復(fù)合酶協(xié)同發(fā)酵紫蘇粕制備天然調(diào)味料的研究

郝磊，郝學(xué)財，鄧莉，祖慶勇，劉媛，周濤

（天津春發(fā)生物科技集團有限公司天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點實驗室，天津 300300）

復(fù)合酶協(xié)同發(fā)酵紫蘇粕制備天然調(diào)味料的研究

郝磊，郝學(xué)財，鄧莉，祖慶勇，劉媛，周濤

（天津春發(fā)生物科技集團有限公司天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點實驗室，天津 300300）

以紫蘇粕為主要發(fā)酵原料，對米曲霉和黑曲霉制曲工藝進行了優(yōu)化，在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計，建立了制曲溫度、制曲時間和菌種比例作為影響因素與響應(yīng)值酸性／中性蛋白酶酶活之間的回歸方程模型，確定制曲工藝最優(yōu)條件為制曲溫度32℃，制曲時間30 h，米曲霉和黑曲霉接種比2.5∶1，在此條件下成曲中性和酸性蛋白酶酶活分別為1572，1023 U／g，與理論值基本相符。添加復(fù)合酶協(xié)同發(fā)酵，并與對照發(fā)酵組比較，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶發(fā)酵組中的總氮、氨態(tài)氮和還原糖含量及水解度均高于對照組，感官分析結(jié)果表明復(fù)合酶發(fā)酵組相比對照組風(fēng)味較好。

米曲霉；黑曲霉；制曲；協(xié)同發(fā)酵；呈味物質(zhì)

在我國，紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt）的種植歷史已有兩千多年［1］，作為一種傳統(tǒng)藥食兩用植物，其不僅具有食用的價值，而且還具有保健功能和一定的藥效［2，3］。紫蘇籽營養(yǎng)極為豐富，含有的大量不飽和脂肪酸具有降血脂、抗衰老和抗過敏等作用，在醫(yī)藥保健等方面得到了廣泛應(yīng)用［4－7］。紫蘇粕是紫蘇籽榨油后的副產(chǎn)物，含有40%左右的植物蛋白以及人體必需的多種氨基酸，對人類的身體健康有益而無害，但是，紫蘇粕還未被廣泛應(yīng)用于我國的食品工業(yè)中，目前一般都是作為飼料粕廉價處理［8］，造成了大量的蛋白質(zhì)資源的浪費，且紫蘇粕的附加值利用率很低［9，10］。

調(diào)味料作為人們生活的必需品，具有改善食品風(fēng)味、突出呈味特性等作用。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，調(diào)味料正在發(fā)生著從化學(xué)調(diào)味料到天然調(diào)味料的轉(zhuǎn)變。其中，發(fā)酵調(diào)味料產(chǎn)品的原料天然、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)健康，所具有的獨特優(yōu)勢是其他調(diào)味料無可比擬的［11］。

目前，越來越多的科研工作者將低值農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵調(diào)味品的原料，他們利用蛋白酶解、微生物發(fā)酵、美拉德反應(yīng)及分離等技術(shù)，將豆粕、花生粕、核桃粕等低值蛋白資源用于調(diào)味料的生產(chǎn)［12－14］，但是針對采用微生物發(fā)酵紫蘇粕制備調(diào)味產(chǎn)品的研究還未見報道。本文以紫蘇粕為主要原料，利用米曲霉和黑曲霉的菌種組合優(yōu)化制曲工藝，添加復(fù)合酶協(xié)同水解，利用微生物發(fā)酵法制備天然的風(fēng)味調(diào)味料，開拓紫蘇粕新的利用途徑，豐富發(fā)酵調(diào)味料產(chǎn)品的種類。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粕，購于天津貴新飼料科技有限公司；小麥和雞肉，購自當?shù)厥袌?；米曲?.042和黑曲霉3.350，實驗室保藏；風(fēng)味蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，購于諾維信（中國）有限公司。

葡萄糖、乙醇、干酪素、Folin試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸鋅、氫氧化鈉、酪氨酸、甲醛溶液、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、濃鹽酸、冰醋酸、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、亞甲基藍等，均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

