荸薺皮多糖對自由基的清除作用

汪建紅，吳維，韓平東

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641112；2.四川省高等學(xué)校“果類廢棄物資源化”重點實驗室，四川內(nèi)江641112）

荸薺皮多糖對自由基的清除作用

汪建紅1，2，吳維1，韓平東1

（1.內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川內(nèi)江641112；2.四川省高等學(xué)?！肮悘U棄物資源化”重點實驗室，四川內(nèi)江641112）

利用荸薺皮多糖為原料，分別對其對羥基自由基和超氧自由基的清除能力進(jìn)行測定，并利用單因素試驗和正交試驗考察多糖質(zhì)量濃度、溫度和時間等因素對清除率的影響。結(jié)果表明，荸薺皮多糖清除羥基自由基的最佳條件為多糖質(zhì)量濃度1.2 mg/mL、溫度30℃、時間70 min，在此條件下對羥基自由基的清除率可達(dá)90.71%；荸薺皮多糖清除超氧自由基的最佳條件為多糖質(zhì)量濃度1.2 mg/mL、溫度25℃、時間10 min，在此條件下對超氧自由基的清除率可達(dá)56.64%。因此荸薺皮多糖對羥基自由基清除能力較強，對超氧自由基具有一定的清除能力。該研究為荸薺皮多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和一定的參考價值。

荸薺皮多糖；羥基自由基；超氧自由基；清除率

Abstract：With polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel as raw materials，clearing ability of the polysaccharide for hydroxyl radicals and superoxide radicals，was determined，and influence of mass concentration of polysaccharide，temperature，and time，on clearing rate，were studied by single-factor experiments and orthogonal tests.The result showed that，the optimal conditions in which hydroxyl radicals were cleared by polysaccha ride in Eleocharis tuberosa peel，were mass concentration of polysaccharide of 1.2 mg/mL，temperature of 30 ℃，and time of 70 min，and under the optimal conditions，the clearing rate for hydroxyl radical could reach 90.71%.The optimal conditions in which superoxide radicals were cleared by polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel，were mass concentration of polysaccharide of 1.2 mg/mL，temperature of 25℃，and time of 10 min，and under the optimal conditions，the clearing rate for superoxide radicals could reach 56.64%.So，polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel had stronger clearing ability to hydroxyl radical，and certain clearing ability to superoxide radical.Theoretical basis and reference value were provided for further exploitation of polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel by the reaseach.

Key words：polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel；hydroxyl radical；superoxide radical；clearing rate

自由基是一類重要的氧化劑，人體的疲勞、衰老、疾病的產(chǎn)生，甚至腫瘤的產(chǎn)生都跟人體內(nèi)自由基的作用有莫大的關(guān)系[1-6]。荸薺皮中含有豐富的植物多糖，具有消炎、抗腫瘤等生物活性，尤其還可清除體內(nèi)大量的自由基，研究荸薺皮多糖對自由基的清除意義重大[7-10]。羥基自由基和超氧自由基是兩種較為常見的自由基，本文選擇提純后的荸薺皮多糖，考察其對羥基自由基和超氧自由基的清除效果，并利用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化反應(yīng)條件，為荸薺皮多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器及試劑

1.1 試劑及原料

荸薺：四川內(nèi)江農(nóng)貿(mào)市場；乙酸鈉、乙酸、乙醇、雙氧水、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、tris試劑、鄰苯三酚（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

T-6型紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；7230G型可見分光光度計：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；DF-101S型磁力加熱攪拌器：鄭州英峪予華儀器有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2204A型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；BSA822型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHA-B型恒溫水浴振蕩器：金壇市漢康電子有限公司；DFT-100型手提式萬能高速粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；SHB-B95型水循環(huán)多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CS101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：重慶試驗設(shè)備廠；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

2 試驗步驟

2.1 溶液的配制

分別配制0.75 mmol/L的鄰二氮菲乙醇溶液、0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、0.01%的雙氧水、0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液、0.2 mol/L的磷酸二氫鈉溶液、0.05 mol/L的pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液、25 mmol/L鄰苯三酚溶液、8 mol/L的鹽酸，并利用0.2 mol/L的磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉溶液配制pH=7.4的緩沖溶液。

