高效液相色譜–原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)

夏擁軍

(張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇張家港 215600)

高效液相色譜–原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)

夏擁軍

(張家港出入境檢驗檢疫局，江蘇張家港 215600)

建立高效液相色譜–原子熒光光譜法對水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)［亞砷酸鹽As(Ⅲ)、砷酸鹽As(Ⅴ)、一甲基砷酸、二甲基砷酸］進(jìn)行測定。優(yōu)化后的實驗條件：負(fù)高壓為270 V，燈電流為80 mA，原子化高度為10 mm，硼氫化鉀濃度為20 g/L (含5 g/L KOH)，載流為體積分?jǐn)?shù)5%的鹽酸。方法的線性范圍為0～100 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999。各種砷形態(tài)的檢出限為0.20～0.45 μg/L；測量結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～4.81%(n=6)；加標(biāo)回收率為88.4%～101.7%。該方法靈敏度高，快速、準(zhǔn)確，檢測成本低，可用于水產(chǎn)品中砷形態(tài)的檢測。

水產(chǎn)品；砷形態(tài)；液相色譜–原子熒光法

近年來，水產(chǎn)品的砷污染對人類健康產(chǎn)生的危害得到人們的高度關(guān)注。不同化學(xué)形態(tài)的元素在生物體內(nèi)發(fā)生的作用不同，因此目前元素檢測的趨勢是對各元素的化學(xué)形態(tài)進(jìn)行鑒別和定量，而不僅是對元素總量進(jìn)行測定［1–2］。砷是一種劇毒的非金屬元素，砷對人體的心血管、肝臟及腎臟皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)等都具有嚴(yán)重的損傷，被國家列為一級致癌物質(zhì)。砷的常見形態(tài)有亞砷酸鹽［As(Ⅲ )］、砷酸鹽［As(Ⅴ )］、二甲基砷酸(DMA)、一甲基砷酸(MMA)。現(xiàn)代研究表明，砷元素毒性的大小不僅與其總量有關(guān)，還與砷具體的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)。在砷的各種形態(tài)中，無機(jī)砷［As(Ⅲ)，As(Ⅴ)］的毒性較大，而有機(jī)砷(DMA，MMA)的毒性相對較小。以砷化合物的半致死量為標(biāo)準(zhǔn)，對有機(jī)砷的毒性進(jìn)行排序，由高到低依次為一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、砷膽堿 (AsC)、砷甜菜堿 (AsB)［3–5］。因此對砷進(jìn)行形態(tài)檢測具有重要的意義［6–7］。

在砷的形態(tài)檢測過程中，一般采用聯(lián)用技術(shù)對砷進(jìn)行形態(tài)分離，主要有高效液相色譜–電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜–氫化物發(fā)生原子熒光光譜法、高效液相色譜–氫化物發(fā)生原子吸收光譜法和毛細(xì)管電泳–電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法等［8–9］。上述檢測方法中，高效液相色譜–氫化物發(fā)生原子熒光光譜法具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡便、儀器使用維護(hù)成本低等優(yōu)點［10］。

筆者采用硝酸–熱輔助提取法對水產(chǎn)品中砷化合物進(jìn)行提取，利用高效液相色譜結(jié)合原子熒光光譜技術(shù)對其中4種砷形態(tài)化合物進(jìn)行測定，優(yōu)化了氫化物發(fā)生條件，調(diào)整載流和還原劑的濃度，使待測物的信號達(dá)到最佳狀態(tài)，與高效液相色譜–電感耦合等離子質(zhì)譜法相比，該方法具有簡單、快速、檢測成本低等特點，可以用于水產(chǎn)品中砷形態(tài)化合物的日常檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–原子熒光聯(lián)用儀：AFS–LC200 型，北京海光儀器有限公司；

超純水發(fā)生器：美國Millipore公司；

電子天平：AT201型，瑞士梅特勒–托利多集團(tuán)；

高速離心機(jī)：X3R型，美國賽默飛世爾科技有限公司；

恒溫箱：FD115–45型，德國Binder公司；

pH計：DELTA 320型，瑞士梅特勒–托利多集團(tuán)；

砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(32.4±0.7) μg/g，編號為GBW 08667，中國計量科學(xué)研究院；

