α1-酸性糖蛋白與奶牛隱性乳房炎的相關性分析

蔣 磊

（遼寧省畜牧業(yè)經濟管理站，沈陽 110032）

α1-酸性糖蛋白與奶牛隱性乳房炎的相關性分析

蔣 磊

（遼寧省畜牧業(yè)經濟管理站，沈陽 110032）

為了分析奶牛隱性乳房炎的不同發(fā)病階段與乳清中α1-酸性糖蛋白含量變化之間的關系，本試驗選取10頭健康奶牛和30頭不同發(fā)病程度（輕、中、重）隱性乳房炎患牛作為試驗動物，采用α1-酸性糖蛋白ELISA檢測試劑盒測定各組乳清樣品中α1-酸性糖蛋白的含量，對α1-酸性糖蛋白與奶牛隱性乳房炎的相關性進行分析。結果顯示，隱性乳房炎組奶牛乳清中α1-酸性糖蛋白的含量顯著或極顯著高于健康組奶牛（P＜0．01或P＜0．05），且隨著奶牛隱性乳房炎病情的加重及乳中體細胞數的增加，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈現出遞增趨勢。研究結果提示，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量變化與奶牛隱性乳房炎的發(fā)病程度具有一定的相關性，乳腺炎癥引發(fā)的乳腺損傷及乳中體細胞數增加與乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈正相關。

奶牛；隱性乳房炎；乳清；α1-酸性糖蛋白

我國約70%的奶牛乳房炎為隱性乳房炎，主要是由物理、化學或微生物感染等多種病因引起的乳房炎癥，雖然患牛的乳腺組織發(fā)生了病理學變化，乳汁理化性質也發(fā)生了改變，但用手觸診乳腺或肉眼檢查乳汁時則難以發(fā)現異常[1]。隱性乳房炎是奶牛最多發(fā)、最常見、造成奶牛業(yè)經濟損失最為嚴重的頑固性疾病之一，不但影響奶牛的產奶量及奶品質，而且還增加乳汁攜帶病原微生物的危險性，危害人類健康[2]。隨著我國奶牛業(yè)及乳品工業(yè)的進一步發(fā)展，奶牛隱性乳房炎的診斷與治療也得到了人們的高度重視。

α1-酸性糖蛋白（α1-Acid glycoprotein，α1-AGP）又稱類黏蛋白，主要由肝臟合成。α1-AGP的肽鏈結構與結合珠蛋白α鏈結構類似，是目前研究最廣泛的血清急性期蛋白之一[3]。α1-AGP的表達受到多種細胞因子、激素等的調控，在各種炎癥、組織損傷、腫瘤等一系列疾病發(fā)生時，其漿液中含量升高，尤其在微生物感染引起的炎癥中α1-AGP表達量的變化更為明顯,常被作為炎癥發(fā)生時的判斷指標[4]。Bian等[5]在奶牛隱性乳房炎乳清蛋白質組學分析中發(fā)現隱性乳房炎發(fā)生時乳清中α1-酸性糖蛋白的含量顯著升高，此研究為尋找隱性乳房炎新的分子診斷標志物奠定了理論基礎。本試驗擬研究乳清中α1-AGP的含量與奶牛隱性乳房炎不同發(fā)病階段之間的關系，旨在為隱性乳房炎快速診斷試劑盒的研發(fā)提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1．1 試驗動物

在遼寧沈陽某奶牛場選擇正常泌乳且無臨床型乳房炎癥狀的奶牛，采用乳汁體細胞計數（SCC）與加州乳房炎檢測法（CMT）進行健康奶牛和隱性乳房炎患牛的鑒定與篩選。SCC＜10萬個/mL且CMT結果為陰性的奶牛為健康對照組；50萬個/mL＜SCC＜100萬個/mL且CMT結果呈弱陽性的奶牛為輕度隱性乳房炎組；150萬個/mL＜SCC＜200萬個/mL且CMT結果呈陽性的奶牛為中度隱性乳房炎組；SCC＞300萬個/mL且CMT結果呈陽性的奶牛為重度隱性乳房炎組。最終根據胎次、年齡、泌乳期、產奶量等指標相近的原則，選擇健康奶牛10頭和不同發(fā)病階段的隱性乳房炎患牛30頭，其中輕度、中度、重度隱性乳房炎患牛各10頭。

1．2 主要儀器與試劑

Varioskan酶標儀（Thermo 公司，美國）；低溫高速臺式離心機（Eppendorf公司，德國）；Fossmatic 5000型體細胞計數儀（FOSS 公司，丹麥）；Bovineα1-AGP ELISA Kit（購自上海谷研生物科技有限公司）；加州乳房炎檢測法（CMT）試劑（購自福州佳宸生物科技有限公司）。