立式高壓蒸汽滅菌器 上海東亞壓力容器制造有限公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NH-218B食品料理機 慈溪市寧匯電器有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；FA3204B電子天平 上海天美天平儀器有限公司；UV752N紫外可見分光光度計 杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FE28 p H計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

原料→潤水→蒸煮滅菌→冷卻→接種→制曲→二次翻曲→成曲→復(fù)合酶添加→發(fā)酵→滅菌→濃縮→調(diào)味料產(chǎn)品。

1.3.2 實驗要點

1.3.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮的雞肉剔除脂肪，洗凈后攪碎備用。將紫蘇粕與小麥按照質(zhì)量比為2∶1的比例混合均勻，加入二者總質(zhì)量20%的雞肉充分混合，然后加入與物料等量的蒸餾水，拌勻后置于高壓滅菌鍋中，121℃蒸煮滅菌15 min。

1.3.2.2 制曲

待原料冷卻至室溫后按接種量0.1%（原料重量計）接入黑曲霉和米曲霉雙菌種，充分混合均勻。恒溫通風(fēng)培養(yǎng)箱中進行制曲，制曲溫度為28～36℃，制曲時間為24～36 h，期間進行2次翻曲，待長出黃綠色的菌體，即制得成曲。

1.3.2.3 發(fā)酵

將成熟曲料放入發(fā)酵罐，加入1.5倍曲料重量的鹽水（NaCl含量為10%）進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度42℃，15天后調(diào)整發(fā)酵溫度為36℃，繼續(xù)發(fā)酵20天后收集發(fā)酵產(chǎn)物，121℃滅菌20 min，過60目篩后濃縮制得雞肉風(fēng)味調(diào)味料。

1.3.3 制曲條件的優(yōu)化

以制曲時間、制曲溫度和米曲霉／黑曲霉曲精的添加比例為因素，研究其對成曲酸性和中性蛋白酶酶活的影響。

1.3.3.1 菌種比例對成曲中蛋白酶酶活的影響

設(shè)定制曲溫度30℃，制曲時間為24 h的條件下，在米曲霉和黑曲霉種曲添加比例為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3時，測定成曲酸性和中性蛋白酶的酶活性。

1.3.3.2 制曲溫度對成曲中蛋白酶酶活的影響

在制曲過程中添加米曲霉和黑曲霉的比例為2∶1，分別在28，30，32，34，36℃條件下制曲24 h，測定分析培養(yǎng)溫度對成曲酸性和中性蛋白酶酶活的影響。

1.3.3.3 制曲時間對成曲中蛋白酶酶活的影響

30℃的制曲條件下，添加米曲霉和黑曲霉的比例為2∶1進行制曲，測定24，28，32，36，40 h的制曲時間下成曲酸性和中性蛋白酶的酶活。

1.3.3.4 制曲工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

以酸性和中性蛋白酶的酶活性為響應(yīng)值，按照Box-Behnken實驗設(shè)計原理，以制曲時間（24，30，36 h）、制曲溫度（28，32，36℃）和米曲霉和黑曲霉曲精的添加比例（3∶1，2∶1，1∶1）為因變量，對制曲條件進行優(yōu)化，并得到最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.3.5 復(fù)合酶添加對發(fā)酵的協(xié)同作用

選擇最佳制曲工藝制得的成曲，按重量均分為兩份。往其中一份成曲中添加風(fēng)味蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶組成的復(fù)合酶后，與另一份成曲同時按照文中1.4.2.3所述的發(fā)酵方法進行后續(xù)發(fā)酵，并測定發(fā)酵過程中的水解度及主要成分，對比分析復(fù)合酶在發(fā)酵過程中的作用。

1.3.6 測定方法

蛋白酶活力的測定：福林法，參照SB／T 10317－1999。

總氮的測定：凱氏定氮法，參照GB 5009.5－2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

氨基酸態(tài)氮含量的測定：甲醛滴定法，參照GB／T 5009.39－2003《醬油衛(wèi)生標準的分析方法》。

還原糖的測定：參照ZB／X 66040－87。

水解度（DH）為從蛋白質(zhì)中裂解出來的游離氨基酸所占的比例，計算方法為［15］：

式中：N1和N2分別表示發(fā)酵前后游離氨基酸態(tài)氮含量；N3表示發(fā)酵液中總氮含量。

1.3.7 感官品評

感官分析參照馮云子等［16］的方法，對發(fā)酵產(chǎn)物進行鮮味、肉味、甜味、苦味、厚味和醬香味的感官評價。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