亞砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(124.3±2.0) μg/g，編號為GBW 08666，中國計量科學(xué)研究院；

一甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(46.2±1.5) μg/g，編號為GBW 08668，中國計量科學(xué)研究院；

二甲基砷溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(97.4±3.3) μg/g，編號為GBW 08669，中國計量科學(xué)研究院；

鹽酸溶液：量取100 mL鹽酸(優(yōu)級純)，溶于水并稀釋至1 000 mL；

硝酸溶液：0.15 mol/L，量取 10 mL 硝酸 (優(yōu)級純)，溶于水并稀釋至1 000 mL；

氫氧化鉀溶液：5 g/L，稱取5 g氫氧化鉀(優(yōu)級純)，溶于水并稀釋至1 000 mL；

硼氫化鉀溶液：20 g/L，稱取20 g硼氫化鉀，用5 g/L氫氧化鉀溶液溶解并定容至1 000 mL，現(xiàn)用現(xiàn)配；

磷酸氫二鈉–磷酸二氫鉀混合溶液：稱取0.895 4 g磷酸氫二鈉、3.026 g磷酸二氫鉀，溶于500 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH至5.92，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后，于超聲水浴中超聲脫氣30 min，備用；

魚、河蝦、大閘蟹、鮮貝樣品：市售；

實驗用水為超純水發(fā)生器制備的二級以上純水(電阻率大于18.2 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

砷混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別準(zhǔn)確移取砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液［As(Ⅴ )］、亞砷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液［As(Ⅲ )］、一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液、二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用水溶解稀釋，4種砷形態(tài)溶液的質(zhì)量濃度均為1.0 mg/L。

砷標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：取7只10 mL容量瓶，分別準(zhǔn)確加入1.00 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液0.00，0.050，0.10，0.20，0.30，0.50，1.0 mL，加水稀釋至標(biāo)線，混勻。此混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中4種砷形態(tài)的質(zhì)量濃度分別為 0.0，5.0，10.0，20.0，30.0，50.0，100.0 μg/L。

1.3 試樣處理

取樣品的可食部分勻漿，裝入潔凈的聚乙烯瓶中，密封，于冰箱中4℃冷藏備用。稱取約1.0 g樣品(準(zhǔn)確至0.001 g)，置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL硝酸溶液，放置過夜。于90℃恒溫箱中熱浸提2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出冷卻至室溫。以8 000 r/min離心15 min，取5 mL上清液于離心管中，加入5 mL正己烷，振搖1 min，以8 000 r/min離心15 min，棄去上層正己烷。按此過程重復(fù)一次。吸取下層清液，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾及C18小柱凈化后進(jìn)樣。按同一操作方法做空白試驗［11］。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 液相色譜

陰 離 子 交 換 柱：Hamilton PRP–X100柱（250 mm×4.1 mm，10 μm，北京海光儀器有限公司)；流動相：磷酸氫二鈉–磷酸二氫鉀混合溶液(pH 5.92)，流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：100 μL；柱溫：40℃；液相色譜梯度洗脫程序：等度洗脫。

1.4.2 原子熒光光譜

還原劑：20 g/L硼氫化鉀溶液–5 g/L氫氧化鉀溶液；載流：5%的鹽酸溶液；負(fù)高壓：270 V；原子化器高度：10 mm；燈電流：80 mA；輔助燈電流：30 mA；載氣：氬氣，流量為400 mL/min；屏蔽氣：氬氣，流量為400 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件

2.1.1 提取劑濃度

配制不同濃度(0.05，0.08，0.10，0.12，0.15，0.18，0.20，0.22，0.25，0.30 mol/L)的硝酸溶液，對試樣分別提取后進(jìn)行測定，不同硝酸溶液濃度對應(yīng)的砷信號值見圖1。由圖1可見，砷酸鹽、亞砷酸鹽、一甲基砷和二甲基砷的提取量隨硝酸濃度的提高而增加，當(dāng)硝酸濃度達(dá)到0.15 mol/L時，4種砷形態(tài)的提取量均達(dá)到最大值；當(dāng)硝酸濃度繼續(xù)增大時，4種砷形態(tài)的提取量保持穩(wěn)定增長；當(dāng)硝酸濃度大于0.20 mol/L時，4種砷形態(tài)的提取量開始下降。從環(huán)保的角度及提取率綜合考慮，選擇硝酸濃度為0.15 mol/L。