方法[11-12]提取、提純荸薺皮多糖，并利用獲得的荸薺皮多糖配制 0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL的荸薺皮多糖溶液。

2.2 荸薺皮多糖對羥基自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)方法[13-16]，利用配制的0.75 mmol/L的鄰二氮菲乙醇溶液、0.75 mmol/L的硫酸亞鐵溶液、0.01%的雙氧水和pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液，在一定溫度、時間和一定荸薺皮多糖質(zhì)量濃度下分別測定A未損、A損和荸薺皮多糖的A樣，荸薺皮多糖對羥基自由基的清除率按照如下公式計算：

式中：I為對羥基自由基的清除率，%；A損為損傷管中的吸光度值；A未損為未損傷管中的吸光度值；A樣為荸薺皮多糖溶液管的吸光度值。

2.3 荸薺皮多糖對超氧自由基清除率測定

參考文獻(xiàn)方法[17]，利用配制的0.05 mol/L的pH值為8.2的Tris-HCl緩沖溶液、25 mmol/L鄰苯三酚溶液、8 mol/L的鹽酸，在一定溫度、時間和荸薺皮多糖質(zhì)量濃度下分別測定A0和荸薺皮多糖的A1，荸薺皮多糖對超氧自由基的清除率按照如下公式計算：

式中：I為對超氧自由基的清除率，%；A0為空白對照的吸光度值，A1為荸薺皮多糖的吸光度值。

2.4 單因素試驗和正交試驗

2.4.1 清除羥基自由基的單因素試驗和正交試驗

單因素試驗：在pH=7.4的條件下，選擇不同荸薺皮多糖質(zhì)量濃度（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL），不同溫度（25、35、45 ℃）和不同時間（40、50、60、70、80 min），重復(fù)2.2的操作。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以多糖質(zhì)量濃度、溫度、時間為因素，每個因素3個水平，設(shè)計L9（33）正交表，并按照此表安排試驗，重復(fù)2.2的操作。

2.4.2 清除超氧自由基的單因素試驗和正交試驗

單因素試驗：在pH=8.2的條件下，選擇不同荸薺皮多糖質(zhì)量濃度（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mg/mL），不同溫度（15、25、35、45、55 ℃）和不同時間（5、10、15、20 min），重復(fù)2.3的操作。

正交試驗：根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以多糖質(zhì)量濃度、溫度、時間為因素，每個因素3個水平，設(shè)計L9（33）正交表，并按照此表安排試驗，重復(fù)2.3的操作。

2.5 對比試驗

根據(jù)單因素試驗和正交試驗的結(jié)果，在相同條件下分別測定荸薺皮多糖、VC對羥基自由基和超氧自由基的清除率，重復(fù)2.2和2.3的操作。

3 結(jié)果與討論

3.1 荸薺皮多糖清除羥基自由基的條件優(yōu)化

3.1.1 荸薺皮多糖質(zhì)量濃度的影響

荸薺皮多糖質(zhì)量濃度對其對羥基自由基清除率的影響如圖1所示。

從圖1可看到荸薺皮多糖對羥基自由基的清除率隨荸薺皮多糖質(zhì)量濃度的增大而增大；當(dāng)達(dá)到0.8 mg/mL時，清除率達(dá)到一個較大的值；此后，隨質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，清除率沒有明顯變化。這是由于荸薺皮多糖質(zhì)量濃度越大，與其反應(yīng)的羥基自由基的量越大，則有越多的羥基自由基被清除，當(dāng)達(dá)到0.8 mg/mL時，該反應(yīng)已進(jìn)行得較為充分，繼續(xù)增加多糖質(zhì)量濃度不但不會帶來反應(yīng)程度的明顯變化，反而會造成荸薺皮多糖的浪費，因此綜合考慮，選擇最適宜的多糖質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL。

圖1 多糖質(zhì)量濃度對羥基自由基清除率的影響Fig.1 Influence of mass concentration of polysaccharide onclearing rate for hydroxyl radicals

3.1.2 溫度的影響

溫度對荸薺皮多糖對羥基自由基清除率的影響如圖2所示。

圖2 溫度對羥基自由基清除率的影響Fig.2 Influence of temperature on clearing rate for hydroxyl radicals

