一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶海洋細(xì)菌的篩選、鑒定及發(fā)酵優(yōu)化

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(1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院,江蘇連云港 222005)

一株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶海洋細(xì)菌的篩選、鑒定及發(fā)酵優(yōu)化

顧張慧1,劉姝2,胡晟源1,來(lái)蔣麗1,王淑軍2,焦豫良1,房耀維1,2,*

(1.淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院,江蘇連云港222005;2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院,江蘇連云港222005)

目的:從海洋樣品中篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶細(xì)菌,對(duì)菌株進(jìn)行鑒定和發(fā)酵條件優(yōu)化。方法:利用顯色平板從黃海海州灣燕尾港海域的海泥中篩選幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生細(xì)菌。利用形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株發(fā)酵條件。結(jié)果:篩選獲得幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌MCDA01,經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析將菌株鑒定為天目不動(dòng)桿菌(Acinetobacterschindleri)。菌株最佳生長(zhǎng)條件為30 ℃,pH8.0,NaCl 4%。最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為:發(fā)酵時(shí)間60 h,發(fā)酵溫度20 ℃,培養(yǎng)基起始pH7,裝液量20%,誘導(dǎo)劑幾丁質(zhì)濃度1%。在此條件下,產(chǎn)酶量達(dá)到201.37 U/mL,比優(yōu)化前提高了4.14倍。結(jié)論:幾丁質(zhì)脫乙酰酶產(chǎn)生菌MCDA01產(chǎn)酶量達(dá)到201.37 U/mL,有工業(yè)應(yīng)用潛力。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶,菌株篩選,鑒定,發(fā)酵優(yōu)化

Abstract:Objective:Screen chitin-deacetylase-producing strains from marine samples,identify the strain and optimize its fermentation conditions. Methods:Chitin-deacetylase-producing strains were screened by color culture medium from the marine mud of Yanwei Harbor. The strains were identified by morphological,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis. The single factor and orthogonal experimental design were used to optimize the fermentation conditions. Results:Strain MCDA01 producing chitin deacetylase was screened,and it was identified asAcinetobacterschindlerithrough morphological,biochemical characteristics,and 16S rDNA sequence analysis. The optimal culture conditions of strain MCDA01 was obtained as follows:30 ℃,pH8.0,and NaCl 4%. The optimal fermentation conditions was obtained as follows:the fermentation time was 60 h,the fermentation temperature was 20 ℃,the culture medium starts pH was 7,the liquid loading amount was 20%,and the inducer chitin concentration was 1%. Under this condition,production of enzyme was up to 201.37 U/mL,which was increased by 4.14 times. Conclusion:The maximum of enzyme production were optimized to 201.37 U/mL,and have industrial application potential.

Keywords:chitin deacetylase;strain screening;identifiction;fermentation optimization

幾丁質(zhì)又叫甲殼素、甲殼質(zhì),是僅次于纖維素居世界第二的天然有機(jī)化合物,大多存在于無(wú)脊椎動(dòng)物的外骨骼和表皮以及真菌、藻類的細(xì)胞壁中[1-3]。甲殼素是由N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的直鏈大分子物質(zhì),不溶于水、稀酸、稀堿、濃堿及一般有機(jī)溶劑,商業(yè)價(jià)值不大。但其脫去乙?；鶊F(tuán)后的產(chǎn)物殼聚糖(脫乙酰度超過(guò)55%的幾丁質(zhì))可以溶于稀鹽酸、硝酸等無(wú)機(jī)酸和大多數(shù)有機(jī)酸,并具有抑菌[4]、抗癌、降低膽固醇、降血壓等生物活性[5],被現(xiàn)代科學(xué)稱為繼糖、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等五大生命要素之后的第六大生命要素,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、化妝品等行業(yè),有很高的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景[6]。

