靶基因iNOS、EPO表達(dá)對卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制研究

蘇雪鋒+陳桂麗+鄒云峰

[摘要] 目的 研究靶基因誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、促紅細(xì)胞生成素（EPO）在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)對卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響機(jī)制。 方法 隨機(jī)選取2014年3月～2016年12月我院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的卵巢上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織標(biāo)本共84例?；颊呔墒中g(shù)切除取標(biāo)本切片，經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量處理，計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞個數(shù)，計(jì)算陽性百分率。 結(jié)果 正常卵巢組織上皮細(xì)胞中iNOS和EPO幾乎沒有表達(dá)，從良性卵巢腫瘤-卵巢交界性腫瘤-惡性卵巢腫瘤，iNOS表達(dá)陽性率分別為17.39%、47.06%、87.50%，EPO表達(dá)陽性率分別為73.91%、88.24%、100.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤的組織學(xué)分級與EPO及iNOS的表達(dá)有關(guān)，腫瘤分化程度越低，EPO及iNOS的表達(dá)含量越高，且EPO與患者的臨床分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而iNOS與患者的臨床分期無關(guān)（P>0.05）。分析發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢上皮性腫瘤中EPO蛋白表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 EPO蛋白和iNOS蛋白在卵巢上皮性腫瘤能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，對卵巢上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的預(yù)測作用。

[關(guān)鍵詞] 靶基因iNOS；EPO；卵巢上皮性腫瘤；影響機(jī)制

[中圖分類號] R737.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）25-0022-04

Study on the influencing mechanism of target genes iNOS and EPO expression on the occurrence and development of ovarian epithelial tumors

SU Xuefeng1 CHEN Guili1 ZOU Yunfeng2

1.Department of Gynecology and Obstetrics， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China； 2.Department of Pathology， Yuyao People's Hospital in Zhejiang Province， Yuyao 315400， China

[Abstract] Objective To study the influencing mechanism of expression of target gene-inducing nitric oxide synthase （iNOS） and erythropoietin（EPO） in ovarian epithelial tumors on the occurrence and development of ovarian epithelial tumors. Methods A total of 84 cases of specimens of ovarian epithelial tumor tissue and normal ovarian tissue who were given incision and pathologically confirmed in our hospital from March 2014 to December 2016 were randomly selected. Patients were all given surgical incision to remove the slices of specimens， fixed by formaldehyde， embedded by paraffin to make a 4 μm continuous slices. Immunohistochemical staining and HE staining were performed respectively. Comprehensive staining intensity and percentage of positive cells in the total number of cells were used to perform semi-quantitative treatment. The total number of tumor cells and the number of positive cells were counted， and the positive percentage was calculated. Results iNOS and EPO in normal oviran epithelial cells were barely expressed. The positive rates of iNOS expression were 17.39%， 47.06% and 87.50% respectively in benign ovarian tumors-ovarian borderline tumors-malignant ovarian tumors. The positive rates of EPO expression were 73.91%， 88.24% and 100.00% respectively. The differences were statistically significant（P<0.05）. The histological grade of tumor was related to the expression of EPO and iNOS.The lower the degree of tumor differentiation， the higher the expression level of EPO and iNOS. EPO was correlated with the clinical stage of the patients， and the difference was statistically significant（P<0.05）； and iNOS was not correlated with clinical stage（P>0.05）. There was a positive correlation between EPO protein expression and iNOS protein expression in malignant epithelial ovarian tumors， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion EPO protein and iNOS protein can promote tumor cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian tumors， and have a certain predictive effect on the occurrence and development of ovarian epithelial tumors.endprint

[Key words] Target gene iNOS； EPO； Ovarian epithelial tumors； Influencing mechanism

