超臨界CO2萃取-氣相色譜法測(cè)定膨化食品中反式脂肪酸

周永生， 顧 浩

(常州大學(xué)石油化工學(xué)院,江蘇常州 213164)

反式脂肪酸(TFAs)是一類含有一個(gè)或多個(gè)碳碳雙鍵構(gòu)型的不飽和脂肪酸。有報(bào)道指出，過量攝入TFAs易增加患腦血管疾病、冠心病、糖尿病和乳腺癌等的風(fēng)險(xiǎn)[1]。膨化食品具有食用方便、易于消化、香酥可口、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特點(diǎn)，深受消費(fèi)者的青睞，尤其是少年兒童更喜歡食用[2]。膨化加工的加熱、加壓過程在使原料膨脹的同時(shí)也易導(dǎo)致脂肪酸變性生成TFAs。在檢測(cè)固體食品中TFAs之前，須對(duì)樣品進(jìn)行TFAs提取和甲酯化衍生。傳統(tǒng)的食品中TFAs的提取方法有微波輔助溶劑萃取[3 - 5]、超聲輔助溶劑萃取[6]、索氏提取[7]和固相萃取[8]等，這些方法均使用有毒有害的有機(jī)溶劑。微波萃取和超聲萃取均易導(dǎo)致樣品局部過熱，索氏提取須對(duì)溶有提取物的溶劑進(jìn)行加熱蒸餾，而脂肪酸受熱后易發(fā)生氧化變質(zhì)[9]或空間構(gòu)型的轉(zhuǎn)變[10]。而超臨界CO2(SC-CO2)萃取具有簡(jiǎn)單、方便、萃取效率高的優(yōu)點(diǎn)，且CO2無毒無味、價(jià)廉易得不易燃[11]。此外，超臨界CO2萃取法較低的操作溫度能有效防止脂肪酸變性[12 - 13]，因此常被用于提取植物種子中的油脂[14 - 16]。由于超臨界CO2流體在膨化食品內(nèi)的傳質(zhì)阻力遠(yuǎn)小于植物種子，因此超臨界CO2萃取法更適用于對(duì)膨化食品中脂肪酸的提取。

本研究采用超臨界CO2萃取法提取膨化食品中的脂肪酸，對(duì)提取物采用KOH-甲醇法衍生化處理，再用經(jīng)典的氣相色譜法[17]檢測(cè)其中反式脂肪酸含量。該方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22110-2008)《食品中反式脂肪酸的測(cè)定 氣相色譜法》中采用的溶劑提取法相比，超臨界CO2萃取法方便快捷、提取率高且對(duì)人體和環(huán)境無任何危害。本方法準(zhǔn)確可靠、回收率高，可為相關(guān)部門制定或修改相應(yīng)的規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)等提供依據(jù)和參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

GC-2010 Plus型氣相色譜儀(日本，島津公司)；SFT-100型超臨界萃取儀(美國(guó)，SFT公司)；AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

反-10-十八烯酸、反-10-十八烯酸甲酯、十三烷酸甲酯等標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥99%，購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；甲醇和正己烷均為色譜純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KOH、NaCl和無水Na2SO4均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

薯片、面包、餅干和爆米花等均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.0306 g十三烷酸甲酯于50 mL容量瓶中，用正己烷定容后搖勻作為內(nèi)標(biāo)液。稱取0.0399 g反-10-十八烯酸甲酯于250 mL容量瓶中，并用正己烷定容后搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取1、5、10、15、25 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別加入5只50 mL容量瓶中，再各移取2 mL內(nèi)標(biāo)液加入容量瓶中，用正己烷定容后搖勻，得到濃度依次為0.7980、3.9900、7.9800、11.9700和19.9500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 脂肪酸提取及衍生化