目前,將幾丁質(zhì)轉(zhuǎn)化為殼聚糖主要有化學(xué)熱堿法和生物酶法[7-9]。化學(xué)法需要使用大量濃堿處理,具有反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),生產(chǎn)成本高、脫乙酰度不易被控制以及排放物會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染等缺點(diǎn)。而酶法制備殼聚糖有條件溫和、綠色環(huán)保、得到的產(chǎn)品品質(zhì)高、制備周期短等優(yōu)點(diǎn),越來(lái)越引起人們的關(guān)注。幾丁質(zhì)脫乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA,E.C. 3.5.1.41)是催化甲殼素脫乙酰基生成殼聚糖的酶。利用該酶催化制備的殼聚糖具有脫乙酰程度一致、脫乙酰度高等優(yōu)點(diǎn),更為關(guān)鍵的是生物酶法綠色環(huán)保,實(shí)現(xiàn)了殼聚糖的綠色生產(chǎn)。CDA的研究和規(guī)?；苽涫巧锓ㄖ苽錃ぞ厶堑那疤釛l件。目前已有很多人致力于微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究。1974年,Mucor rouxii CDA被日本研究者首次報(bào)道[10]。隨后,研究者已經(jīng)從真菌、細(xì)菌和昆蟲(chóng)分離獲得了CDA[11-14],其中大多數(shù)產(chǎn)CDA的菌株為真菌[15-16]。目前已報(bào)道的微生物CDA的最適溫度為50～60 ℃[17]。

本研究從海洋樣品中篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的海洋細(xì)菌菌株,通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,并優(yōu)化了其最適生長(zhǎng)條件和最適產(chǎn)酶條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海泥樣品 采集于中國(guó)黃海海州灣燕尾港海域,樣品采集后置于冰盒,并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn);幾丁質(zhì) 江蘇澳新生物工程有限公司;蛋白胨、酵母粉、對(duì)硝基-N-乙酰苯胺、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、(NH4)2SO4等實(shí)驗(yàn)試劑 均為分析純,上海博微生物科技有限公司;引物 由南京思普金生物公司合成。

himac.CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本HITACHI公司;T6新世紀(jì)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SPX-250B-2生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;DK-8D 電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;Nikon 90i全電動(dòng)顯微鏡 上海普赫光電科技有限公司。

1.2 主要培養(yǎng)基

1.2.1 篩選培養(yǎng)基 膠體幾丁質(zhì)0.2%,K2HPO40.07%,KH2PO40.03%,MgSO40.05%,對(duì)硝基-N-乙酰苯胺 0.02%,陳海水配制,pH7.0。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 酵母粉0.1%,蛋白胨0.5%,NaCl 1%,陳海水配制,pH7.0。

1.2.3 2216E培養(yǎng)基 蛋白胨0.5%,酵母粉 0.1%,FePO40.01%,瓊脂2%,陳海水配制,pH7.0。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨0.5%,葡萄糖0.2%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.15%,MgSO40.05%,粉末幾丁質(zhì)2%,陳海水配制,pH7.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的篩選 從黃海海州灣燕尾港海域取海泥樣品,用蒸餾水對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋。分別吸取10-4、10-5、10-6梯度的稀釋液50 μL涂布三個(gè)平板。將涂布完的平板置于25 ℃環(huán)境下培養(yǎng)5～7 d后觀察菌落生長(zhǎng)和透明圈情況。挑取生長(zhǎng)狀況良好且具有透明圈的菌落分別在2216E培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)。純化后的菌株轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)液中培養(yǎng),再以1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基,25 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)72 h后,將發(fā)酵液10000 r/min離心10 min,上清液作為粗酶液,測(cè)定幾丁質(zhì)脫乙酰酶活性。

