茯茶冠突散囊菌發(fā)酵生產(chǎn)吲哚生物堿的研究

劉麗萍，唐雨薇，王若嫻，李志冰，劉仲華 ,3，劉碩謙,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 教育部茶學重點實驗室，湖南 長沙410128

茯茶冠突散囊菌發(fā)酵生產(chǎn)吲哚生物堿的研究

劉麗萍1,2，唐雨薇1,2，王若嫻1，李志冰1，劉仲華1,2,3，劉碩謙1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；3. 教育部茶學重點實驗室，湖南 長沙410128

冠突散囊菌是茯磚茶“發(fā)花”過程中的優(yōu)勢菌，其體內(nèi)含有豐富的吲哚類生物堿類代謝產(chǎn)物。吲哚生物堿類化合物具有抗菌、抗過敏、抗輻射、抗紫外和抗腫瘤等重要的生物活性，開發(fā)前景廣闊。為提高吲哚類生物堿類代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，本研究考察了冠突散囊菌繁殖、生長與發(fā)酵的影響因素，并利用薄層色譜（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）對其發(fā)酵產(chǎn)物內(nèi)含成分進行了分析。結(jié)果表明冠突散囊菌在察氏固體培養(yǎng)基上能快速繁殖，8 d內(nèi)能產(chǎn)生大量的成熟孢子，液體培養(yǎng)的最佳條件與時長分別為pH 6.0、溫度30℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1和培養(yǎng)時長6 d；鮮茶干粉、鮮茶提取物、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸等能顯著誘導(dǎo)吲哚生物堿的合成，其中色氨酸誘導(dǎo)效應(yīng)最強；內(nèi)含成分分析表明，TLC可分離出至少10種冠突散囊菌代謝物質(zhì)，HPLC與LC-MS檢測分析其代謝產(chǎn)物的主要成分為吲哚類生物堿，產(chǎn)量達到2.45 g·L-1。本研究為茯茶冠突散囊菌的高值化開發(fā)提供了技術(shù)支撐。

冠突散囊菌；發(fā)酵條件；吲哚類生物堿；內(nèi)含成分分析

茯茶，也叫茯磚茶，在我國六大茶類中屬于黑茶，是一種后發(fā)酵茶，也是全發(fā)酵茶。茯茶最初作為一種邊銷茶，是中國西北、蒙古等游牧民族地區(qū)的特需商品[1]。隨著茯茶的逐漸流行，目前已被銷往全國各地，而且銷售量逐年增長。傳統(tǒng)飲用茯磚茶，主要用于促進消化、健脾、養(yǎng)胃、健胃、瘦身等健康方面[1-5]。長期飲用茯茶，能夠促進人體新陳代謝、提高免疫力、增強體質(zhì)、延緩衰老，具有明顯的藥理保健和病理預(yù)防作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，茯磚茶具有降血脂、降血糖、抗輻射、抗氧化等功效[6-8]。近年來，國內(nèi)外學者對茯茶的活性成分的發(fā)掘研究越來越多。從目前的研究結(jié)果來看，絕大多數(shù)學者認為冠突散囊菌（Eurotium Cristatum）對茯茶的品質(zhì)和藥理功效的發(fā)揮起了重要作用[9-10]。冠突散囊菌（E. Cristatum）在茯茶中稱作“金花菌”，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種灰綠色曲霉真菌，適合在土壤、茯磚茶、冬蟲夏草、中藥片和木屑中生長。冠突散囊菌是小冠曲霉（Aspergilus cristatellus）的有性型，由子囊果和菌絲組成。冠突散囊菌的子囊果直徑為150～200 μm，通常有黃色球形或近球形閉囊殼，子囊果破裂后可釋放出直徑為5 μm的球形、近球形或雙凸鏡形子囊孢子。冠突散囊菌的菌絲呈白色，直徑8～10 μm。一般來說，在茯磚茶進行發(fā)花第 6天冠突散囊菌開始進入對數(shù)生長期，并抑制其他細菌與霉菌的生長，成為茯茶發(fā)酵中的優(yōu)勢菌，發(fā)花至 12 d進入衰退期[11]。冠突散囊菌能生產(chǎn)豐富的天然活性成分，從而賦予了茯磚茶特有的色、香、味，也是茯磚茶促消化、降脂減肥、抑制腫瘤細胞和治療心血管疾病等保健功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。鄧放明等[12]利用冠突散囊菌發(fā)酵液分離出胞外多糖，選用 PPARs、K526、HepG2模型初步研究其降脂和抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)胞外多糖對PPARα、PPARγ、PPARδ 3種模型均有活性。呂嘉櫪等[13]對冠突散囊菌發(fā)酵液進行了研究，證明冠突散囊菌液體發(fā)酵液提取液中含有降脂成分洛伐他汀，分別為酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀。宋魯彬等[14]發(fā)現(xiàn)茯磚茶石油醚洗脫組分中含有大量的色素物質(zhì)。Du等[15]從海洋冠突散囊菌中分離到了 cristatumin A、cristatumin B、cristatumin C、cristatumin D、neoechinulin A、isoechinulin A, variecolorin G、preechinulin、tardioxopiperazine A和echinulin等化合物。Zou等[16]首次對茯磚茶中冠突散囊菌的次生代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)茯茶冠突散囊菌生產(chǎn) 1種新的異戊烯基吲哚生物堿cristatumin F，除此之外茶冠突散囊菌還生產(chǎn)echinulin、dehydroechinulin、neoechinulin A和variecolorin O等其他異戊烯基吲哚生物堿類化合物。業(yè)已證實，異戊烯基吲哚生物堿類化合物具有重要的生物活性，比如抗菌、抗過敏、抗輻射、抗紫外和抗腫瘤等[17-19]。因此，對茯茶冠突散囊菌進行開發(fā)具有重要的應(yīng)用前景。本研究深入探討茯茶冠突散囊菌中吲哚生物堿生物合成的影響因素，為茯茶冠突散囊菌的深度開發(fā)提供重要技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