卵巢上皮性腫瘤發(fā)病位置隱匿，易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，生存率低，是造成女性患者死亡的重要原因[1]。如何提高惡性卵巢上皮性腫瘤的早期診斷率及預(yù)后評價的準(zhǔn)確性，是臨床亟待解決的難題[2]。近年來，多種腫瘤因子被用于預(yù)測腫瘤的病變程度，但未找到特異性高、敏感性強(qiáng)的指標(biāo)指導(dǎo)臨床治療方案。誘導(dǎo)型-氧化氮合酶（iNOS）只在病理狀態(tài)下通過催化生成血管舒張因子實(shí)現(xiàn)病理中的生物學(xué)過程[3]。促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種糖蛋白激素，由腎和肝臟產(chǎn)生，具有增加血紅細(xì)胞、調(diào)節(jié)荷爾蒙的作用[4-5]?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，iNOS和EPO蛋白的聯(lián)合檢測研究惡性卵巢上皮性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程，尋找臨床診斷依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇2014年3月～2016年12月間我院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的84例卵巢上皮性腫瘤組織和正常卵巢組織患者，其中正常卵巢組織12例，年齡37～72歲，平均（47.24±6.08）歲；良性卵巢上皮性腫瘤23例，年齡35～72歲，平均（45.21±9.52）歲；卵巢交界性上皮性腫瘤17例，年齡32～73歲，平均（43.27±8.52）歲；其中惡性卵巢上皮性腫瘤32例，年齡36～73歲，平均（46.48±9.42）歲。各組間年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在32例惡性卵巢癌中：黏液性囊腺癌11例，漿液性囊腺癌16例，其他類型5例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期21例；組織學(xué)分級：高分化14例，中低分化18例。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除術(shù)前接受放療、化療及免疫治療的患者。該研究獲得了醫(yī)院倫理學(xué)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

患者均由手術(shù)切除取標(biāo)本切片，經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋，作4 μm連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色及免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水，H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，正常山羊血封閉，EpoR單克隆抗體以1：20稀釋，4℃過夜，滴加過氧化物及生物素化二抗標(biāo)記抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染脫水封片。將染色陽性的卵巢癌組織作為陽性對照，選擇PBS代替一抗為陰性對照。EPO、iNOS蛋白陽性標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，參照Bimer方法，利用半定量方法處理綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比。在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個高倍視野觀察區(qū)域，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)和腫瘤細(xì)胞總數(shù)，算出陽性率。

1.3 觀察指標(biāo)

染色強(qiáng)度評分[6]：染色強(qiáng)為3分，染色清晰為2分，染色弱但強(qiáng)于陰性顏色為1分；10%≤陽性率≤50%為2分，51%≤陽性率≤80%為3分，>80%為4分。兩項(xiàng)評分加和，不管其染色強(qiáng)度，只要陽性率<10%為（-）；3分為（+）；4～5分為（++）；6～7分為（+++）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)量資料以例表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)；等級資料用Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同卵巢組織中iNOS和EPO的表達(dá)比較

正常卵巢組織上皮細(xì)胞中iNOS和EPO幾乎沒有表達(dá)，從良性卵巢腫瘤-卵巢交界性腫瘤-惡性卵巢腫瘤，iNOS表達(dá)陽性率分別為17.39%、47.06%、87.50%，EPO表達(dá)陽性率分別為73.91%、88.24%、100.00%，數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 惡性卵巢癌組織學(xué)分級及臨床分期與iNOS及EPO關(guān)系比較

腫瘤的組織學(xué)分級與EPO及iNOS的表達(dá)有關(guān)，腫瘤分化程度越低，EPO及iNOS的表達(dá)含量越高，且EPO與患者的臨床分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而iNOS與患者的臨床分期無關(guān)（P>0.05）。見表2。

2.3 惡性卵巢上皮性腫瘤與EPO、iNOS蛋白表達(dá)的相關(guān)性

分析發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢上皮性腫瘤中EPO蛋白表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