1.3.2 幾丁質(zhì)脫乙酰酶酶活性的測(cè)定 試管中加入30 ℃預(yù)保溫的0.05 mol/L pH7.0的磷酸緩沖液3 mL,200 mg/L的對(duì)硝基乙酰苯胺水溶液1 mL,酶液1 mL,于30 ℃水浴反應(yīng)15 min,沸水浴終止酶促反應(yīng),3000 r/min離心10 min,測(cè)定上清液的吸光度(A400)。以添加1 mL同樣濃度沸水浴滅活15 min的酶液為對(duì)照。酶活單位(U)定義:在上述反應(yīng)條件下每小時(shí)產(chǎn)生1 μg對(duì)硝基苯胺所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.3.3 菌株的鑒定 對(duì)純化培養(yǎng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察并參考伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)對(duì)菌株MCDA01進(jìn)行生理生化鑒定[18]。

1.3.4 菌株的16S rDNA序列分析 提取菌株的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板[19],用于PCR反應(yīng)的通用引物為:27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′,所述反應(yīng)體系為:PCR mix(21 μL),上下游引物(各1 μL),DNA模板(2 μL)。反應(yīng)程序:94 ℃變性5 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,32個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至南京思普金公司測(cè)序。測(cè)定序列后,將測(cè)定的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較,并用MEGA 7軟件進(jìn)行同源性分析。

1.3.5 菌株生長(zhǎng)條件的研究

1.3.5.1 生長(zhǎng)溫度 將菌接種于pH7.0的2216E培養(yǎng)基中,分別置于5、15、25、30、35 ℃下,180 r/min培養(yǎng)。每隔6 h測(cè)定其OD600值。

1.3.5.2 生長(zhǎng)pH 將菌分別接種于pH為2.0～11.0的2216E培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后,測(cè)定其OD600值。

1.3.5.3 NaCl濃度 將菌接種于NaCl濃度分別為0～10%、pH7.0的2216E培養(yǎng)基中,25 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后,測(cè)定其OD600值。

1.3.6 菌株產(chǎn)酶條件的確定

1.3.6.1 菌株MCDA01的發(fā)酵 將菌株MCDA01接種于種子培養(yǎng)基中,在25 ℃過(guò)夜培養(yǎng)得種子液。再將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,初始發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度25 ℃,發(fā)酵時(shí)間72 h,初始pH為7.0,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,接種量1%(v/v),裝液量20%。發(fā)酵后按1.3.2方法測(cè)定酶活，并以最高酶活力作為100%，計(jì)算不同發(fā)酵條件下幾丁質(zhì)脫乙酰酶的相對(duì)酶活力，以每次測(cè)定的變量為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活力為縱坐標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件。

1.3.6.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響 在初始發(fā)酵條件下,采用不同的培養(yǎng)溫度5、10、15、20、25、30 ℃,培養(yǎng)后測(cè)定酶活,確定其最佳的產(chǎn)酶溫度。

1.3.6.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響 在初始發(fā)酵條件下,對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng),每隔12 h取一次樣,測(cè)定其酶活,確定最佳產(chǎn)酶時(shí)間。

1.3.6.4 pH對(duì)菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在初始發(fā)酵條件下,采用不同的初始pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,培養(yǎng)后測(cè)定酶活,確定最佳的初始pH。

1.3.6.5 裝液量對(duì)菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在初始發(fā)酵條件下,采用不同的裝液量10%、20%、30%、40%、50%,培養(yǎng)后測(cè)定酶活,確定最佳裝液量。

1.3.6.6 誘導(dǎo)劑幾丁質(zhì)濃度對(duì)菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在初始發(fā)酵條件下,采用不同的誘導(dǎo)劑濃度1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%,培養(yǎng)后測(cè)定酶活,確定最佳的誘導(dǎo)劑濃度。

1.3.7 正交法發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)發(fā)酵時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基起始pH、裝液量、誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行L16(45)的正交實(shí)驗(yàn)(如表1),以確定最終的最佳發(fā)酵條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 The factor and level of orthogonal experiment

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)三組平行,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(n=3)表示,采用SPSS Statistics19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株MCDA01的分離