冠突散囊菌由湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室提供，由黃浩博士分離鑒定并保存。

1.2 冠突散囊菌的培養(yǎng)方法

1.2.1 固體繁殖培養(yǎng)

CZA固體培養(yǎng)基（察氏固體培養(yǎng)基，Czapek-Dox Medium）按如下方法制作：準確稱取硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硝酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉 15 g，加 1 000 mL蒸餾水，于 121℃滅菌20 min。

1.2.2 液體生長培養(yǎng)

取1 mL冠突散囊菌孢子粉，50℃孵育10 min，接種于10 L液體生長培養(yǎng)基上進行生長期培養(yǎng)，液體生長培養(yǎng)基以CZA液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。CZA液體培養(yǎng)基按如下方法制作：準確稱取硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硝酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、碳酸鈣2 g，加1 000 mL蒸餾水，于121℃滅菌20 min。

1.3 影響冠突散囊菌生長速度的因素

1.3.1 pH

將CZA液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，取50 mL CZA液體培養(yǎng)基加入200 mL的三角錐形瓶，接種后28℃震蕩培養(yǎng)（200 r·min-1）7 d后收集菌液，5 000 r·min-1離心6 min，去上清，用蒸餾水洗滌3次，收集其菌絲球，40℃烘干，至恒重后取出稱重。

1.3.2 培養(yǎng)溫度

將CZA液體培養(yǎng)基pH值調(diào)至最適合冠突散囊菌生長的pH，取50 mL CZA液體培養(yǎng)基加入200 mL的三角錐形瓶，接種后分別在不同的溫度（24～34℃）條件下震蕩培養(yǎng)（200 r·min-1）7 d后收集菌液，5 000 r·min-1離心6 min，去上清，用蒸餾水洗滌3次，收集其菌絲球，40℃烘干，至恒重后取出稱重。

1.3.3 震蕩速度

在最佳pH和最佳溫度28℃下，分別在不同的震蕩速度下（120～220 r·min-1）培養(yǎng) 7 d后收集菌液，并計算菌絲球的干重。

1.3.4 培養(yǎng)時間

在最佳培養(yǎng)條件下，分別培養(yǎng)不同的時間（3～8 d），并計算菌絲球的干重。

1.4 添加物對吲哚生物堿合成的影響

在液體生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)適當時間后（第5天），轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基是在液體生長培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加5 g·L-1的茶葉干粉、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸，以5-羥色胺為標準品，采用分光光度法測定發(fā)酵產(chǎn)物中吲哚生物堿的含量[20]。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物的提取

發(fā)酵完成后，收集菌體和取發(fā)酵液，超聲30 min，加入100 mL乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，用2 mL甲醇溶液重懸，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液于冰箱保存。