稱取約6 g樣品，粉碎后裝入柱狀濾紙袋，封口后放入萃取釜；打開排氣閥和液態(tài)CO2鋼瓶總閥，將萃取釜中的空氣置換后關(guān)閉排氣閥；分別接通萃取釜和CO2泵電源，設(shè)定萃取溫度、萃取壓力和液態(tài)CO2流量，待釜溫及萃取壓力達(dá)到設(shè)定值后緩慢打開排氣閥，待氣體流量穩(wěn)定后開始動(dòng)態(tài)萃取。產(chǎn)物收集在干凈的小瓶中，萃取一定時(shí)間后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，精密稱量提取物。

稱取約0.2 g脂肪酸于5 mL 具塞試管中，加入2 mL正己烷，搖勻后再加入2 mL一定濃度的 KOH-甲醇溶液，將試管放入超聲波清洗器中，設(shè)定水溫和超聲時(shí)間。當(dāng)溫度達(dá)到設(shè)定值后開始超聲，達(dá)到預(yù)定時(shí)間后自動(dòng)停止，取出試管后靜置，待溶液澄清后加入2 mL飽和NaCl溶液，將上層清液移入50 mL容量瓶中，加入2 mL內(nèi)標(biāo)液，用正己烷定容后搖勻，待測(cè)。

1.4 色譜分析條件

DB-225ms毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；柱溫程序：初始溫度100 ℃，保留1 min后以3 ℃/min升至240 ℃，保留30 min；火焰離子化檢測(cè)器(FID)；檢測(cè)器溫度：250 ℃；氫氣流量：100 mL/min；空氣流量：300 mL/min；載氣：高純氮?dú)?，流速?0 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比：50；進(jìn)樣量：0.6 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件優(yōu)化

以萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、萃取時(shí)間(C)、CO2流量(D)四個(gè)因素，以脂肪酸提取率(提取物與樣品的質(zhì)量比)為考察指標(biāo)來設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。因素水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可見，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序依次為：A >B >C >D，最佳組合條件為A2B2C3D2，即萃取壓力30 MPa、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間2.0 h、CO2流量15 mL/min。在最佳組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，脂肪酸提取率為18.52%。采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 22110-2008)《食品中反式脂肪酸的測(cè)定 氣相色譜法》中規(guī)定的提取方法，脂肪酸提取率為18.01%。很顯然，超臨界CO2提取效果優(yōu)于溶劑提取法。

表1 SC-CO2萃取因素與水平

表2 SC-CO2萃取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

(續(xù)表2)

No.ABCDExtraction rate(%)3133315.954212317.395223117.926231216.967313217.218321316.819332116.06k115.8816.6516.3816.45k217.4217.0216.5916.83k311.6916.3217.0316.72R5.730.700.440.38

2.2 甲酯化條件優(yōu)化

以反-10-十八碳烯酸(C18∶1-10t)為原料，采用KOH-甲醇法對(duì)其進(jìn)行甲酯化衍生，以C18∶1-10t甲酯的轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)。以KOH-甲醇濃度(A)、反應(yīng)時(shí)間(B)、反應(yīng)溫度(C)三個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平見表3，試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可見，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序依次為：A > C > B，最佳組合條件為A1B1C1，即KOH-甲醇濃度1 mol/L、超聲時(shí)間1 min、甲酯化溫度20 ℃。在該條件下C18∶1-10t甲酯的轉(zhuǎn)化率為99.2%。

表3 甲酯化因素與水平

表4 甲酯化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖1 提取物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of extract by methyl esterification1:Lauric acid methyl ester.2:Glycyl alcohol.3:Tetradecanoic acid methyl ester.4:Pentadecanoic acid methyl ester.5:Hexadecanoic acid methyl ester.6:Palmitoleic acid methyl ester.7:trans10-Octadecenoic acid methyl ester.8:Octadecanoic acid methyl ester.9:cis9-Octadecenoic acid methyl ester.10:cis9,cis12-Octadecadienoic acid methyl ester.11:cis9,cis12,cis15-Octadecatrienoic acid methyl ester.12:Eicosanoic acid methyl ester.13:2-hexyl-Cyclopropaneoctanoic acid methyl ester.

