正交試驗(yàn)法優(yōu)選痛風(fēng)顆粒水提工藝條件

施明毅，陳梓賢，李小芳，李建利,2*

正交試驗(yàn)法優(yōu)選痛風(fēng)顆粒水提工藝條件

施明毅1，陳梓賢1，李小芳1，李建利1,2*

目的：正交試驗(yàn)法優(yōu)選痛風(fēng)顆粒水提工藝條件。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸含量并進(jìn)行方法學(xué)考察；以綠原酸含量及干浸膏收率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取影響水溶性成分提取率的蒸餾水的量、煎煮提取時(shí)間及煎煮次數(shù)作為考察因素，應(yīng)用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取最佳水提工藝條件。結(jié)果：最佳水提工藝條件為加8 倍量的水，煎煮3 次，每次1 h。結(jié)論：優(yōu)選所得提取工藝條件穩(wěn)定可行，可為痛風(fēng)顆粒的工業(yè)生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

痛風(fēng)顆粒；提取工藝；正交設(shè)計(jì)；綠原酸

1 材料

Agilent1100高效液相色譜儀（儀器包括：Agilent色譜工作站、VMD紫外檢查器，美國(guó)安捷倫公司）；DJ600-2型電子天平（成都倍塞克儀器表研究所）；FA1104N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

金銀花、板藍(lán)根、防己、骨碎補(bǔ)、皂角刺、鹿銜草、膽南星、天竺黃、沒(méi)藥、薏苡仁等藥材（飲片），均購(gòu)于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)該公司檢驗(yàn)科檢驗(yàn)合格。綠原酸（批號(hào)：110753-200413，供含量測(cè)定用）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

痛風(fēng)顆粒處方為臨床上應(yīng)用多年的祖?zhèn)鹘?jīng)驗(yàn)方，由金銀花、板藍(lán)根、骨碎補(bǔ)等多味中藥組成，具有除濕解毒、化瘀散結(jié)的功效，用于熱毒蘊(yùn)結(jié)、痰濕凝滯所致的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作期。方中金銀花、板藍(lán)根等多味中藥富含水溶性有效成分，其中綠原酸為金銀花中重要的有效成分。本試驗(yàn)根據(jù)各藥味的理化性質(zhì)，通過(guò)水煎煮的試驗(yàn)方法，以金銀花的有效成分綠原酸含量、干膏收率為考察指標(biāo)

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 參照《中國(guó)藥典》2015年版一部“金銀花”項(xiàng)下綠原酸含量測(cè)定方法[1]進(jìn)行試驗(yàn)。色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-BI0（4.6×250 mm），5 μm；流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于1000。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備及線性 取綠原酸對(duì)照品約5.09 mg，精密稱(chēng)定，加50%甲醇制成每1 mL含40.7 μg的溶液，即得。精密吸取上述溶液2、4、6、8、10、20 μL，按上述色譜條件，注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y=3121.8962X+5.8821，r=0.9998。結(jié)果綠原酸進(jìn)樣量在0.0814～0.8144 μg范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.1.3 供試品溶液制備及測(cè)定 按處方比例稱(chēng)取經(jīng)60 ℃干燥的金銀花、板藍(lán)根等藥材（飲片）適量，平行9份，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取，將藥液濾過(guò)，合并后放冷，定容至250 mL，精密吸取藥液各2 mL于蒸發(fā)皿中，40 ℃蒸干，殘?jiān)?0%甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備及專(zhuān)屬性 按處方比例稱(chēng)取經(jīng)60 ℃干燥的除金銀花以外的其他藥材（飲片），照供試品溶液制備方法制備，即得。精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照溶液在327 nm處無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 綠原酸對(duì)照品溶液（A)、供試品溶液（B）、陰性對(duì)照溶液（C) HPLC圖譜

2.2 干膏收率測(cè)定

精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下定容后的供試品提取液各20 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105 ℃干燥3小時(shí)，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱(chēng)重，計(jì)算干膏收率。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

查閱文獻(xiàn)[2～6]，水煎煮工藝中，影響水煎煮提取效果主要因素有：加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)。本次試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合處方藥物理化性質(zhì)及臨床療程，以綠原酸含量及干浸膏收率（權(quán)重系數(shù)分別為0.8和0.2）為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，按處方比例稱(chēng)取經(jīng)60 ℃干燥的金銀花、板藍(lán)根等藥材（飲片）適量，共9 份，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。因素水平和試驗(yàn)安排結(jié)果見(jiàn)表1、2 ，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 痛風(fēng)顆粒水煎煮工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表2 痛風(fēng)顆粒水煎煮工藝正交試驗(yàn)結(jié)果表

注：綠原酸含量評(píng)分=綠原酸含量/最大綠原酸含量×100×0.8；干膏收率評(píng)分=干膏收率/最大干膏收率×100×0.2；綜合評(píng)分=綠原酸含量評(píng)分+干膏收率評(píng)分