將所有測試重復(fù)進行3次，用SPSS 14.0軟件的統(tǒng)計分析軟件對所有數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 菌種比例對成曲中蛋白酶酶活性的影響

在制曲溫度30℃條件下培養(yǎng)24 h，比較米曲霉和黑曲霉曲精添加比例為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3時，成曲酸性和中性蛋白酶酶活性，并以單獨添加米曲霉和黑曲霉制曲作為對照。

圖1 菌種比例對成曲中蛋白酶酶活性的影響Fig.1 Effect of ratio of A.oryzae to A.niger（W／W）on activities of neutral protease and acid protease of koji

由圖1可知，只使用米曲霉與曲精添加比為3∶1和2∶1時制得的成曲，中性蛋白酶的酶活數(shù)值相近，隨著黑曲霉添加量占比的提高，成曲中性蛋白酶活性逐漸下降，酸性蛋白酶的酶活則不斷提高。米曲霉分泌的蛋白酶以中性蛋白酶為主，具有外切酶活性的酸性蛋白酶的分泌量較少［17］；黑曲霉具有較強的分泌酸性蛋白酶的能力，因此利用黑曲霉與米曲霉混合制曲，可以提高成曲中的酸性蛋白酶活力，促進游離氨基酸的釋放，進而增強發(fā)酵產(chǎn)品的特征風(fēng)味［18］。

2.1.2 制曲溫度對成曲中蛋白酶酶活性的影響

培養(yǎng)溫度是制曲工藝中重要的影響因素，與霉菌的生長狀況及成曲中的蛋白酶活性有著密切的聯(lián)系。

圖2 制曲溫度對成曲中蛋白酶酶活性的影響Fig.2 Effect of culture temperature on activities of neutral protease and acid protease of koji

由圖2可知，隨著制曲溫度的提高，蛋白酶酶活逐漸增加，并在32℃條件下，中性和酸性蛋白酶活性達到最高值，但制曲培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，蛋白酶活性出現(xiàn)不同程度的下降，且出曲總量開始降低。另外，霉菌進入菌絲體生長繁殖的時期，放出大量的熱，進而使大曲品溫上升，因此，在實驗中進行2次翻曲，并通風(fēng)避免燒曲，從而保證成曲的質(zhì)量。

2.1.3 制曲時間對成曲中蛋白酶酶活性的影響

制曲過程中，成曲中性和酸性蛋白酶的酶活不斷變化。

圖3 制曲時間對成曲中性和酸性蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of culture time on activities of neutral protease and acid protease of koji

由圖3可知，在制曲時間為24 h時，中性和酸性蛋白酶的酶活性較低，隨著制曲時間的延長，酶活不斷提高，其中中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶活性分別在32，36 h達到最高值。在制曲的后半程，由于曲霉孢子已處于過生長階段，成曲質(zhì)量開始下降，因此中性和酸性蛋白酶的酶活力也隨之降低。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

以制曲時間、制曲溫度、菌種比例為實驗因變量，以成曲中酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活性為目標值，對制曲條件進行優(yōu)化，具體的實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面法優(yōu)化制曲條件的實驗結(jié)果Table 1 Results of RSM for optimization of koji-making conditions

續(xù) 表

2.2.1 中性蛋白酶的響應(yīng)面結(jié)果分析

成曲中性蛋白酶酶活性的響應(yīng)面方差分析結(jié)果見表2。

表2 中性蛋白酶酶活的響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA for response surface quadratic model of neutral protease activity

由表2可知，F(xiàn)值為30.28，“Prob＞F”＜0.0001，說明該模型高度顯著。該模型失擬項的“Prob＞F”為0.2042，失擬項不顯著，說明該模型可以用于分析中性蛋白酶的酶活變化?；貧w模型的方差分析結(jié)果表明：模型中一次項A和C、交互作用項AB及二次項A2，B2，C2為顯著影響因子。用Design Expert 10分析軟件對數(shù)據(jù)進行擬合（見圖4），得到中性蛋白酶酶活的二次回歸方程為：中性蛋白酶酶活＝1587.04＋78.77×?xí)r間－12.70×溫度＋101.13×比例－142.99×?xí)r間×溫度－29.92×?xí)r間×比例－58.42×溫度×比例－234.72×?xí)r間2－395.87×溫度2＋36.95×比例2。