從圖2可看到，在25℃～45℃的范圍內(nèi)，隨溫度的上升，羥基自由基清除率先逐漸增加，后逐漸降低，當(dāng)溫度為35℃時達(dá)最大值。這是由于溫度越高，分子運動越活躍，多糖越容易和羥基自由基反應(yīng)，但溫度過高時荸薺皮多糖會被氧化變質(zhì)，硫酸亞鐵和鄰菲羅啉形成的有色絡(luò)合物也會被空氣中的氧氧化褪色，從對反應(yīng)過程的觀察也證實了這一點，在溫度超過45℃繼續(xù)升高時，反應(yīng)體系顏色出現(xiàn)了從無色到磚紅色，再到無色的變化。綜合考慮，選擇35℃作為反應(yīng)溫度。

3.1.3 時間的影響

時間對荸薺皮多糖對羥基自由基清除率的影響如圖3所示。

從圖3可看到，在40 min～80 min內(nèi)，隨著時間的延長，荸薺皮多糖對羥基自由基清除率先逐漸增加后逐漸降低。這是由于時間越長，荸薺皮多糖與羥基自由基的反應(yīng)越充分，但時間過長時部分顯色后的金屬絡(luò)合物也會被空氣中的氧氣氧化而顏色變淺。因此綜合考慮選擇最佳時間為60 min。

圖3 時間對羥基自由基清除率的影響Fig.3 Influence of time on clearing rate for hydroxyl radicals

3.1.4 正交試驗

以荸薺皮多糖質(zhì)量濃度、溫度和時間為因素的關(guān)于荸薺皮多糖對羥基自由基清除率的L9（33）正交試驗結(jié)果、極差分析及方差分析結(jié)果如表1和表2所示。

表1 L9（33）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1L9（33）orthogonal experimental design and results

表2 正交試驗結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis of the orthogonal experiment results

從表1可看到，荸薺皮多糖清除羥基自由基的最佳條件組合為A3B1C3，即荸薺皮多糖質(zhì)量濃度1.2 mg/mL，溫度30℃，時間70 min，恰好是正交試驗中試驗7的條件。各因素影響的先后順序為溫度＞荸薺皮多糖質(zhì)量濃度＞時間。

從表2的方差分析結(jié)果可看到，在所選擇的正交試驗的因素很水平范圍內(nèi)，因素A、B、C，即荸薺皮多糖質(zhì)量濃度、溫度和時間對羥基自由基清除效果的影響均未達(dá)到顯著的水平。而F值結(jié)果表明，方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。

為了驗證正交試驗結(jié)果作了3次平行試驗，羥基自由基的清除率分別為85.25%、95.08%、91.80%，平均值90.71%，高于正交試驗中除試驗7之外的組合下的結(jié)果，說明正交試驗結(jié)果的正確性。

3.2 荸薺皮多糖清除超氧自由基的條件優(yōu)化

3.2.1 荸薺皮多糖質(zhì)量濃度的影響

荸薺皮多糖質(zhì)量濃度對其對超氧自由基清除率的影響如圖4所示。

圖4 多糖質(zhì)量濃度對超過氧自由基清除率的影響Fig.4 Influence of mass concentration of polysaccharide on clearing rate for superoxide radicals

從圖4可看到隨多糖質(zhì)量濃度的增加，荸薺皮多糖對超氧自由基的清除率先逐漸增加，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.2 mg/mL后，清除率基本穩(wěn)定，沒有明顯變化。這是由于開始時多糖質(zhì)量濃度越大就有越多的多糖參與與超氧自由基的反應(yīng)，因此有更高的清除率，當(dāng)達(dá)到1.2 mg/mL后，荸薺皮多糖與超氧自由基的反應(yīng)基本完成。因此，綜合考慮對超氧自由基的清除率和節(jié)約資源，選擇最適宜的多糖質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL。

3.2.2 溫度的影響

溫度對荸薺皮多糖對超氧自由基清除率的影響如圖5所示。

從圖5可看到，在15℃～55℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，超氧自由基的清除率先逐漸增加后逐漸下降。這是由于溫度的升高可導(dǎo)致分子運動更活躍，可使荸薺皮多糖在規(guī)定時間內(nèi)與超氧自由基的反應(yīng)更充分，但溫度過高時會有部分荸薺皮多糖被空氣中的氧氣氧化變質(zhì)，失去清除超氧自由基的能力，因此綜合考慮選擇最佳溫度為25℃。

