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    3D打印在分析化學(xué)中的應(yīng)用研究

    2017-10-19 08:57:12吳少尉靳蘭蘭謝義梅劉信平魏世勇吳齊越
    分析科學(xué)學(xué)報(bào) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:色譜分析檢測(cè)

    吳少尉,靳蘭蘭,謝義梅,劉信平,魏世勇,吳齊越

    (1.湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北恩施 445000;2.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北武漢 430074;3.國(guó)家富硒產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,湖北恩施 445000)

    1 引言

    近年來(lái)報(bào)道[1 - 4]火熱的三維打印(3D Printing)技術(shù)是一種以計(jì)算機(jī)三維設(shè)計(jì)數(shù)字模型文件為基礎(chǔ),運(yùn)用彈性水凝膠[5]、金屬及非金屬材料[6 - 8]、陶瓷粉體材料[9]或樹(shù)脂塑料[10 - 12]、生物組織[13 - 15]等特殊可粘合材料,借助光固化和紙層疊等方式逐層打印,以快速成形構(gòu)造物體的技術(shù)。該技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需任何模具或過(guò)多機(jī)械修飾,就能直接從計(jì)算機(jī)圖形數(shù)據(jù)中生成任意形狀的物體,從而極大地縮短物品的研制周期,提高生產(chǎn)率和降低生產(chǎn)成本。它與平面打印機(jī)工作原理基本相同,在電腦軟件驅(qū)動(dòng)控制下,打印材料通過(guò)激光燒結(jié)或者熔融擠壓成型(Fused Deposition Modeling,FDM),最終把屏幕上的藍(lán)圖變成實(shí)物。這一技術(shù)如今在教育實(shí)訓(xùn)[16]、工程設(shè)計(jì)建造、汽車(chē)、航海航天、珠寶飾品、地理信息系統(tǒng)及醫(yī)療等眾多領(lǐng)域得到青睞應(yīng)用,甚至一些食品也可通過(guò)3D打印制作[17 - 19]。

    儀器分析是以物質(zhì)的物理和物理化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的分析測(cè)試技術(shù),是分析化學(xué)最為重要的組成部分及其發(fā)展方向。而化學(xué)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、精密儀器制造科學(xué)等學(xué)科的發(fā)展推動(dòng)著分析儀器的更新發(fā)展。而3D打印技術(shù)正好也是上述五們學(xué)科的交叉綜合體現(xiàn),故3D打印技術(shù)的出現(xiàn),應(yīng)更迅速地引入分析化學(xué)中,相互滲透廣泛研究。分析化學(xué)中的原理概念和儀器設(shè)計(jì)理念可以實(shí)時(shí)地轉(zhuǎn)化為實(shí)物,并把科學(xué)進(jìn)程可視化展現(xiàn),表現(xiàn)出靈活多變的設(shè)計(jì)和建模,深入探究器件空間構(gòu)型及分析性能。使分析儀器從微型化、自動(dòng)化、智能化、專(zhuān)一化到各種儀器分析方法的集成聯(lián)用大發(fā)展,最大限度地獲得設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和直接動(dòng)手研制機(jī)會(huì),快速實(shí)現(xiàn)創(chuàng)新設(shè)計(jì)理念,培養(yǎng)創(chuàng)新思維能力。打印儀器的日臻完善,更新?lián)Q代的提升應(yīng)用,逐步推動(dòng)科技進(jìn)步。本文側(cè)重從色譜、電化學(xué)、光譜及質(zhì)譜儀器分析等方面評(píng)論近年來(lái)3D打印在分析化學(xué)中的應(yīng)用研究,為儀器分析的科學(xué)研究提供借鑒參考,以使3D打印技術(shù)和分析化學(xué)學(xué)科交叉融合協(xié)同發(fā)展。