圖4 成曲中性蛋白酶酶活的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot of neutral protease activity

2.2.2 酸性蛋白酶的響應(yīng)面結(jié)果分析

成曲酸性蛋白酶酶活響應(yīng)面模型的方差分析見表3，其中，F(xiàn)值為17.15，“Prob＞F”＝0.0006，說明該模型高度顯著，失擬項的“Prob＞F”為0.2042，失擬項不顯著，說明該模型可以用于分析酸性蛋白酶酶活的變化，模型中一次項A和B、交互作用項AB及二次項A2，B2，C2為顯著影響因子。

表3 酸性蛋白酶酶活的響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model of acid protease activity

續(xù) 表

酸性蛋白酶酶活的響應(yīng)面圖見圖5，酸性蛋白酶酶活的二次回歸方程為：酸性蛋白酶酶活＝942.32＋66.22×?xí)r間＋51.91×溫度＋42.68×比例－97.78×?xí)r間×溫度－38.01×?xí)r間×比例＋33.59×溫度×比例－217.96×?xí)r間2－119.35×溫度2－149.13×比例2。

圖5 成曲酸性蛋白酶酶活的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of acid protease activity

2.3 制曲條件的驗證

利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以蛋白酶的酶活性為指標，分析得到最佳的制曲條件為：制曲溫度32.12℃、制曲時間30.72 h、米曲霉與黑曲霉的接種比例2.39∶1，成曲中性、酸性蛋白酶的理論酶活值分別為1634.58，940.96 U／g?？紤]實驗的可操作性，將上述的最佳制曲條件調(diào)整為制曲溫度32℃，制曲時間30 h，米曲霉和黑曲霉接種比2.5∶1，然后進行驗證實驗制得成曲，并測定其中中性和酸性蛋白酶酶活分別為1572，1023 U／g，相對誤差控制在10%以內(nèi)，說明理論值與實際情況擬合較好。

2.4 復(fù)合酶添加對發(fā)酵的協(xié)同作用

依照調(diào)整后的制曲條件制得成曲，按重量均分為兩份，其中一份成曲中添加風(fēng)味蛋白酶（0.1%）、纖維素酶（0.15%）和淀粉酶（0.1%）組成的復(fù)合酶，與另一份成曲同條件下進行后續(xù)發(fā)酵，并分別在發(fā)酵6，12，18，24，30天的時間點測定發(fā)酵液中主要成分和水解度的變化。

圖6 發(fā)酵過程中總氮、氨態(tài)氮、還原糖和水解度的變化Fig.6 Changes of content of total nitrogen，amino nitrogen，reducing sugar and degree of hydrolysis

由圖6中A可知，2個發(fā)酵組隨著發(fā)酵時間的延長，總氮含量逐步升高，并在發(fā)酵后期出現(xiàn)了不同程度的下降。這是由于在發(fā)酵初期，各種酶類的分解作用，發(fā)酵液中含氮量不斷提高，隨著發(fā)酵的進行，微生物的生長消耗部分氮源，使含氮量出現(xiàn)了下降。由圖6中A也可知，復(fù)合酶發(fā)酵組的含氮量在整個發(fā)酵過程中都比對照組的含氮量要高，從而說明添加復(fù)合酶能夠促進原料的分解，這也將有利于后期發(fā)酵中風(fēng)味物質(zhì)的形成。

氨基酸態(tài)氮是以氨基酸形式存在的含氮化合物，其中的多種呈味氨基酸是發(fā)酵產(chǎn)物復(fù)雜風(fēng)味不可或缺的重要成分。由圖6中C可知，在發(fā)酵過程中，添加復(fù)合酶發(fā)酵組的氨基酸含量均高于對照組，說明復(fù)合酶對于原料中蛋白的水解起到了促進作用。與總氮含量在發(fā)酵過程中的變化相似的是，氨基酸含量在發(fā)酵的中后期也出現(xiàn)了一定程度的波動，這主要是由于微生物的生長利用，以及與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，消耗了發(fā)酵產(chǎn)物中的部分氨基酸。