1.6 發(fā)酵產(chǎn)物的檢測方法

1.6.1 薄層色譜

取樣品溶液用毛細管點樣與 TLC硅膠板上，采用Ⅰ和Ⅱ展開劑展開。Ⅰ展開劑為石油醚︰乙酸乙酯（6︰4）溶液；Ⅱ展開劑為石油醚︰乙酸乙酯（9︰1）溶液。展開完成后，分別在碘蒸氣與紫外光（366 nm 波長）下觀察并成像。

1.6.2 高效液相色譜

取150 μL樣品溶液，用甲醇稀釋至1.5 mL，有機超濾膜過濾，在高效液相色譜儀（安捷倫LC-1260高效液相色譜儀）上進行成分分析。色譜條件為：色譜柱GL Science WondasilTM C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫30℃，檢測波長 290 nm，檢測器為二極管陣列檢測器，流動相 A為 5%（V/V）磷酸水溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～30 min，流動相 B由 5%上升到 60%，30～60 min，流動相B上升到80%，流速為1 mL·min-1，進樣量為10 μL。

1.6.3 液質(zhì)聯(lián)用

采用與HPLC相同的流動相與洗脫程序。采用電噴霧離子源（ESI），正負離子掃描模式，掃描范圍設(shè)置在 100～1 500 m·z-1之間；霧化室壓力為 300 kPa，離子源溫度設(shè)為345℃，干燥氣流速為11 L·min-1。

1.7 數(shù)據(jù)分析方法

每個處理做3個重復(fù)實驗，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌在CZA培養(yǎng)基上的生長情況

為了快速獲得冠突散囊菌孢子，考察了冠突散囊菌在CZA固體培養(yǎng)基上的生長、產(chǎn)孢速度情況，結(jié)果如圖 1所示。冠突散囊菌在CZA培養(yǎng)基上生長速度快，4 d后能長滿整個平板并開始產(chǎn)孢子，6 d后孢子產(chǎn)量達到最高峰并有部分孢子開始成熟，8 d后孢子完全成熟。由此可見，CZA培養(yǎng)基適合冠突散囊菌的生長與繁殖。

圖1 冠突散囊菌在CZA培養(yǎng)基上的生長情況Fig. 1 Culture of Eurotium cristatum on Czapek-Dox solid medium

2.2 發(fā)酵條件對冠突散囊菌生長速度的影響

2.2.1 pH

為了提高冠突散囊菌的生長速度，考察了pH值對冠突散囊菌生長速度的影響。結(jié)果表明（圖 2），pH對冠突散囊菌生長速度的影響非常明顯，在低pH值下，冠突散囊菌生長非常緩慢，pH值在5.5～7.0之間適宜冠突散囊菌的生長，而在pH 6.0的條件下冠突散囊菌生長速度最快，因此在后續(xù)研究中采用pH值6的培養(yǎng)基。

圖2 pH對冠突散囊菌生長速度的影響Fig. 2 Effect of pH on growth of Eurotium cristatum

2.2.2 培養(yǎng)溫度

在確定了最佳pH值的基礎(chǔ)之上，考察了培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌生長速度的影響。結(jié)果表明（圖3），培養(yǎng)溫度在24～34℃之間，冠突散囊菌生長速度呈拋物線變化，在低溫和高溫條件下，冠突散囊菌生長均受到抑制，28～30℃適合冠突散囊菌，而在培養(yǎng)溫度30℃時冠突散囊菌生長速度最快。

圖3 培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌生長速度的影響Fig. 3 Effect of culture temperature on growth of Eurotium cristatum

2.2.3 震蕩速度

確定了最佳pH值和最佳溫度之后，筆者考察了震蕩速度對冠突散囊菌生長速度的影響。結(jié)果表明（圖4），冠突散囊菌的生長速度基本上隨著震蕩速度的增加而加快，轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時冠突散囊菌的生長最快，隨后有所下降，因此200 r·min-1的震蕩速度最適合冠突散囊菌生長。

圖4 震蕩速度對冠突散囊菌生長速度的影響Fig. 4 Effect of different rotation speeds on growth of Eurotium cristatum