    2 3D打印在色譜儀器分析中的應(yīng)用

    色譜分析儀器的關(guān)鍵部件在色譜柱,它保證實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的理想分離,這也是色譜分離科學(xué)研發(fā)的永久方向。借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(Computer Aided Design,CAD)軟件設(shè)計(jì)八面體微珠填充成的簡(jiǎn)單立方體結(jié)構(gòu),整體形成了六角形平行或人字形排列的通道。經(jīng)過(guò)紫外光固化丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)樹(shù)脂3D打印完整有序柱床[20],精確界定及控制填充物形態(tài),高保真地制作了多孔介質(zhì)色譜柱,包括柱內(nèi)流速分布器和色譜柱頭連接部位一并制作成功。停留時(shí)間分布測(cè)試表明柱床按照所設(shè)計(jì)的有效容積行為保留。錯(cuò)流分布器使流速在整個(gè)柱內(nèi)橫截面保持一致。3D打印色譜柱不僅有助于流體在多孔介質(zhì)中的基礎(chǔ)理論研究,也提供了色譜柱的制作新方法。這種3D打印柱床的方法也可延伸于存在固、液兩相接觸作用的過(guò)濾、催化、吸附等過(guò)程研究。用一塊5×30×30 mm長(zhǎng)方體鈦合金(Ti-6Al-4V)選擇性激光燒結(jié)3D打印色譜柱微通道(600×0.9 mm i.d.),甲基丙烯酸丁酯結(jié)合乙二醇二甲基丙烯酸酯整體聚合在通道內(nèi)來(lái)制備色譜柱。輔以不連續(xù)變溫洗脫,較好地應(yīng)用來(lái)分離完整的肽和蛋白質(zhì)[21]。這種3D打印設(shè)計(jì)新型色譜柱聯(lián)合直接接觸熱傳導(dǎo)體系將來(lái)會(huì)在便攜式色譜儀器開(kāi)發(fā)上發(fā)揮重要作用。Wang等[22]通過(guò)3D打印制作了一個(gè)完整的自動(dòng)分離N型多糖的實(shí)驗(yàn)平臺(tái),從糖蛋白中釋放出的寡糖經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記,高效液相色譜(HPLC)分離,輔以質(zhì)譜鑒定檢測(cè),提升了樣品通量和分析重現(xiàn)性。為研究生物過(guò)程中糖蛋白的生理作用提供了一個(gè)快速高通量的工具。Mardani等[23]考察選擇了與普通溶劑化學(xué)兼容的聚合物材料,3D打印制作法蘭連接的模塊盤(pán)繞型蒸餾柱,柱的微細(xì)填料也通過(guò)3D打印一并制作。蒸餾柱以全逆流和連續(xù)流的模式分離己烷和環(huán)己烷的二元混合物。在它們沸點(diǎn)溫度測(cè)定了柱子的熱損失。通過(guò)氣相色譜(GC)在線分析逆流和順流液中的組成成分。用一個(gè)懸浮液計(jì)量?jī)x[24]取代3D打印機(jī)的熱塑?chē)婎^,優(yōu)化打印參數(shù),打印制作0.2 mm厚并帶有40個(gè)平行微通道的10×10 cm薄層硅膠板,通過(guò)平面色譜實(shí)現(xiàn)了一次分離40個(gè)混合染料樣品,成本低廉簡(jiǎn)便快速。Yu等[25]借助3D 打印薄層色譜分離成像分析的便攜式籃架,相對(duì)于紫外燈和磷光劑薄層色譜板安放手機(jī)攝像頭于確定位置,斑點(diǎn)位置及圖像強(qiáng)度分別用于奈韋拉平、阿莫地喹、醋氨酚等藥物的定性和定量分析,分析結(jié)果媲美于商品臺(tái)式薄層色譜密度計(jì)的分析性能。高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)強(qiáng)的分離分析能力與靈活多變的微型前處理芯片的組合靠合適的界面來(lái)實(shí)現(xiàn),Liu等[26]3D 打印制作HPLC-MS與微流控芯片的在線聯(lián)用多流路界面,無(wú)需修正,直接與HPLC的自動(dòng)采樣針連接,且匹配于水溶性和醇溶性樣品分析,終端用戶(hù)易于重現(xiàn)制作。