添加的復(fù)合酶促進了氨基酸及總氮含量的提高，由圖6中B可知，添加復(fù)合酶提高了原料中蛋白質(zhì)的水解度。在整個發(fā)酵過程中，淀粉類原料被分解成還原糖，還原糖對于發(fā)酵產(chǎn)物的呈色呈味都具有重要的作用。由圖6中D可知，在添加復(fù)合酶發(fā)酵組中，還原糖的含量均高于對照組，這主要是由于添加的纖維素酶促進了發(fā)酵原料中膳食纖維的分解，從而得到了更多的單糖類物質(zhì)。

2.5 感官評價

添加復(fù)合酶發(fā)酵和對照組的發(fā)酵產(chǎn)物呈味效果良好，肉味濃郁且具有紫蘇特殊的香氣。二者的感官品評結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵產(chǎn)物感官評價結(jié)果Fig.7 Sensory evaluation results of fermented products

在醬香味和肉味評價方面，二者沒有太大差別。復(fù)合酶組中的甜味和鮮味略高于對照組，這與還原糖及氨基酸的含量差異有一定關(guān)系。由于蛋白質(zhì)的水解，使得原來包裹在蛋白分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，水解產(chǎn)物中的苦味隨之增加，本研究復(fù)合酶組中的苦味較弱，這可能是由于添加的風(fēng)味蛋白酶中具有的大量端肽酶，可以從多肽鏈的末端切除疏水性的氨基酸殘基，從而減輕發(fā)酵產(chǎn)物的苦味［19］。

3 結(jié)論

以紫蘇粕作為主要發(fā)酵原料，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對制曲工藝進行優(yōu)化，并得到最佳的制曲工藝；在此基礎(chǔ)上添加復(fù)合酶協(xié)同發(fā)酵，與對照組比較發(fā)現(xiàn)：復(fù)合酶發(fā)酵組中的總氮、氨態(tài)氮和還原糖含量及水解度均不同程度地高于對照組；由于外源性復(fù)合酶能夠促進大分子蛋白及多肽等物質(zhì)分解為寡肽和氨基酸，從而改善了發(fā)酵調(diào)味料的呈味特性。本研究將“味料同源”的理念結(jié)合傳統(tǒng)的發(fā)酵方法制造天然肉味調(diào)味料，促進低值蛋白資源的高效利用，將生產(chǎn)的發(fā)酵調(diào)味料用于食品工業(yè)生產(chǎn)，也符合現(xiàn)代食品“營養(yǎng)、安全、回歸自然”的發(fā)展需要。

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Study on the Preparation of Natural Seasoning by Complex Enzyme Synergistic Fermentation of Perilla Meal

HAO Lei，HAO Xue-cai，DENG Li，ZU Qing-yong，LIU Yuan，ZHOU Tao
（Tianjin Key Laboratory of Flavor Food Ingredients Enterprise，Tianjin Chunfa Biotechnology Group Co.，Ltd.，Tianjin 300300，China）

The koji prepared byA.oryzaeandA.nigeris optimized with perilla meal as fermentation material.The single factor experiment is used to set up the regression equation of prediction model about influence factors using Box-Benhnken response surface analysis，and the activities of acid protease and neutral protease are as response values.The results show that the optimum conditions of koji making are as follows：culture temperature is 32℃，culture time is 30 h，and ratio ofA.oryzaeandA.nigeris 2.5∶1.Under the above conditions，the activities of neutral protease and acid protease are 1572 U／g and 1023 U／g respectively，which are equal to the predictable values.The content of total nitrogen，amino acid nitrogen，reducing sugar and degree of hydrolysis in synergistic fermentation group are higher than those of control group，and the results of sensory evaluation show that synergistic fermentation group possesses better taste.

Aspergillus oryzae；Aspergillus niger；koji making；synergistic fermentation；flavor materials

TS264.2

A

10.3969／j.issn.1000-9973.2017.10.026

1000-9973（2017）10-0119-07

2017－04－10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102105）

郝磊（1981－），男，山東青州人，博士，研究方向：微生物發(fā)酵與食品添加劑。