白方方，武昱孜，劉茂軍，馮志新，熊祺琰，韋艷娜，馬慶紅，邵國(guó)青

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014)

豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)是一種能夠引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、耳炎、肺炎等病癥的致病性支原體。M.hyorhinis不僅在豬群中普遍存在，同時(shí)也是人類和多種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染物。作為一種常見(jiàn)病原菌，M.hyorhinis通常由母豬或大豬傳染給小豬。已有研究證實(shí)能夠由10%母豬和30%～40%斷奶仔豬的鼻腔分泌物中分離出該支原體。在英國(guó)和美國(guó)的慢性豬肺炎案例中，50%以上均能夠檢測(cè)到M.hyorhinis的存在；同時(shí)在地方性肺炎暴發(fā)群中幾乎每次均能夠分離到M.hyorhinis[1]。在臺(tái)灣，研究者采用M.hyorhinis分離株ATIT-1、3、7混合物氣管內(nèi)注射可以誘發(fā)部分攻毒豬發(fā)生典型的豬支原體肺炎病變，并從大部分攻毒豬肺臟中分離到M.hyorhinis[2]。另外，已有研究證實(shí)M.hyorhinis與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)[3-4]。

迄今為止，對(duì)M.hyorhinis的檢測(cè)方法有培養(yǎng)法、血清學(xué)檢測(cè)方法等，而對(duì)M.hyorhinis檢測(cè)主要以分離培養(yǎng)為主，耗時(shí)較長(zhǎng)，亟需建立一種敏感性高、快速、定量檢測(cè)M.hyorhinis的分子生物學(xué)檢測(cè)方法。本研究建立了M.hyorhinis實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，有助于快速、定量檢測(cè)M.hyorhinis的感染。

1 材料和方法

1.1 菌株 M.hyorhinis、豬肺炎支原體(M.hyopneumoniae)、雞毒支原體(M.gallisepticum)、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV2)、豬瘟病毒(SFV)、豬流感病毒(SIV)均由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑 大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Prem ix Ex TaqTM(Perfect Real-time)、質(zhì)粒載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 引物和探針 根據(jù)GenBank登錄的M.hyorhinis P37序列(X14140.1)設(shè)計(jì)引物和探針(表1)。P37全基因擴(kuò)增引物為P1和P2，預(yù)期擴(kuò)增片段為1212bp，熒光定量PCR檢測(cè)引物為P3和P4，產(chǎn)物大小為79bp。引物和探針均由TaKaRa公司合成。

1.4 M.hyorhinis p37重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取臨床采集的疑似M.hyorhinis肺組織樣品基因組DNA，并以其為模板使用P1和P2擴(kuò)增M.hyorhinis p37基因，同時(shí)以健康肺組織DNA為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為：94℃ 5m in；94℃ 60s、50℃ 60s、72℃100s，30個(gè)循環(huán)；72℃10m in。回收PCR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列相似性分析，確定為M.hyorhinis p37基因。

表1 引物序列Table 1Primers sequence

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 以重組質(zhì)粒為模板，采用矩陣法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，并優(yōu)化退火溫度和模板濃度、引物濃度。反應(yīng)體系為 25μL，其中 2×Premix Ex Taq 12.5μL，P3、P4各 1μL，Taq Man探針 1μL，DNA模板 1μL，校正染料Rox 1μL，去離子水補(bǔ)至25μL。優(yōu)化后的反應(yīng)條件為95℃10min；95℃15s、53℃1min，40個(gè)循環(huán)，53℃測(cè)定熒光值。

1.6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以M.hyorhinis p37基因陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并計(jì)算拷貝數(shù)，分別稀釋至1.0×108拷貝 /μL～1.0×101拷貝 /μL，按照優(yōu)化的 PCR 反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析得出不同拷貝數(shù)的Ct值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 熒光定量PCR的敏感性試驗(yàn) 將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10倍倍比稀釋為 1.0×108拷貝 /μL～1.0×101拷貝/μL濃度梯度，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定該方法的敏感性。

1.8 熒光定量PCR的特異性試驗(yàn) 分別以健康豬DNA、 M.hyorhinis、 M.hyopneumoniae、 M.gallisepticum、 M.flocculare， M.hyosynoviae， H.parasuis、A.pleuropneumoniae的基因組DNA及PCV2、SFV、SIV的核酸樣品為模板，在相同的條件下進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)分子信標(biāo)與目的DNA結(jié)合的特異性。

1.9 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn) 以1.0×107拷貝 /μL～1.0×103拷貝 /μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR分析，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性。

1.10臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對(duì)江蘇地區(qū)某豬場(chǎng)55份臨床肺組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)按照參考文獻(xiàn)分別利用分離培養(yǎng)法[5]和普通PCR方法[6]進(jìn)行檢測(cè)，比較分離培養(yǎng)法、普通PCR和熒光定量PCR的檢出率。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以疑似陽(yáng)性M.hyorhinis DNA為模板，以P1、P2為引物擴(kuò)增p37基因，結(jié)果顯示，擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期目的片段相符(1212bp)(圖1)?；厥誔CR產(chǎn)物并克隆至pMD18-T載體中，測(cè)定序列。將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知的各種微生物核苷酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)，與M.hyorhinis p37基因序列(CP002170.1)同源性達(dá)99%。表明M.hyorhinisp37基因重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 M.hyorhinis p37基因擴(kuò)增Fig.1Amplification of M.hyorhinis p37gene

2.2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以不同拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以Ct值為Y軸，重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率為-3.267，軸截距為 40.535，方程式為 y=-3.267x+40.535。標(biāo)準(zhǔn)曲線具有很高的相關(guān)性，R2>0.99(圖2)。

2.3 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn) 將M.hyohinis重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，熒光定量PCR的最低檢測(cè)限為10拷貝 /μL(圖 3)。