    毛細(xì)管電泳(CE)也是一種適用于帶電物質(zhì)的分離分析技術(shù),除了紫外或熒光檢測(cè)外,還可通過(guò)3D打印制作接口支撐架[27],配備電容耦合非接觸電導(dǎo)檢測(cè)更加簡(jiǎn)便,免除了電滲流標(biāo)記物使用,靈敏檢測(cè)出的譜峰相比于電噴霧電離質(zhì)譜檢測(cè)器,譜峰展寬小,尖銳對(duì)稱(chēng)。Prikryl等[28]3D打印制作CE分離后的LED熒光檢測(cè)器,由檢測(cè)頭和檢測(cè)池組成,寡糖分離后熒光檢測(cè),檢測(cè)效果可以對(duì)比上光電倍增管和半導(dǎo)體光二極管檢測(cè)器,降低了生產(chǎn)成本,容易重復(fù)制作并模塊化組裝。微型自由流動(dòng)電泳裝置[29]也可用ABS樹(shù)脂熔融沉積3D打印制作,用來(lái)分離肌紅蛋白和細(xì)胞色素C的效果可以匹敵常規(guī)玻璃電泳槽。CE分離與MS檢測(cè)儀之間的噴霧進(jìn)樣接口設(shè)計(jì)直接影響著信號(hào)強(qiáng)度和離子流色譜峰提取的重現(xiàn)性,Anna等[30]應(yīng)用白色聚乳酸材料通過(guò)FDM方式3D打印制作一個(gè)可變角度打磨拋光裝置,用來(lái)研究納升噴霧毛細(xì)管尖端角度對(duì)噴霧進(jìn)樣效能的影響,5度尖角的打磨拋光,得到好的對(duì)稱(chēng)度,提高了平整面并降低了潤(rùn)濕性。3D打印重復(fù)制作納微噴霧尖端可以方便地在實(shí)驗(yàn)室快速進(jìn)行,現(xiàn)制現(xiàn)用。

    3 3D打印在電化學(xué)儀器分析中的應(yīng)用

    電化學(xué)分析包括電導(dǎo)、電位、庫(kù)倫及伏安分析等儀器分析方法,在分析儀器朝向微型化和便攜式等方向發(fā)展趨勢(shì)下,微流控芯片(Microfluidic Chip)研發(fā)是分析家把化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等檢驗(yàn)過(guò)程的樣品處理、反應(yīng)、分離、檢測(cè)等單元操作整合研制到一塊微米尺度的芯片上,也可稱(chēng)作微全分析系統(tǒng)(μTAS)等。人們可用粉體材料噴墨或細(xì)絲熔融沉積3D打印制作結(jié)構(gòu)復(fù)雜、整體緊湊的微尺度裝置來(lái)完成相應(yīng)的分析任務(wù)。