2.2.4 培養(yǎng)時間

為進一步提高冠突散囊菌產(chǎn)量，考察了震蕩培養(yǎng)時間對冠突散囊菌產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明（圖5），起初，隨著震蕩培養(yǎng)時間的增加，其產(chǎn)量急劇增加，但培養(yǎng) 5 d增長速度開始減緩，到第6天產(chǎn)量達最高峰，第7天后產(chǎn)量有所降低。可見，冠突散囊菌在第3天開始進入對數(shù)生長期，第6天開始進入平穩(wěn)期，第7天開始有溶菌現(xiàn)象。因此，震蕩培養(yǎng) 6 d為最佳培養(yǎng)時間，而第5天可以進入發(fā)酵培養(yǎng)階段。

圖5 培養(yǎng)時間對冠突散囊菌生長速度的影響Fig. 5 Effect of different culture time on growth of Eurotium cristatum

2.3 添加物對吲哚生物堿合成的影響

為了提高冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物的量，培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)，并考察了不同添加物對吲哚生物堿產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明（圖6），考察的各種添加物均能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中吲哚生物堿的含量，其中茯茶粉及茯茶提取物提高吲哚生物堿產(chǎn)量的能力最低，鮮茶干粉次之，鮮茶提取物提高吲哚生物堿產(chǎn)量的能力較高，而色氨酸提高吲哚生物堿產(chǎn)量的能力最高（P＜0.01），產(chǎn)量達到(2.45±0.19) g·L-1（圖6）。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物TLC分析

為進一步分析冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物，首先對其發(fā)酵產(chǎn)物進行了TLC分析，結(jié)果如圖 7所示。冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物非常豐富，至少可檢測到10種以上的化合物。采用Ⅰ展開劑可分離到約8個化合物，但TLC最頂端有 1個明顯的橢圓形斑點，推測該斑點是幾個極性較低的化合物沒有完全分離（圖7）。為分離這些物質(zhì)，筆者采用了極性較低的Ⅱ展開劑對代謝產(chǎn)物進行了分析，結(jié)果顯示，該斑點可分離出至少5個化合物（圖7）。這些結(jié)果表明，目標物質(zhì)可分為兩個組，第一組極性中等，在中等極性的展開劑條件下能達到理想的分離效果（圖7-a和圖7-b）；而第二組極性較低，在中等極性的展開劑條件下大多數(shù)物質(zhì)集中在展開劑的最前沿（圖7-a和圖 7-b），而在弱極性展開劑條件下分離為5個斑點（圖7-c和圖7-d）。此外，試驗將TLC板置于366 nm的紫外光下進一步觀察，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)呈現(xiàn)不同顏色的熒光，如綠、藍、黃等（圖7）。這些顯色特性與吲哚生物堿有共同特點[15]。

2.5 發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析

圖6 不同添加物對冠突散囊菌吲哚生物合成的影響Fig. 6 Effect of different additives on the biosynthesis of indole alkaloids

圖7 發(fā)酵產(chǎn)物TLC分析Fig. 7 TLC analysis of fermentation products of Eurotium cristatum

采用 HPLC對冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物進行了分析，結(jié)果表明（圖8-a），在290 nm的紫外波長下，可以檢測到10個以上明顯的色譜峰，根據(jù)極性分布分為兩段，第一段為中等極性類物質(zhì)，各物質(zhì)分離效果較好，而第二段各物質(zhì)保留時間較長，且各物質(zhì)分離效果不理想，說明冠突散囊菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物有些結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常接近，有一些可能為同分異構(gòu)體。對這10個比較明顯的色譜峰進行了紫外吸收特征峰分析，結(jié)果如圖8-b所示，所有物質(zhì)呈現(xiàn)2個紫外特征吸收峰，分別在222、290 nm處附近，這些吸收特征與文獻報道[15-16]的基本一致，說明該類化合物為吲哚生物堿類化合物。

圖8 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC分析(a)和紫外吸收光譜分析（b）Fig. 8 HPLC (a) and UV spectrum (b) analysis of fermentation products from Eurotium cristatum

2.6 發(fā)酵產(chǎn)物LC-MS分析

在以上分析的基礎(chǔ)之上，我們采用LC-MS深入分析了冠突散囊菌的發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果如圖9所示，共檢測到10種吲哚生物堿類化合物，如 C19H21N3O3、C29H39N3O2、C25H27N3O3、 C44H41N3O3、 C43H46N6O4、C17H21N3O2、 C16H28N4O4、 C17H23N3O2、C22H24N4O2、C38H41N3O5等，其中C19H21N3O3為cristatumin A[15]，其余均為neoechinulin A（C19H21N3O2）的衍生物或者二聚體衍生物。