2.4 熒光定量PCR特異性試驗(yàn) 采用熒光定量PCR方法以健康豬DNA、M.hyorhinis、M.hyopneumoniae、 M.flocculare， M.hyosynoviae， M.gallisepticum、H.parasuis、A.pleuropneumoniae的基因組DNA及PCV2、SFV、SIV的核酸樣品為模板，M.hyorhinis菌株的擴(kuò)增曲線為陽(yáng)性，其他樣品均為陰性(圖4)。

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)M.hyorhinis標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2Standard curve generated from positive plasm id of M.hyorhinis by real-time PCR

圖3 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3Sensitivity tests of real-time PCR

圖4 熒光定量PCR特異性檢測(cè)Fig.4Specificity tests of real-time PCR

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì) 1.0×107拷貝 /μL～1.0×103拷貝/μL的質(zhì)粒DNA進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增，檢測(cè)熒光定量PCR的重復(fù)性，結(jié)果表明，Ct值變異系數(shù)均小于2%，該檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性(表2)。

2.6 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)江蘇地區(qū)某豬場(chǎng)55份臨床肺組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，建立的熒光定量PCR方法的檢出率為87.3%(48/55)，而分離培養(yǎng)方法和普通PCR方法的檢出率分別為41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。熒光定量PCR方法與分離培養(yǎng)方法及普通PCR方法相比檢出率大大提高。

表2 熒光定量PCR組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2Intra-and inter-assay of real-time PCR reproducibility

3 討 論

目前，用于M.hyorhinis的檢測(cè)方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)檢測(cè)3大類。病原學(xué)檢測(cè)由組織分離病原及鏡檢，該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且檢出率低。免疫學(xué)檢測(cè)方法有ELISA[7]、免疫膠體金快速檢測(cè)卡(GICAs)[8]。分子生物學(xué)方法目前有基于p37基因的原位雜交方法[9]，而國(guó)內(nèi)外尚未有對(duì)M.hyorhinis定量檢測(cè)的分子生物學(xué)方法的報(bào)道。M.hyorhinis P37蛋白能夠誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子[10]，P37蛋白是該病原的重要特異性膜蛋白，以該蛋白基因?yàn)榘谢蚩梢蕴禺愋詸z測(cè)該病原。本研究建立的熒光定量PCR方法根據(jù)M.hyorhinis p37基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和MGB探針，建立了M.hyorhinis熒光定量PCR檢測(cè)方法。

Makhanon等[11]比較分離培養(yǎng)方法和普通PCR方法對(duì)270份臨床肺組織樣品中M.hyorhinis的檢測(cè)，結(jié)果表明，分離培養(yǎng)法的檢出率為18.15%(49/270)，而常規(guī)單套16S rDNA PCR方法的檢出率為5.19%(14/270)。普通PCR的敏感性較低，不能滿足臨床樣品檢測(cè)的需求，而本實(shí)驗(yàn)建立的Taq-Man MGB探針?lè)椒〝U(kuò)增的M.hyorhini片段較小，檢測(cè)的特異性大大提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)55份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，建立的熒光定量PCR方法的陽(yáng)性檢出率為87.3%(48/55)，而分離培養(yǎng)方法及普通單套p37DNA PCR的陽(yáng)性檢測(cè)率分別為41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。表明熒光定量PCR方法敏感性比分離培養(yǎng)方法及普通PCR方法高。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的M.hyorhinis熒光定量PCR檢測(cè)方法具有較好的特異性、敏感性及穩(wěn)定性，可以用于臨床樣品的檢測(cè)，是對(duì)M.hyorhinis分子生物學(xué)定量檢測(cè)方法的有益補(bǔ)充。

[1]Straw B E,Zimmerman J J,A llaire S D,et al.Disease of swine[M].9th edition,Oxford:Blackwell publishing,2006,715-816.

[2]Lin Jun-Hong,Chen Shi-Ping,Yeh K S,et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan:Diagnosis and isolation of sw ine pneumonia pathogen[J].Vet M icrobioly,2006,115:111-116.

[3]Yong Hua,Qu Li-ke,Ma Hua-chong,et al.Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells[J].BMC Gastroenterol,2010,10:132.

[4]Urbanek G,Goodison S,Chang M,et al,Detection of antibodies directed at M.hyorhinis p37in the serum ofmen with new ly diagnosed prostate cancer[J].BMC Cancer,2011,11:233.

[5]韋艷娜，白昀，孔猛，等.豬肺炎支原體的分離方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28(1)：104-107.

[6]Caron J,Ouardani M,Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36and p46genes[J].JClin M icrobiol,2000,8(4):1390-1396.

[7]劉星，張麗芳，楊玉萍，等.抗豬鼻支原體單克隆抗體的研制及雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法的建立[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(3)：55-58.

[8]楊玉萍，劉星.豬鼻支原體感染免疫膠體金快速檢測(cè)卡的研制[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(2)：85-87.

[9]Kim B,Lee K,Han K,et al.Development of in situ hybridization for the detection of Mycoplasma hyorhinis in formalin-fixed paraffin-embedded tissues from naturally infected pigs w ith polyserositis[J].JVet Med Sci,2010,72(9):1225-1227.

[10]Ketcham C M,Anai S,Reutzel R,et al.p37induces tumor invasiveness[J].Mol Cancer Ther,2005,4(7):1031-1038.

[11]Makhanon M,Tummaruk P,Thongkamkoon P,et al.Comparison of detection procedures of Mycoplasma hyopneumoniae,Mycoplasma hyosynoviae,and Mycoplasma hyorhinis in lungs,tonsils,and synovial fluid of slaughtered pigs and their distributions in Thailand[J].Trop Anim Health Prod,2012,44:313-318.?