圖5 溫度對超氧自由基清除率的影響Fig.5 Influence of temperature on clearing rate for superoxide radicals

3.2.3 時間的影響

時間對荸薺皮多糖對超氧自由基清除率的影響如圖6所示。

圖6 時間對超氧自由基清除率的影響Fig.6 Influence of time on clearing rate for superoxide radicals

從圖6可看到，隨著時間的延長，超氧自由基清除率逐漸增加，當(dāng)達(dá)到10 min后，繼續(xù)延長時間沒帶來超氧自由基清除率的明顯變化。這是由于反應(yīng)剛開始時，反應(yīng)程度較低，當(dāng)達(dá)到10 min時，反應(yīng)基本完成，繼續(xù)延長時間不會帶來反應(yīng)程度的明顯變化。因此綜合考慮選擇最適宜的反應(yīng)時間為10 min。

3.2.4 正交試驗

以荸薺皮多糖質(zhì)量濃度、溫度和時間為因素的關(guān)于荸薺皮多糖對超氧自由基清除率的L9（33）正交試驗結(jié)果、極差分析及方差分析結(jié)果如表3和表4所示。

從表3可看到，荸薺皮多糖清除超氧自由基的最佳條件組合為A2B2C2，即荸薺皮多糖質(zhì)量濃度1.2 mg/mL，溫度25℃，時間10 min，非正交試驗中的條件組合。

從表4的方差分析結(jié)果可看到，在所選擇的正交試驗的因素和水平范圍內(nèi)，因素A、B、C，即荸薺多糖質(zhì)量濃度、溫度和時間對超氧自由基清除效果的影響均未達(dá)到顯著的水平。而F值結(jié)果表明，各因素影響的先后順序為溫度＞時間＞荸薺皮多糖質(zhì)量濃度。

為了驗證正交試驗結(jié)果作了5次平行試驗，超氧自由基的清除率分別為57.55%、57.56%56.02%、56.13%、55.93%，平均值56.64%，高于正交試驗中最佳條件組合下的結(jié)果，說明正交試驗結(jié)果的正確性。

表3 L9（33）正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3L9（33）orthogonal experimental design and results

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal experiment results

3.3 對比試驗

在質(zhì)量濃度1.2 mg/mL、溫度30℃、時間70 min的條件下，測定荸薺皮多糖和VC對羥基自由基的清除率，在質(zhì)量濃度1.2 mg/mL、溫度25℃、時間10 min的條件下，測定荸薺皮多糖和VC對超氧自由基的清除率，如表5所示。

表5 VC和荸薺皮多糖對羥基自由基和超氧自由基清除效果對比Table 5 Comparison of clearing effect VCand polysaccharide in Eleocharis tuberosa peel for hydroxyl radicals and superoxide radicals

從表5可看到VC對羥基自由基和超氧自由基均表現(xiàn)出強大的清除能力，荸薺皮多糖對羥基自由基有較強的清除能力，而對超氧自由基具有一定的清除能力。

4 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗可得出，荸薺皮多糖清除羥基自由基的最佳條件為多糖質(zhì)量濃度1.2mg/mL、溫度30℃、時間70 min，在此條件下對羥基自由基的清除率可達(dá)90.71%，表現(xiàn)出了較強的清除能力；荸薺皮多糖清除超氧自由基的最佳條件為多糖質(zhì)量濃度1.2 mg/mL、溫度25℃、時間10 min，在此條件下對超氧自由基的清除率可達(dá)56.64%，表現(xiàn)出了一定的清除能力。因此荸薺皮多糖確實是一種具有較強抗氧化性的物質(zhì)，此試驗為荸薺皮多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)和一定的參考價值。

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Clearing Effect of Polysacchairde in Eleocharis tuberosa Peel on Radicals

WANG Jian-hong1，2，WU Wei1，HAN Ping-dong1
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641112，Sichuan，China；2.Key Laboratory of Fruit Waste Treatment and Resource Recycling in University of Sichuan，Neijiang 641112，Sichuan，China）

2017-01-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.003

四川省教育廳重點項目（15ZA0291）

汪建紅（1981—），男（漢），高級試驗師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物的提取、純化及性質(zhì)等方面的研究。