護(hù)作用減弱。結(jié)果見表3。

4.4 糖痛方干預(yù)高糖培養(yǎng)RSC96細(xì)胞劑量篩選實驗Ⅱ結(jié)果

根據(jù)篩選實驗Ⅰ結(jié)果，最終確定培養(yǎng)基中糖痛方低、中、高濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL。3個不同劑量糖痛方均對高糖環(huán)境造成的RSC96細(xì)胞增殖抑制均有明顯的改善作用。結(jié)果見表4。

4.5 糖痛方對高糖培養(yǎng)RSC96細(xì)胞凋亡的影響

與對照組比較，高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05），凋亡細(xì)胞中以晚期凋亡為主；與高糖組比較，糖痛方各濃度組RSC96細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表5。

5 討論

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，其在周圍神經(jīng)正常的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后修復(fù)中分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、參與髓鞘的生成、營養(yǎng)神經(jīng)元、引導(dǎo)軸突再生等[5]。細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡，是指局部環(huán)境生理或病理性變化引起的、由自身內(nèi)部機制調(diào)節(jié)的一種主動的、按一定程序進(jìn)行的細(xì)胞自發(fā)性死亡方式。諸多研究表明，高糖對雪旺細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激和細(xì)胞線粒體功能障礙是細(xì)胞凋亡的重要啟動因素[6-7]。

糖尿病患者由于長期處于高糖應(yīng)激狀態(tài)，引起一系列的代謝障礙，如葡萄糖旁路代謝途徑-多元醇通路的激活，葡萄糖在特定關(guān)鍵酶——醛糖還原酶作用下生成山梨醇，而細(xì)胞對于山梨醇的清除能力有限，最終導(dǎo)致山梨醇在細(xì)胞內(nèi)積聚，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的高滲狀態(tài)，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，引起神經(jīng)細(xì)胞水腫、壞死、凋亡增加[8]；同時高糖又加重神經(jīng)纖維組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使成熟的雪旺細(xì)胞發(fā)生脫髓鞘，從而加速DPN的發(fā)生[9-10]。

因此，研究雪旺細(xì)胞的凋亡損傷，對防治DPN有重要意義。本實驗采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對T4代的RSC96細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，由于RSC96細(xì)胞系是大鼠原代雪旺細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞，較提取的原代雪旺細(xì)胞純度更高，易于培養(yǎng)，故近幾年較多應(yīng)用于DPN的研究[11-12]。

我們所建立高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞凋亡損傷模型，結(jié)合前期實驗并參照他人經(jīng)驗[6，12]，選取100、125 mmol/L高糖濃度干預(yù)，采用流式細(xì)胞儀經(jīng)Annexin V-FITC/PI熒光染色細(xì)胞方法進(jìn)行凋亡檢測。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞以活細(xì)胞為主，而125 mmol/L高糖誘導(dǎo)72 h后，凋亡細(xì)胞比例明顯增加，以晚期為主。糖痛方干預(yù)后，活細(xì)胞分布比例明顯增加，凋亡細(xì)胞比例明顯減少。為摸索糖痛方抑制凋亡、促進(jìn)增殖的最佳劑量，本實驗考察了不同劑量糖痛方對高糖培養(yǎng)RSC96細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.5 mg/mL糖痛方抑制凋亡作用最好。這一結(jié)果為今后進(jìn)行體內(nèi)實驗及在DPN動物模型上進(jìn)行藥物劑量篩選提供了數(shù)據(jù)支持。

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（收稿日期：2016-11-15）

（修回日期：2017-04-07；編輯：華強）endprint