圖1 不同硝酸溶液濃度對應(yīng)的砷信號值

2.1.2 提取時間

固定提取劑硝酸溶液的濃度為0.15 mol/L，提取溫度為90℃，考察不同提取時間對砷提取效率的影響。結(jié)果表明，4種砷形態(tài)的提取率隨提取時間的延長而增大，當(dāng)提取時間為2.5 h時，提取率達(dá)到最大；當(dāng)提取時間大于2.5 h時，提取率有下降的趨勢，可能是由于提取時間過長而導(dǎo)致一部分砷損失?？紤]到工作效率和試劑成本，選擇提取時間為2.5 h。

2.2 原子熒光光譜儀工作條件的優(yōu)化

2.2.1 燈電流

原子熒光燈電流的大小，代表了激發(fā)光源的強弱。燈電流越大說明激發(fā)光源越強，靈敏度越高；但燈電流過大不僅會引起一定程度的自吸，還會導(dǎo)致燈的使用壽命降低。不同燈電流對應(yīng)的熒光信號值見圖2。由圖2可知，當(dāng)燈電流達(dá)到80 mA時，砷的熒光信號值最強，而當(dāng)燈電流繼續(xù)升高時，砷的熒光信號值基本保持穩(wěn)定，考慮到燈的使用壽命以及減少燈信號自吸等因素，選擇燈電流為80 mA。

圖2 不同燈電流對應(yīng)的砷信號值

2.2.2 光電倍增管負(fù)高壓

在儀器其它條件固定的情況下，改變光電倍增管的負(fù)高壓，觀察負(fù)高壓對砷信號值的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)砷信號值隨負(fù)高壓的升高而增大，但負(fù)高壓過大，會導(dǎo)致噪聲過強，信噪比降低；當(dāng)光電倍增管負(fù)高壓為270 V時，砷信號值最強；當(dāng)負(fù)高壓繼續(xù)升高時，砷的熒光信號值基本保持穩(wěn)定。綜合考慮，選擇光電倍增管負(fù)高壓為270 V。

2.2.3 載流鹽酸濃度

載流鹽酸濃度對砷信號值有著重要的影響，配制體積分?jǐn)?shù)不同的9種鹽酸溶液(1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%，7.0%，8.0%，9.0%)，對 50 μg/L砷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，不同鹽酸體積分?jǐn)?shù)對應(yīng)的砷熒光信號值見圖3。由圖3可知，當(dāng)鹽酸的體積分?jǐn)?shù)小于5%時，隨著鹽酸體積分?jǐn)?shù)的增大，砷的熒光信號值逐漸增大；當(dāng)鹽酸的體積分?jǐn)?shù)為5%時，砷的熒光信號值達(dá)到最大；當(dāng)鹽酸體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時，砷的熒光信號值略有下降，考慮到試劑成本和環(huán)保因素，選擇載流鹽酸的體積分?jǐn)?shù)為5.0%。

圖3 不同鹽酸體積分?jǐn)?shù)對應(yīng)的砷信號值

2.2.4 硼氫化鉀濃度

配制9種不同質(zhì)量濃度的硼氫化鉀溶液(4，8，12，16，20，24，28，32，36 g/L)，對 50 μg/L 砷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，不同硼氫化鉀質(zhì)量濃度對應(yīng)的砷熒光信號值見圖4。由圖4可知，當(dāng)硼氫化鉀質(zhì)量濃度小于20 g/L時，隨著硼氫化鉀質(zhì)量濃度的增加，砷的信號值增大；當(dāng)硼氫化鉀質(zhì)量濃度為20 g/L時，砷的信號值達(dá)到最大；而當(dāng)硼氫化鉀質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，砷的熒光信號值基本保持穩(wěn)定，考慮到試劑成本和環(huán)保因素，選擇硼氫化鉀的質(zhì)量濃度為20 g/L。