1．3 樣品采集及鑒定

在采集乳汁之前，先用酒精棉球擦拭牛乳頭進行消毒，棄掉頭3把乳汁，人工擠壓將乳汁擠入滅菌試管內，每份乳樣50mL，冰浴保存后立即帶回實驗室。

采用體細胞計數儀進行乳汁體細胞計數，之后進行CMT檢測：測試盤中倒入2mL的乳樣，加入2mL的CMT試劑，混勻后輕輕作同心圓攪拌約15s進行觀察。若混合液均勻且流動性好、無絮狀物，則為陰性；混合液有微量顆粒但不久后消失，為可疑；有少許絮狀物或沉淀產生但無凝膠，判斷為弱陽性；凝結物呈膠狀，搖動時呈中間集聚，停止搖動時沉淀呈凹狀附著于盤底，判斷為陽性；全部呈凝膠狀，回轉時向心集中，停止攪動則回復原狀并附著于皿底，判斷為強陽性。

1．4 乳清的制備

每份乳樣取20mL，4℃ 4 000r/min離心25min，除去上層乳脂，再4℃ 12 000r/min離心15min，棄掉沉淀取乳清部分，然后將乳清樣品分裝成5mL/EP管，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5 乳清中α1-酸性糖蛋白含量的測定

按照Bovineα1-AGP ELISA Kit廠家操作說明書測定乳清樣品中α1-AGP含量，加終止液后15min內進行測定，以空白孔調零，用酶標儀在450nm波長下測定各孔的吸光度（OD值），繪制標準曲線后計算樣品中α1-AGP的含量。

1．6 數據統(tǒng)計分析

試驗數據采用SPSS 13.0分析系統(tǒng)進行單因素方差分析，結果用“均值±標準誤”表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2．1 α1-酸性糖蛋白標準曲線的繪制

α1-AGP標準品按濃度梯度進行稀釋，讀取各個濃度梯度的OD450nm值，以空白對照孔和標準孔中的蛋白質濃度（μg/mL）作為橫坐標，OD450nm作為縱坐標繪制標準曲線（圖1）。由圖1可知，擬合直線回歸方程為：Y=0.012X+0.004（R2=0.9985），濃度與吸光值擬合度較優(yōu)，表明該方法檢測α1-AGP的含量比較可信。

圖1 α1-酸性糖蛋白標準曲線

2．2 乳清樣品中α1-酸性糖蛋白的含量

由表1和圖2可知，與健康對照組奶牛乳清中α1-AGP含量比較，輕、中、重度隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP 含量顯著升高（P＜0.05），其中中度與重度隱性乳房炎組奶牛乳清中α1-AGP 含量升高趨勢變化尤為明顯，極顯著高于輕度乳房炎組（P＜0.01）與健康對照組（P＜0.01）。試驗結果表明，患不同程度的隱性乳房炎奶牛乳清中α1-AGP含量有著明顯的差異，研究提示奶牛乳汁體細胞數增加及乳腺受損程度與乳清中α1-AGP含量呈正相關。

表1 不同程度隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP含量比較

圖1 α1-酸性糖蛋白在隱性乳房炎患牛和健康奶牛乳清中含量的比較

3 討論

當動物機體受到來自體內外的刺激、損傷或微生物感染引發(fā)炎癥時，就會激發(fā)先天的免疫系統(tǒng)啟動急性期反應（APR），進而導致血清急性期蛋白（APP）含量迅速升高到健康狀態(tài)的數倍以上，在臨床診斷中，APP常被認為是判斷疾病狀態(tài)最為重要的生物標記物[6]。APP主要由肝臟合成，也有研究表明，一些APP也可由乳腺上皮細胞在肝外進行合成[7]，在奶牛乳腺發(fā)生炎癥時，血清中的APP可通過血乳屏障進入乳清中，在乳腺對抗感染、修復受傷組織及穩(wěn)定內環(huán)境的生物過程中有著重要的作用[8]。隱性乳房炎發(fā)生時乳中APP含量的改變可提供乳區(qū)炎癥階段的特異信息，因此奶牛乳清中APP的含量可作為監(jiān)測奶牛乳腺健康或疾病狀態(tài)的重要指標。

α1-AGP作為急性期蛋白成員之一，在各種炎癥或損傷等發(fā)生時，其在漿液中的表達逐漸升高，在機體殺死病原微生物對抗感染的過程中發(fā)揮重要作用。Jain等[9]發(fā)現Ⅱ型糖尿病伴有腎病綜合征的患者血清中α1-AGP水平顯著高于正常人，研究表明血清中α1-AGP含量可作為Ⅱ型糖尿病伴有腎病綜合征的準確預測標志物，也有報道稱血清α1-AGP濃度升高的Ⅱ型糖尿病患者并發(fā)心血管病死亡率的幾率大大增加[10]。另外，一些研究也表明，在炎癥、外傷、手術、類風濕關節(jié)炎、惡性腫瘤尤其在癌轉移時，α1-AGP濃度升高更為明顯[11,12]，在臨床醫(yī)學上α1-AGP常被認為是漿液中一種最重要的非特異性藥靶。