表3 痛風(fēng)顆粒水煎煮工藝正交試驗(yàn)方差分析表

結(jié)果表明，影響水提取綜合得分的各因素作用的大小為A＞B＞C，A因素有顯著性差異，B和C因素沒(méi)有顯著性差異，綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)需要考慮，確定最佳提取工藝為A3B2C2，即加8倍量水，煎煮3次，每次1小時(shí)。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱(chēng)取經(jīng)60 ℃干燥的金銀花等藥材（飲片），平行3份，按篩選的最佳提取工藝條件提取，結(jié)果綠原酸的平均含量為8.439 mg/g，RSD為1.06%，干膏平均收率為24.98%，RSD為0.97%，說(shuō)明優(yōu)選所得的提取工藝條件穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表4。

表4 痛風(fēng)顆粒水煎煮工藝正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表

3 討論

痛風(fēng)顆粒處方來(lái)源于名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，其經(jīng)驗(yàn)方為湯劑和散劑用于臨床，結(jié)合處方中藥味的有效成分與現(xiàn)代藥理研究，水提工藝開(kāi)始設(shè)計(jì)為采用水煎煮提取金銀花、板藍(lán)根等藥味，方中天竺黃、膽南星等兩味中藥材粉碎成細(xì)粉在制劑成型工藝中與干膏細(xì)粉和輔料進(jìn)行混合，以便更好的發(fā)揮療效。但通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二者混合粉碎時(shí)容易在粉碎過(guò)程中發(fā)熱粘連成塊，增大粉碎難度，影響粉碎效果?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)的可行性，故在后續(xù)工藝考察中，直接加入到水煎煮提取工藝中。

金銀花為君藥之一，與處方的解毒散結(jié)功能相關(guān)，而綠原酸又為其金銀花的主要有效成分之一；防己作為方中佐藥，與其祛濕功能相關(guān)，且防己諾林堿與粉防己堿常作為評(píng)價(jià)防己藥材含量的指標(biāo)，故以綠原酸、防己諾林堿和干膏收率作為指標(biāo)性成分考察，但在含量測(cè)定的過(guò)程中，因復(fù)方中防己藥材處方量相對(duì)較少以及提取過(guò)程的損耗，造成防己諾林堿的含量相對(duì)偏低，不宜進(jìn)行含量測(cè)定，故最終確定綠原酸和干膏收率為綜合指標(biāo)進(jìn)行工藝篩選。綠原酸含量測(cè)定流動(dòng)相預(yù)試驗(yàn)，比較乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）、乙腈-0.4%磷酸溶液（12:88）和乙腈-0.4%磷酸溶液（20:80），試驗(yàn)結(jié)果乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87）效果更好，故選擇此流動(dòng)相作為測(cè)定綠原酸含量。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典. 一部[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：221.

[2] 施明毅，李建利，謝燕，等. 正交試驗(yàn)法優(yōu)選冠心康膠囊水提工藝條件[J]. 成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（1）：55-57,93.

[3] 陶德林.正交法優(yōu)選復(fù)方骨碎補(bǔ)接骨片提取工藝的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2010,27(5):409-411.

[4] 鄭平原,胡詠華,蔣麗,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)肝寧膠囊提取工藝[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(7):35-37.

[5] 劉鋼,張平,夏泉.正交試驗(yàn)法優(yōu)選金銀花的提取工藝研究[J].海峽藥學(xué).2012,24(8):17-19

[6] 俞穎,鄭東升,饒躍峰.復(fù)方鹿銜草顆粒制備工藝的研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南.2012,10(10):4-5.

(責(zé)任編輯：傅舒)

Optimization of extraction process with water of Tongfeng granule by orthogonal design/

SHI Ming-yi1, CHEN Zi-xian1,LI Xiao-fang1, LI Jian-li1,2//(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 611137, Sichuan; 2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610031, Sichuan)

Objective:To optimize the extraction condition with water of Tongfeng granule by orthogonal design.Method:The measurement method of chlorogenic acid was detected by HPLC. The optimum extraction conditions were investigated by the L9(34) orthogonal design. The content of chlorogenic acid and dry extract yield were used as comprehensive evaluation indexes.The water amount, the extraction time and the extraction times were used as factors.Result:The optimal conditions were as follows: the raw materials were extracted three times with 8 times of water for 1 h.Conclusion:This optimized process is stable and feasible. It can provide test basis for industrial production of Tongfeng granule.

Tongfeng granule; extraction process; orthogonal design; chlorogenic acid進(jìn)行綜合評(píng)分，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選痛風(fēng)顆粒最佳水提工藝條件，建立合理有效的提取方法，提高制劑的工藝水平。

R 283.6

A

1674-926X(2017)03-009-03

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（152A0094）；四川省科學(xué)技術(shù)廳科技成果支撐項(xiàng)目（08-2-242）

1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都市 611137；2四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所，成都市 610031

施明毅（1984年12月-），男，醫(yī)學(xué)碩士，助教，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術(shù)，中藥信息化研究。

Tel:15828507258 Email:thj125smy1222@163.com

李建利（1957年10月-），男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主任藥師，主要從事中藥新制劑、新劑型與新技術(shù)研究。

Tel:15902833306 Email:menguan1005@163.com

2016-12-5