圖4 不同硼氫化鉀濃度對應(yīng)的砷信號值

2.3 色譜圖

在1.4儀器工作條件下對50 μg/L的砷混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測試，色譜圖見圖5。由圖5可見，在8 min之內(nèi)，亞砷酸鹽、二甲基砷酸、一甲基砷酸、砷酸鹽依次出峰，實現(xiàn)了完全分離，其保留時間分別為 2.703，3.393，4.29，6.882 min。

圖5 砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.4 線性范圍及檢出限

在1.4儀器工作條件下，對1.2中系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測定。以熒光強度(Y)為縱坐標(biāo)，以砷形態(tài)的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到4種砷形態(tài)的線性方程。對試劑空白測定20次，以標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值的3倍計算4種砷形態(tài)的檢出限。線性方程、線性范圍和檢出限見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及檢出限

2.5 精密度與加標(biāo)回收試驗

以鯽魚樣品為研究對象，向樣品中分別加入3種不同水平 (0.1，1.0，10.0 μg/L)的無機(jī)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測定，加標(biāo)1 μg/L的色譜圖見圖6，加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算結(jié)果見表2。

圖6 加標(biāo)樣品色譜圖

表2 精密度及回收試驗結(jié)果(n=6) %

由表2可知，4種砷形態(tài)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～4.81%(n=6)，加標(biāo)回收率為88.4%～101.7%可見本方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

2.6 樣品測定

用本方法對市售魚、蝦、蟹和貝類4種水產(chǎn)品樣品中的4種砷形態(tài)含量進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。由表3可知，10份被測樣品中亞砷酸鹽含量在5.1～33.9 μg/kg之間，砷酸鹽含量在3.2～23.8 μg/kg之間，一甲基砷酸、二甲基砷酸的含量分別為 0～4.2 μg/kg，0～5.5 μg/kg，相對較低。無機(jī)砷(亞砷酸鹽與砷酸鹽之和)含量在9.4～57.7 μg/kg范圍內(nèi)。

GB 2762–2012規(guī)定魚類及其制品中無機(jī)砷的限量值為100 μg/kg，其它水產(chǎn)動物及其制品的無機(jī)砷的限量值為 500 μg/kg［12］?？梢姶舜嗡鶛z測的10份樣品中無機(jī)砷［As(Ⅲ）與As(Ⅴ)之和］的含量均在限量值以內(nèi)。

表3 水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)的測定結(jié)果 μg/kg

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜–原子熒光光譜法測定水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)，該方法樣品前處理簡單，靈敏度高，回收率穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，雜質(zhì)干擾少，檢測成本較低，適用于各類水產(chǎn)品中4種砷形態(tài)的測定。

［1］吳燁飛，潘友浩，李榮茂.高效液相色譜–氫化物–原子熒光聯(lián)用技術(shù)測定海藻中無機(jī)砷［J］.福建水產(chǎn)，2014，36(2): 125–131.

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［11］GB 5009.11–2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定［S］.

［12］GB 2762–2012 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量［S］.

Determination of 4 Arsenic Species in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatography–Atomic Fluorescence Spectrometry

Xia Yongjun
(Zhangjiagang Entry–Exit Inspection & Quarantine Bureau of P.R.C, Zhangjiagang 215600, China)

A method for determination of four arsenic species ［As(Ⅲ), As(Ⅴ), MMA, DMA］in aquatic products by high performance liquid chromatography–atomic fluorescence spectrometry was developed. The experiment conditions were optimized. The negative high voltagewhich was 270 V, lamp current was 80 mA, the atomic height was 10 mm,the concentration of potassium borohydride was 20 g/L (with 5 g/L KOH), and carrying current was 5% hydrochloric acid. The linear range of the method was 0–100 μg/L, the correlation coefficients were more than 0.999. The detection limits of various arsenic species were 0.20–0.45 μg/L. The relative standard deviations of detection results were 1.98%–4.81%(n=6), and the addion recovery rates were 88.4%–101.7%. The method is rapid, accurate and sensitive, it is suitable for the determination of arsenic species in aquatic products.

aquatic products; arsenic speciation; liquid chromatography atomic fluorescence spectrometry

O657.7

A

1008–6145(2017)05–0046–05

10.3969/j.issn.1008–6145.2017.05.012

聯(lián)系人：夏擁軍；E-mail: hixiayongjun@163.com

2017–06–26