    采用聚乳酸(PLA)材料熔融擠壓3D打印[x、y和z]分別為42.64、14.95 和4.87 mm微流控芯片[31],配以工作、參考、輔助三電極和接管,借助CdS量子點(diǎn)標(biāo)記流感病毒,結(jié)合順磁性顆粒分離,微分脈沖伏安法檢測(cè)Cd的增強(qiáng)信號(hào),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)流感抗原的電化學(xué)檢測(cè)。Schimo等[32]設(shè)定0.3 mm的空間分辨率選擇性激光燒結(jié)聚酰胺3D打印,連同ABS樹(shù)脂熔融沉積3D打印制作雙流通電解池,精確控制鋁箔工作電極和鍍金不銹鋼螺紋棒對(duì)電極之間的距離,即可調(diào)節(jié)鋁箔片表面電解質(zhì)底液的流動(dòng)輪廓和電極間的場(chǎng)強(qiáng),通過(guò)雙流通電解池氧化陽(yáng)極鋁箔的兩側(cè)面,均勻定位制造了孔間距210 nm 和孔徑50 nm透過(guò)性好的鋁膜,用于濕度傳感,3D打印重現(xiàn)性好和成本效益高。Lu 等[33]用石墨烯片和納米金顆粒修飾絲網(wǎng)印制電極,生物?;貑慰寺「讲G特定蛋白4抗體聯(lián)結(jié)到鏈霉親和素改性的磁微球上,牛血清白蛋白封堵磁珠上非特異性結(jié)合位點(diǎn)。生物?;母讲G特定蛋白4抗體微球再沉積在絲網(wǎng)印制電極上制備了電化學(xué)免疫傳感器,連同一個(gè)激光燒結(jié)3D打印的電磁檢測(cè)器來(lái)酶聯(lián)免疫分析人附睪特定蛋白4,拓寬了動(dòng)態(tài)范圍,改善了重現(xiàn)性,可用于臨床分析診斷。用聚酰胺這個(gè)熱穩(wěn)定性好,機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定性好,并且生物兼容性也較好的聚合物來(lái)激光燒結(jié)3D打印恰當(dāng)?shù)陌鎵K槽和振搖瓶蓋帽支撐體[34],完整地嵌入壓電微流泵和微型螺旋閥組合一個(gè)可以在線測(cè)量酸堿度、溶解氧和生物量的多路傳感平臺(tái)。各種微生物培養(yǎng)條件下,pH控制精度可以達(dá)到0.1個(gè)單位。Lee等[35]3D打印了旋流器和梯度發(fā)生器等微流裝置來(lái)處理細(xì)胞,對(duì)3D打印的分辨率、準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性、表面粗糙度、親水性及生物兼容性等做了考察表征。3D打印技術(shù)在微流控裝置制作[36]、化學(xué)和生物化學(xué)分析[37]中的應(yīng)用及3D打印微流控芯片的優(yōu)勢(shì)和局限性[38 - 39]相繼評(píng)論報(bào)道。以下表1從3D打印方式、打印材料、制作物件、目標(biāo)分析物等方面總結(jié)出3D打印在電化學(xué)儀器分析中的實(shí)際應(yīng)用。

    表1 3D打印在電化學(xué)儀器分析中的應(yīng)用

    4 3D打印在光質(zhì)譜儀器分析中的應(yīng)用

    在紫外-可見(jiàn)分光光度分析中,Pisaruka等[47]采用ABS樹(shù)脂或者聚乳酸材料,優(yōu)化打印參數(shù),3D打印制作水浴加熱的比色樣品池。匹配于設(shè)計(jì)打印的吸收池,拓寬了可使用的比色溶劑范圍,通過(guò)測(cè)定十二烷基硫酸鈉的40 ℃溶液的臨界膠束濃度,硝酸鈷和鮭魚(yú)精子DNA 的摩爾消光系數(shù),氯化鈷與水和異丙醇的混合溶液的熱致其紫外-可見(jiàn)光譜的重現(xiàn)變化均證明了打印池的效能,成本低廉,通用性好。Choi等[48]用石蠟在0.18 mm厚的層析紙上打印疏水的柵欄屏障,在柵欄間形成直徑4 mm注射區(qū)和21×1.8 mm2樣品通路的半啞鈴型微流體分析裝置。在可折疊重合的上層紙預(yù)加載上比色指示劑和生物溶液,并干燥形成一定間距的圓形或方形檢測(cè)區(qū),在下層紙上注入樣品溶液后,就將上層紙折疊重合起來(lái),待顯色反應(yīng)結(jié)束后,可用掃描器、數(shù)字顯微鏡或者可照相手機(jī)對(duì)檢測(cè)區(qū)的圖像顏色變化程度進(jìn)行比色分析,可對(duì)于1.5~75 μmol/L的蛋白質(zhì)和0~250 mmol/L的葡萄糖進(jìn)行線性檢測(cè)。在3D打印機(jī)平臺(tái)上,以各種分析用層析紙或?yàn)V紙為底板,打印制作微流體紙質(zhì)分析裝置,用來(lái)現(xiàn)場(chǎng)比色分析微量鐵[49],重金屬離子Cu(Ⅱ),Ni(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Cr(Ⅵ) 的含量[50],測(cè)定鈣鎂硬度[51]以及用于葡萄糖,乳酸鹽和尿酸等生物標(biāo)記物[52]的多路同時(shí)檢測(cè),通量高,成本低,簡(jiǎn)便快速。以ABS樹(shù)脂為主體材料,丙烯酸基感光聚合物做支撐材料,3D打印制作具有“T”型微通道的流路體[53],空氣和水等流體可以間隔相繼流入,并在水平流路另一端上下設(shè)計(jì)打印一定寬度,互成一定角度的光通道。在其中引入折光指數(shù)較大的聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成光流體控制轉(zhuǎn)換的微型開(kāi)關(guān),當(dāng)以一定入射角進(jìn)入光路的激光在三光路與流體流路交叉作用點(diǎn)位,在水和空氣等流體間隔流入時(shí),會(huì)在一定角度方位檢測(cè)到折射光信號(hào),進(jìn)而達(dá)到在兩閥間轉(zhuǎn)換控制目的。Tyson等[54]用PLA材料3D打印鼠腦組織切片室,薄片厚度靈活可控,易于清洗,用ABS材料熔融沉積3D打印著色成像室,切片可以在池內(nèi)進(jìn)行抗體著色并通過(guò)共聚焦成像和熒光顯微分析。切片室和成像室均能按照實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)打印制作出來(lái),相比于聚丙烯酸和不銹鋼材質(zhì)的商品化切片室,其適應(yīng)性,靈活性,重復(fù)性以及成本效益均占優(yōu)。