本試驗通過研究乳清中α1-AGP含量和乳腺感染之間的關系，發(fā)現患不同程度隱性乳房炎時，奶牛乳清中α1-AGP的含量也有明顯的不同，隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP的含量顯著高于健康對照組，并且隨著隱性乳房炎病情的加重，乳清中α1-AGP含量也呈現逐漸上升的趨勢；原因可能是由于隱性乳房炎發(fā)生時白介素-1刺激吞噬細胞釋放出脂多聚糖，進而促進了α1-AGP的合成，使其表達水平升高。α1-AGP作為一種最穩(wěn)定的早期呈陽性的急性時相反應物，推測其在奶牛隱性乳房炎疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。本研究結果表明，乳清中α1-AGP含量變化與隱性乳房炎的發(fā)病程度具有一定的相關性，不同發(fā)病階段隱性乳房炎患牛乳清中α1-AGP含量變化特點為隱性乳房炎診斷方法的建立提供了新參考，同時也為隱性乳房炎快速診斷試劑盒的研發(fā)也提供了更為廣闊的空間和前景。

[1]儲明星,石萬海,鄺霞,等．淺談奶牛乳房炎[J]．中國奶牛, 2001,23：39-40．

[2]郭小雅, 束婧婷, 楊章平,等．奶牛隱性乳房炎發(fā)生規(guī)律的調查分析[J]．中國獸醫(yī)雜志, 2005, 3：23-24．

[3]Kushner I．The phenomenon of the acute phase response[J]．Ann NY AcadSci, 1982, 389(9)：39-48．

[4]Dilda F, Pisani LF, Rahman M．M, et al． Distribution of acute phase proteins in the bovine forestomachs and abomasum[J]．Vet J,2012, 192：101-105．

[5]Yanjie Bian, Ying Lv, Qingzhang Li． Identification of diagnostic protein markers of subclinical mastitis in bovine whey using comparative proteomics[J]．Bull Vet Inst Pulawy, 2014, 58：385-392．

[6]Eckersall PD．The time is right for acute phase protein assays[J]．Veterinary Journal, 2004, 168(1)：3-5．

[7]Hiss S,Mielenz M, Bruckmaier RM，et al． Haptoglobin concentration in blood and milk after endotoxin challenge and quantification of mammary Hp mRNA expression[J]．J Dairy Sci,2004, 87(11)：3778-3784．

[8]Eckersall PD,Young FJ,Mccomb C, et al．Acute phase protein in serum and milk from dairy cows with clinical mastitis[J]．Vet Record, 2001, 148(2)：35-41．

[9]Jain S, Rajput A, Kumar Y, et al．Proteomic analysis of urinary protein markers for accurate prediction of diabetic kidney disorder[J]．J Assoc Physicians India, 2005, 53(2)：513-520．

[10]Christiansen MS, Hommel E, Maqid E, et al．Orosomucoid in urine predicts cardiovascular and over-all mortality in patients with Type II dia-betes[J]．Diabetoloqia, 2002,45(1)：115-120．

[11]Heliovaara MK, Teppo AM, Karonen SL, et al．Improved glycaemia in type diabetes results in decreased levels of soluble adhesion molecules with no change in serum adiponectin or most acute phase proteins[J]．Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2006,114(6)：295-300．

[12]Crisman M V, Scarratt W K, Zimmerman K L．Blood prtein and inflammation in the horse[J]．Vet clin North Am Equine Pract,2008, 24(2)：285-297．

Abstract:In order to analyze the relationship between the changes of the content of alpha 1- acid glycoprotein,mastitis and whey in different stages, we selected 10 healthy cows and 30 different disease severity (light, medium and heavy) in subclinical mastitis milk samples as test animal, the content of alpha 1- acid glycoprotein were determined in whey samples using alpha 1- acid glycoprotein ELISA kit. The experimental results showed that the content of a 1- acid glycoprotein in cow mastitis whey group was significantly higher than that in healthy dairy group (P＜0.01 or P＜0.05), and with the increase of mastitis disease and milk somatic cell count, the content of a 1-acid glycoprotein in whey showed an increasing trend. Research results suggest that the extent of the disease has certain correlation with the content changes of 1- alpha acid glycoprotein, the content was positively related to alpha 1- acid glycoprotein and whey somatic breast lesions caused by mastitis and milk SCC.

Key word:Dairy cattle; Subclinical mastitis; Whey; Alpha 1- acid glycoprotein

《中國奶?！氛鞲逋ㄖ?/p>

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Correlation Analysis of Alpha 1- acid Glycoprotein with Cows Subclinical Mastitis

JIANG Lei
(Animal Husbandry Economic Management Station of Liaoning Province, Shenyang 110032)

S858.23

A

1004-4264（2017）09-0046-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.09.013

2016-12-14

國家級星火計劃（2015GA650008）。

蔣磊（1985-），男，黑龍江海林人，獸醫(yī)師，本科，主要從事奶牛生產性能測定及臨床獸醫(yī)學等研究工作。