3 結(jié)論與討論

本研究系統(tǒng)分析了茯茶冠突散囊菌的液體發(fā)酵產(chǎn)物，結(jié)果表明，茯茶冠突散囊菌能生產(chǎn)至少10種吲哚生物堿類化合物，與Du等[15]和 Zou等[16]研究團隊的結(jié)果類似，即均在冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了多種吲哚生物堿類化合物。但是，筆者從茯茶冠突散囊菌獲得的吲哚生物堿的組成與Du和Zou等研究團隊報道的不同，從中筆者只發(fā)現(xiàn)了cristatumin A，其余均為neoechinulin A的衍生物或者二聚體衍生物，這可能是不同的菌株或者不同的培養(yǎng)條件造成的。同樣，Du等[15]和Zou等[16]從冠突散囊菌中也分離到了多個不一樣的吲哚生物堿類。由此也說明了，茯茶冠突散囊菌代謝產(chǎn)物非常豐富且具有多樣性，而且對環(huán)境條件比較敏感，不同培養(yǎng)條件能生產(chǎn)不同結(jié)構(gòu)的化合物。

在紫外光下，發(fā)酵產(chǎn)物呈現(xiàn)出了綠、藍、黃等不同顏色的熒光（圖7），且在222、290 nm處附近有2個明顯的紫外特征吸收峰（圖8-b），與文獻報道的吲哚生物堿類化合物特性基本一致[15-16]，說明該類化合物為吲哚生物堿類化合物。TLC（圖 7）和 HPLC（圖 8）結(jié)果均表明，冠突散囊菌生產(chǎn)的吲哚生物堿可分為中等極性和弱極性兩類，弱極性吲哚生物堿分離效果不理想，說明這類物質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似，可能共有相同的基本骨架，只存在某些基團的變化，且烷基化程度比較高。LC-MS分析結(jié)果表明（圖9），所有考察的目標物質(zhì)分子均含有N3O2的組成，而N3O3和N3O5的存在說明在N3O2的骨架上出現(xiàn)了含O基團的取代，N6O4的出現(xiàn)說明兩個N3O2的骨架形成了二聚體。同時，從LC-MS中分子離子峰（圖9）圖譜可以看出，目標物質(zhì)的基本單元為C13H11N3O2。綜合上述定性分析以及文獻報道[15-16]，可以推測茯茶冠突散囊菌代謝產(chǎn)物最基本的分子結(jié)構(gòu)為如下吲哚生物堿（圖 10），但是要準確確定各取代基團需要更多的結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)。

圖9 LC-MS質(zhì)譜圖Fig. 9 Mass spectrum of LC-MS

圖10 推測的茯茶冠突散囊菌代謝產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)Fig. 10 Proposed molecular structure of secondary metabolites from Eurotium cristatum

吲哚生物堿類化合物具有抗菌、抗過敏、抗輻射、抗紫外和抗腫瘤等多種生物活性[6-8]，研究表明，茯茶冠突散囊菌是吲哚生物堿類化合物重要生產(chǎn)者，具有重要的開發(fā)價值。本研究深入分析了影響冠突散囊菌繁殖速度、生長速度和次生代謝的各種因素，確定了冠突散囊菌發(fā)酵生產(chǎn)吲哚生物堿的最佳工藝參數(shù)。同時本研究發(fā)現(xiàn)，鮮茶干粉、鮮茶提取物、茯茶粉、茯茶提取物和色氨酸等均能明顯提高冠突散囊菌中吲哚生物堿的含量，而其中色氨酸的效果最顯著。添加物誘導(dǎo)吲哚堿生物堿生物合成并提高其產(chǎn)量的原因，可能是因為色氨酸是吲哚堿生物堿的生物合成前體物質(zhì)[21]，色氨酸首先參與吲哚的生物合成，促使吲哚的產(chǎn)量提高，從而進一步提高了吲哚堿生物堿的產(chǎn)量?？疾斓?種添加物中均含有不等量的色氨酸，冠突散囊菌可能通過攝取添加物中的色氨酸從而提高吲哚堿生物堿的產(chǎn)量。而在考察的幾種添加物中，純色氨酸添加物表現(xiàn)出最強的誘導(dǎo)效應(yīng)，可能說明了色氨酸是誘導(dǎo)冠突散囊菌吲哚堿生物堿的主要物質(zhì)。傅冬和等[10]研究表明，茯茶發(fā)花后總氨基酸含量急劇降低，降低幅度達 36.84%，但目前尚不明確茯茶發(fā)花過程中總氨基酸含量急劇降低的機理。本研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌能利用茯茶提取物或者茯茶粉中的色氨酸（圖6），預(yù)示茯茶發(fā)花后總氨基酸量的下降可能主要是色氨酸的消耗或者由此產(chǎn)生的一系列的代謝反應(yīng)。當然，要闡明茯茶發(fā)花后氨基酸含量急劇降低的機理需要更多的數(shù)據(jù)支撐，本論文也許提供了新的啟示。