    光譜及質(zhì)譜檢測(cè)儀器與各種分離方法的在線聯(lián)用技術(shù)成為分析復(fù)雜體系的強(qiáng)有力手段。Su等[55]通過(guò)3D打印制作一個(gè)微型上載和進(jìn)樣閥,該閥由下層的底座定子和上面內(nèi)帶定量管的轉(zhuǎn)子兩部分構(gòu)成,底座定子呈倒圓錐性狀,在圓錐曲面同一高度上打印4個(gè)微通道,兩兩相對(duì)并互相垂直,粘結(jié)上聚四氟乙烯導(dǎo)管,一路可用于連續(xù)輸送電感耦合等離子體(ICP)的載流,另外一路此時(shí)與轉(zhuǎn)子上的定量管導(dǎo)通,轉(zhuǎn)子定量管一端又與微滲析探針相連,探針扎入活鼠腦海馬體組織內(nèi),用于收集處理細(xì)胞間的微滲析液樣品,每6 min收集一次,然后把定子旋轉(zhuǎn)90°,在線聯(lián)入蠕動(dòng)泵流動(dòng)注射單元及ICP-MS之間,實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測(cè)定活鼠腦細(xì)胞間滲析液中微量元素Ca和 Zn含量,并在N-甲基天冬氨酸鹽刺激神經(jīng)作用下,監(jiān)測(cè)了活鼠腦生理反應(yīng)后細(xì)胞間液中Ca和 Zn含量動(dòng)態(tài)變化,符合生理生化研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3D打印制作可以靈活控制閥內(nèi)定量管容量,優(yōu)化進(jìn)樣體積是5 μL,在線流動(dòng)進(jìn)樣檢測(cè)時(shí),生理鹽水造成的基體效應(yīng)小。3D打印微型上載和進(jìn)樣閥部件創(chuàng)建了蠕動(dòng)注射和ICP-MS合適的界面微接口。使用熱塑性好的ABS細(xì)絲逐層熔融沉積3D打印微型高壓噴霧[56]進(jìn)樣裝置。花費(fèi)0.3元,耗時(shí)20 min所打印的進(jìn)樣裝置主要由一個(gè)3 mm 直徑的樣品液儲(chǔ)槽連接一個(gè)3 cm 長(zhǎng),500 μm 寬和500 μm深的微通道構(gòu)成。在微通道的端頭插上一個(gè)0.5 cm長(zhǎng)×ca. 0.5 mm寬的紙尖端,在含有0.1% 甲酸的甲醇介質(zhì)樣品溶液儲(chǔ)槽上施加4 kV高壓,形成了穩(wěn)定的噴霧電離,可直接進(jìn)到3 mm外的質(zhì)譜儀入口中。定性分析了圓珠筆墨水,咖啡因,木糖和溶解酵素樣品。3D打印快捷優(yōu)化制作微型進(jìn)樣裝置理念有望用到許多生化分析進(jìn)樣系統(tǒng)研發(fā)。使用丙烯酸塑料為打印材料,石蠟做支撐材料噴射3D打印化學(xué)發(fā)光檢測(cè)流通池[57],輔以精度銑拋處理,在同一塊聚合物芯片上分成兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)區(qū)帶。借助酸性高錳酸鉀與嗎啡和一系列腎上腺素酚胺的快速化學(xué)發(fā)光,用于流動(dòng)注射分析和HPLC分析檢測(cè)上,發(fā)射光強(qiáng)的檢測(cè)均高于傳統(tǒng)的圈式導(dǎo)管檢測(cè)體系。這可能是白色透明的聚合物材料打印的流通池對(duì)發(fā)出的光更好地傳輸?shù)搅斯怆姳对龉軝z測(cè)器。檢測(cè)區(qū)帶的定位也提高了重現(xiàn)性。用聚乳酸3D打印一些圓柱體,立方體,半球體狀的空穴井[58],作為解析電噴霧電離質(zhì)譜分析中的樣品支撐井體,可以容納不同物理狀態(tài)的樣品。并分析了溶液狀態(tài)中和殼聚糖凝膠樣中的胰島素和硫酸慶大霉素目標(biāo)分子,同常規(guī)聚四氟乙烯支撐體相比,分析信號(hào)增強(qiáng)了2~5倍,穩(wěn)定性也提高(RSD<6%),分析的檢出限和線性范圍都得以改善。這激發(fā)了探索3D打印技術(shù)的優(yōu)勢(shì),用于研發(fā)解析電噴霧電離離子源裝置,并用于藥物和化妝品劑型配方的快速表征,活性成分分析。以下表2從3D打印方式、打印材料、制作物件等方面總結(jié)出3D打印在光譜及質(zhì)譜儀器分析中的實(shí)際應(yīng)用。