在婦女生殖道癌瘤中，卵巢是造成患者死亡和生存者功能障礙的主要原因[7]。引起患者月經(jīng)紊亂，性功能和生育功能障礙，嚴(yán)重影響患者生存期的生活質(zhì)量[8]。臨床研究證明，卵巢上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多因素及基因的復(fù)雜過程[9-10]。腫瘤細(xì)胞高度增殖導(dǎo)致組織缺氧，通過自身作用適應(yīng)和調(diào)節(jié)缺氧環(huán)境，腫瘤細(xì)胞仍不斷浸潤、增殖[11-15]。有學(xué)者認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展必然導(dǎo)致患者缺血缺氧，從而誘導(dǎo)靶基因一氧化氮合酶（iNOS）和促紅細(xì)胞生成素（EPO）的合成和分泌。機(jī)體通過增加靶基因在腫瘤組織中的表達(dá)量，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺血缺氧環(huán)境，加速腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-17]。

iNOS在正常生理狀態(tài)不表達(dá)，只有在病理?xiàng)l件下通過催化一氧化氮因子來實(shí)現(xiàn)病理的生物學(xué)過程轉(zhuǎn)化[18]。NO的腫瘤病理生物學(xué)具有雙重調(diào)節(jié)作用，高濃度時抑制腫瘤生長；低濃度時促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究證明，NO既能維持和完善血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的生物學(xué)功能；又能激活環(huán)氧合酶而刺激產(chǎn)生前列腺素，這兩種物質(zhì)均可促進(jìn)形成腫瘤新生血管[19]。腫瘤細(xì)胞的iNOS蛋白表達(dá)量高于正常組織，且與腫瘤分級、分期呈正相關(guān)關(guān)系。促紅細(xì)胞生成素（EPO）的特異性膜受體屬于Ⅰ型細(xì)胞因子受體，由胞外配體跨膜域、結(jié)合域及包內(nèi)域三部分組成[20]。EPO在腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)增殖分化。EPO通過減少神經(jīng)細(xì)胞的壞死和保護(hù)凋亡發(fā)揮神經(jīng)，抑制iNOS蛋白表達(dá)保護(hù)EPO而發(fā)揮保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)表明，EPO具有保護(hù)內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性，能保護(hù)卵巢上皮細(xì)胞免受過氧化酶的傷害，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[21]。endprint

研究顯示，正常卵巢組織上皮細(xì)胞中iNOS和EPO幾乎沒有表達(dá)，從良性卵巢腫瘤-卵巢交界性腫瘤-惡性卵巢腫瘤，iNOS表達(dá)陽性率分別為17.39%、47.06%、87.50%，EPO表達(dá)陽性率分別為73.91%、88.23%、100.00%，這說明iNOS和EPO的陽性表達(dá)率促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長作用，隨著iNOS貯存誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO促發(fā)細(xì)胞毒作用。大量的NO與上皮腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基結(jié)合生成氧亞硝酸鹽陰離子（ONOO-），進(jìn)一步分解產(chǎn)生自由基HO.；HO.與ONOO-都具有強(qiáng)氧化性，使細(xì)胞膜發(fā)生脂化損壞卵巢上皮細(xì)胞[22-23]。腫瘤的組織學(xué)分級與EPO及iNOS的表達(dá)有關(guān)，腫瘤分化程度越低，EPO及iNOS的表達(dá)含量越高，且EPO與患者的臨床分期有關(guān)；而iNOS與患者的臨床分期無關(guān)。分析發(fā)現(xiàn)，惡性卵巢上皮性腫瘤中EPO蛋白表達(dá)和iNOS蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)。

綜上所述，EPO蛋白和iNOS蛋白在卵巢上皮性腫瘤能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成，對卵巢上皮腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定的預(yù)測作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳靜，李春艷，趙苗青，等.EZH2蛋白在卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)及其作用[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版，2015， 60（2）：65-70.

[2] 武紅，高蜀君，程劫.卵巢上皮性腫瘤患者人乳頭狀瘤病毒感染及核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)與臨床相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2015，25（1）：8-10.