雖然Du[15]和Zou等[16]研究團隊也報道了在冠突散囊菌中發(fā)現(xiàn)吲哚生物堿類化合物，但他們的工作主要在于對冠突散囊菌中發(fā)現(xiàn)吲哚生物堿類化合物的分離純化，而本研究工作的重點是在于如何利用冠突散囊菌生產(chǎn)大量的吲哚生物堿，最大限度地利用茯茶冠突散囊菌資源。本研究建立了茯茶冠突散囊菌最佳的繁殖、生長與發(fā)酵條件，將吲哚堿生物堿的產(chǎn)量提高到 2.45 g·L-1，為利用茯茶冠突散囊菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)吲哚堿生物堿提供了技術(shù)支撐。呂嘉櫪等[2]從冠突散囊菌中獲得了酸式洛伐他汀和酯式洛伐他汀，而本研究未發(fā)現(xiàn)酸式洛伐他汀或酯式洛伐他汀的存在，可能是培養(yǎng)條件不同或者是菌株不一樣，也有可能未被本研究用的提取溶劑（乙酸乙酯）所提取出來，下一步工作將具體分析冠突散囊菌是否能生產(chǎn)其他有價值的代謝產(chǎn)物。

[1]彭曉赟, 趙運林, 何小書, 等. 茯磚茶茶葉品質(zhì)和保健功能的研究概況[J]. 湖南城市學院學報: 自然科學版, 2011, 20(4): 45-48.

[2]姚亞麗. 茯磚茶抗腹瀉活性部分篩選研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學, 2012: 15-35.

[3]葉小燕. 黑茶減肥作用及其機理研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學, 2012: 20-37.

[4]Li Q, Liu Z, Huang J, et al. Anti-obesity and hypolipidemic effects of Fuzhuan brick tea water extract in high-fat diet-induced obese rats [J]. J Sci Food Agric, 2013, 93(6): 1310-1316.

[5]王蝶. 茶葉對肥胖大鼠的減肥作用及機制研究[D]. 長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學, 2012: 42-52.

[6]傅冬和, 劉仲華, 黃建安, 等. 茯磚茶降脂功能成分研究[J]. 茶葉科學, 2012, 32(3): 217-223.

[7]Fu D, Ryan EP, Huang J, et al. Fermented Camellia sinensis, FuZhuan tea, regulates hyperlipidemia and transcription factors involved in lipid catabolism [J]. Food Research International, 2011, 44(9): 2999-3005.

[8]肖文軍, 任國譜, 傅冬和, 等. 茯茶輔助調(diào)節(jié)血脂作用研究[J]. 茶葉科學, 2007, 27(3): 211-214.

[9]歐陽梅, 熊昌云, 屠幼英, 等. 冠突散囊菌對茶葉品質(zhì)成分及其抗氧化活性影響[J]. 菌物學報, 2011, 30(2): 343-348.

[10]傅冬和, 劉仲華, 黃建安, 等. 茯磚茶加工過程中主要化學成分的變化[J]. 食品科學, 2008, 29(2): 64-67.

[11]齊祖同, 孫曾美. 茯磚茶中優(yōu)勢菌種的鑒定[J]. 真菌學報, 1990, 9(3): 176-179.

[12]鄧放明, 龔淑莉, 楊偉麗. 冠突散囊菌胞外多糖生物活性高通量篩選試驗[J]. 食品與機械, 2007, 23(6): 48-51.

[13]呂嘉櫪, 鄭欣欣, 馬亞寧. 冠突散囊菌液體發(fā)酵產(chǎn)降脂類物質(zhì)的初步研究[J]. 陜西科技大學學報, 2014(6): 115-118.

[14]宋魯彬, 黃建安, 劉仲華, 等. 采用高效薄層色譜測定黑茶脂溶性色素[J]. 茶葉通訊, 2008, 35(2): 7-9.