2.3 提取物組成分析

采用氣相色譜法對(duì)薯片提取物甲酯化產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，確定其中的反式脂肪酸類型。由圖1可見，13種提取物中只有一種反式脂肪酸，為C18∶1-10t，這與文獻(xiàn)報(bào)道[18]的結(jié)果一致。

2.4 線性關(guān)系和定量限

在1.4節(jié)GC-FID檢測(cè)條件下，對(duì)1.2節(jié)配制的5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算C18∶1-10t與內(nèi)標(biāo)物峰面積的平均值。以C18∶1-10t與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比(A反/A內(nèi))對(duì)C18∶1-10t與內(nèi)標(biāo)物的濃度比(c反/c內(nèi))作圖并線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖2。線性方程為：y=0.0179+0.7211x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997。稱取0.1016 g C18∶1-10t甲酯加入100 mL容量瓶，正己烷定容后上機(jī)檢測(cè)，所得GC峰信噪比(S/N)遠(yuǎn)高于10。對(duì)該溶液逐級(jí)稀釋，當(dāng)濃度降至1.016×10-3mg/L時(shí)，C18∶1-10t甲酯GC峰的S/N約為10，故本方法的定量限約為0.001 mg/L。

2.5 加標(biāo)回收率

向三個(gè)25 mL容量瓶中分別加入5 mL濃度為0.5030 mg/L的C18∶1-10t溶液，再分別加入5 mL濃度分別為0.1016 mg/L、1.1971 mg/L和10.0378 mg/L的C18∶1-10t溶液，再向每個(gè)容量瓶中各加入2 mL內(nèi)標(biāo)液，用正己烷定容后上機(jī)測(cè)定。三個(gè)不同加標(biāo)濃度樣品的測(cè)定濃度依次為0.1195 mg/L、0.3391 mg/L、2.2410 mg/L。根據(jù)測(cè)定濃度計(jì)算C18∶1-10t總量，減去加標(biāo)前容量瓶中原有的C18∶1-10t量，將差值除以加入的C18∶1-10t量，即得到回收率依次為95.8%、99.6%和106.6%。

2.6 日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

在1.4節(jié)GC-FID條件下，對(duì)配制好的待測(cè)樣品在一天內(nèi)連續(xù)檢測(cè)7次，根據(jù)線性方程計(jì)算樣品中C18∶1-10t含量，計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。在相同的儀器條件下，每天對(duì)待測(cè)樣品檢測(cè)一次，連續(xù)7 d，根據(jù)線性方程計(jì)算樣品中C18∶1-10t含量，計(jì)算日間RSD。結(jié)果顯示采用該方法檢測(cè)C18∶1-10t甲酯時(shí)，日內(nèi)RSD為7.5%，日間RSD為8.5%，精密度良好。

2.7 樣品測(cè)定

采用建立的方法對(duì)購(gòu)自超市的薯片、面包、餅干和爆米花等膨化食品進(jìn)行檢測(cè)。按上述選定的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行反式脂肪酸提取和甲酯化。檢測(cè)結(jié)果顯示，薯片中C18∶1-10t含量為64g/g，面包、餅干和爆米花中均未檢出反式脂肪酸。

3 結(jié)論

本文建立了超臨界CO2萃取-氣相色譜法測(cè)定膨化食品中反式脂肪酸的分析方法，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)反式脂肪酸提取和甲酯化條件進(jìn)行了優(yōu)化。在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45 ℃、萃取時(shí)間2.0 h、CO2流量15 mL/min條件下進(jìn)行萃取，脂肪酸提取率為18.52%。該方法快速、準(zhǔn)確、提取率高，且對(duì)人體和環(huán)境無任何危害，具有較好的實(shí)用價(jià)值。