[3] Chiu WT，Huang YF，Tsai HY，et al.FOXM1 confers to epithelial-mesenchymal transition， stemness and chemoresistance in epithelialovarian carcinoma cells[J].Oncotarget，2015，6（4）：2349-2365.

[4] 喬海芝，李淼，錢智.Galectin-3、CAⅨ在卵巢上皮性腫瘤的表達(dá)及意義[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2015，16（1）：63-64.

[5] Chevalier N，Paris F，F(xiàn)ontana S，et al.Postpubertal persistent hyperestrogenemia in mccune-albright syndrome：Unilateral oophorectomy improved fertility but detected an unexpected borderline epithelial ovarian tumor[J]. J Pediatr Adolesc Gynecol，2015，28（6）：169-172.

[6] 邱建，傅云峰，周彩云，等.上皮性卵巢癌組織CK2β和p53蛋白表達(dá)臨床意義分析[J]. 中華腫瘤防治雜志，2015， 22（6）：451-456.

[7] Ma J，Zhou C，Yang J，et al.Expression of AQP6 and AQP8 in epithelial ovarian tumor[J]. J Mol Histol，2016， 47（2）：129-134.

[8] 王偉明，劉輝，秦金金，等. DJ-1蛋白在卵巢上皮性腫瘤組織和血清中的表達(dá)及相關(guān)性[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25（14）：30-34.

[9] 晉一超，孫瑩，周洋，等.血脂水平與卵巢上皮性腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性分析[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，35（7）：1013-1016.

[10] Benedetto G，Hamp TJ，Wesselman PJ，et al.Identification of epithelial ovarian tumor-specific aptamers[J].Nucleic Acid Ther，2015，25（3）：162-172.

[11] 陳曉端.卵巢上皮性腫瘤常見病理診斷問題及臨床意義[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2015，31（11）：808-810.

[12] 李紅雨，韓會會，朱海，等.惡性卵巢上皮性腫瘤組織中miR-181a、TGF-β_1、TGF-βR1的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2015，55（43）：59-61.

[13] Oswald AJ，Gourley C.Low-grade epithelial ovarian cancer：A number of distinct clinical entities？[J]. Curr Opin Oncol，2015，27（5）：412-419.

[14] 王哲，劉欣.惡性卵巢上皮性腫瘤組織中Gab2蛋白的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2015，55（43）：62-63.

[15] 李娜，孫麗君，李東林，等.檢測ROC1在卵巢惡性上皮性腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（2）：202-204.

[16] Ramalingam P. Morphologic，immunophenotypic，and molecular features of epithelial ovarian cancer[J].Oncology（Williston Park）， 2016，30（2）：166-176.

[17] 肖正華，令狐華，劉倩芬.Ras和Sos1蛋白在上皮性卵巢惡性腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，36（11）：1502-1507.

[18] 葛倩倩，陳秀芹，郭琦，等.CD146和TfR1在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2017，38（1）：104-107.

[19] Madsen C，Baandrup L，Dehlendorff C，et al.Tubal ligation and salpingectomy and the risk of epithelial ovarian cancer and borderline ovariantumors：A nationwide case-control study[J]. Acta Obstet Gynecol Scand，2015，94（1）：86-94.

[20] 唐燦，鄒瓊，粟占三，等.卵巢漿液性腫瘤中IGF-2R的表達(dá)及其意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（9）：1041-1043.

[21] 胡娜，魯艷明.上皮性卵巢組織G3BP和OPN表達(dá)及相關(guān)性研究[J].中華腫瘤防治雜志，2016，23（21）：1421-1425.

[22] Qu H，Xu F，Bai Y，et al.Tumor suppressor in lung cancer 1 gene expression in epithelial ovarian cancer[J].Indian J Cancer，2016，53（1）：8-11.

[23] 葛靜，王景，滑芳，等.細(xì)胞周期蛋白E1與卵巢上皮性腫瘤關(guān)系的研究[J].中國急救醫(yī)學(xué)，2015，35（s2）：171-172.endprint