[15]Du FY, Li XM, Li CS, et al. Cristatumins A-D, new indole alkaloids from the marine-derived endophytic fungus Eurotium cristatum EN-220 [J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22(14): 4650-4653.

[16]Zou X, Li Y, Zhang X, et al. A new prenylated indole diketopiperazine alkaloid from Eurotium cristatum [J]. Molecules, 2014, 19(11): 17839.

[17]孫祥軍, 徐繼光, 段啟虎, 等. 吲哚類化合物的抗腫瘤作用[J]. 聊城大學學報: 自然科學版, 2010, 23(2): 28-32.

[18]宋欣濛, 薛睿, 季宇彬, 等. 鉤藤中吲哚類生物堿化學成分及藥理活性研究進展[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2014, 10(5): 64-68.

[19]柏云嬌, 于淼, 趙思偉, 等. 生物堿的藥理作用及機制研究[J]. 哈爾濱商業(yè)大學學報: 自然科學版, 2013, 29(1): 8-11.

[20]丁秀年, 張群林, 張艷. 分光光度法測定華蟾素分散片中吲哚類生物堿的含量[J]. 安徽醫(yī)藥, 2007, 11(12): 1093-1094.

[21]陳越, 張青磊, 黃玉香, 等. 吲哚生物堿生物合成研究進展[J]. 世界科學技術(shù): 中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2016, 18(11): 1914-1920.

《茶葉科學》優(yōu)秀論文評選結(jié)果揭曉

為進一步提高《茶葉科學》期刊質(zhì)量，活躍學術(shù)氣氛，鼓勵作者撰寫和發(fā)表更多、更好的優(yōu)秀論文，在中國科協(xié)精品期刊項目的資助下，中國茶葉學會《茶葉科學》編輯部于2017年2月啟動了《茶葉科學》優(yōu)秀論文評選活動。經(jīng)過論文評選組專家為期 6個月的初選和終選，最終綜合論文學術(shù)先進性、研究領(lǐng)域、寫作水平、成果應(yīng)用前景，以及論文被引和下載指標等因素，從2012年1月1日至2016年12月31日期間發(fā)表于《茶葉科學》的391篇學術(shù)論文中評選出優(yōu)秀論文20篇，其中優(yōu)秀論文一等獎3篇，二等獎6篇，三等獎11篇。

Production of Bioactive Indole Alkaloids through Fermention of Eurotium cristatum from Fuzhuan Tea

LIU Liping1,2, TANG Yuwei1,2, WANG Ruoxian1, LI Zhibing1, LIU Zhonghua1,2,3, LIU Shuoqian1,2,3*

1. College of Horticulture and Hardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China, 2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China, 3. Key Lab of Tea Science, Ministry of Education, Changsha 410128, China

Eurotium cristatum is the dominant fungi in Funzhuan tea, which produces indole alkaloids that have many important bioactivities, such as antibacterial, antiallergic, antiradiation, antiultraviolet, antitumor effects. In order to improve the production of indole alkaloids by E. cristatum, we investigated the factors affecting reproduction, growth and the fermentation of E. cristatum. The fermentation products of E. cristatum were analyzed using thin-layer chromatography, high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrum. The results showed that E. cristatum reproduced fast on Czapek-Dox solid medium with a large number of mature spores in 8 days, and the optimal growth conditions were obtained as following: pH 6.0, culture temperature 30℃, rotating speed 200 r·min-1and culture time 6 days. Moreover, fresh tea leaf powder, fresh tea leaf extract, Funzhuan tea powder, Funzhuan tea extract and tryptophan obviously improved the biosynthesis of indole alkaloids, with the best enhancing effect of tryptophan. Furthermore, at least 10 compounds were observed in thin-layer chromatography,most of which were identified to be indole alkaloids by high-performance liquid chromatography and liquid chromatography-mass spectrum, with a yield up to 2.45 g·L-1. The present work provided technical support for utilization of E. cristatum in Fuzhuan tea.

Eurotium cristatum, fermentation condition, indole alkaloids, component analysis

獲獎名單（20篇）

TS272.5+4；Q946.88

A

1000-369X（2017）05-503-10

2017-06-02

2017-06-19

國家自然科學基金（31670689）

劉麗萍，女，碩士研究生，主要從事茶葉化學生物學研究。*通訊作者：shqianliu@sina.com