    表2 3D打印在光譜和質(zhì)譜儀器分析中的應(yīng)用

    5 展望

    3D打印技術(shù)未來(lái)我們認(rèn)為可從以下角度去思考探究其在分析化學(xué)中的應(yīng)用潛力:(1)精心打印制作分析儀器的各個(gè)單元部件,改善其分析性能,借助3D打印工藝直接將進(jìn)樣單元、分離單元及檢測(cè)單元集成為緊湊的便攜式分析儀器。(2)用于微全分析系統(tǒng)的芯片3D打印以及微型分析裝置制作盡量一次成型,受限于目前的3D打印精度(約為幾十至100微米),有時(shí)需要另外拋光處理,減小死體積并提升與微量分析體系的匹配性和兼容性。隨著打印精度的提升,材料科學(xué)和分析化學(xué)的發(fā)展,以后可能會(huì)實(shí)現(xiàn)微流體芯片上特定抗體或一些反應(yīng)物等的同時(shí)打印,甚至達(dá)到分子簇的拼裝打印。(3)結(jié)合色譜、光譜和質(zhì)譜、電化學(xué)等儀器分析檢測(cè)原理和對(duì)像,3D打印制造專(zhuān)屬性測(cè)試分析儀器。(4)無(wú)論采用熔融沉積、微滴噴射光固化、噴射粘結(jié)劑粘附顆粒、還是選擇性激光燒結(jié)3D打印成型等方式制造。就現(xiàn)今使用的打印材料看,打印溫度一般都比較高,至少100 ℃以上,開(kāi)發(fā)與分析體系介質(zhì)兼容性好的新材料,優(yōu)化選擇打印方式及工藝,降低打印溫度,增強(qiáng)使用的安全性,還有很大研究空間,3D打印機(jī)的研制尚需與多學(xué)科協(xié)同發(fā)展,爭(zhēng)取性?xún)r(jià)比高的的桌面式3D打印機(jī)早日成為分析實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)配。

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