通過(guò)含有對(duì)硝基-N-乙酰苯胺和粉末幾丁質(zhì)的篩選平板篩選得到5株可以在篩選平板上形成變色圈的菌株。將5株菌發(fā)酵后得粗酶液,酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。其中MCDA01的變色圈最大、活性最強(qiáng),所以選取MCDA01為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的菌株。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株MCDA01的形態(tài)學(xué)特征 該菌株為革蘭氏陰性短桿菌(圖1a),無(wú)芽孢。在LB固體培養(yǎng)上培養(yǎng)48 h后:菌落白色、不透明、表面光滑濕潤(rùn)、稍有突起,菌落邊緣呈小鋸齒狀、不易挑取。在含有幾丁質(zhì)和對(duì)硝基-N-乙酰苯胺的篩選培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生黃色變色圈(圖1b)。

表2 產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的酶活Table 2 Enzyme activity of the chitin deacetylase-producing strains

圖1 菌株MCDA01的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological features of strain MCDA01

2.2.2 菌株MCDA01的生理生化特征 該菌株不發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣,吲哚實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、明膠液化、淀粉水解、硝酸鹽還原、氧化酶性、尿素酶、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)呈陰性,不產(chǎn)生硫化氫,不利用蔗糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇、山梨醇,能利用檸檬酸鹽,接觸酶陽(yáng)性。部分生理生化結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果將菌株MCDA01初步鑒定為天目不動(dòng)桿菌(Acinetobacterschindleri)。

表3 菌株MCDA01部分生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Some physiological and biochemical test results of strain MCDA01

注:+:陽(yáng)性;-:陰性。

圖3 基于菌株MCDA01 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the strain MCDA01 based on 16S rDNA sequences

2.2.3 菌株MCDA01的16S rDNA序列分析 以MCDA01菌株的DNA為模板擴(kuò)增菌株MCDA01 16S rDNA,得到1500 pb左右PCR產(chǎn)物(圖2)。將PCR產(chǎn)物純化測(cè)序后,將所得1412 bp序列提交至GenBank(登錄號(hào):KY385627)做Blast比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)菌株MCDA01與Acinetobacterschindleri(登錄號(hào):CP018152.1)的同源性最高,相似度達(dá)100%。利用MEGA7.0軟件通過(guò)鄰接法并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3),菌株MCDA01與Acinetobacterschindleri在同一分支,進(jìn)一步表明二者親緣關(guān)系最近。進(jìn)一步證明菌株MCDA01為天目不動(dòng)桿菌。目前,尚無(wú)天目不動(dòng)桿菌分泌幾丁質(zhì)脫乙酰酶的報(bào)道。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose-gel electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragments 注:1、2:菌株MCDA01 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物;M:DL 2000 DNA Marker。

2.2.4 菌株MCDA01生長(zhǎng)條件的研究

2.2.4.1 溫度對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響如圖4,菌株MCDA01可以生長(zhǎng)的溫度范圍為5～35 ℃,在溫度為15～30 ℃時(shí)菌株生長(zhǎng)較快,30 ℃為菌株MCDA01生長(zhǎng)的最適溫度。一旦培養(yǎng)溫度超過(guò)30 ℃,菌株生長(zhǎng)的速度會(huì)下降。

圖4 溫度對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of strain MCDA01

2.2.4.2 pH對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響如圖5,菌株MCDA01在pH為2.0時(shí)幾乎不生長(zhǎng);隨著pH的增大,菌株在pH6.0～9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,其最適生長(zhǎng)pH為8.0,而在pH<6.0或pH>9.0時(shí),菌株的生長(zhǎng)速率會(huì)顯著下降。

圖5 pH對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of pH on the growth of strain MCDA01

2.2.4.3 NaCl濃度對(duì)菌株MCDA01生長(zhǎng)的影響 NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響如圖6,菌株MCDA01在0～10%的NaCl濃度范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到4%時(shí),菌株MCDA01的生長(zhǎng)狀況最佳;NaCl濃度超過(guò)6%時(shí),菌株的生長(zhǎng)速率顯著下降;NaCl濃度超過(guò)10%時(shí),菌株幾乎不生長(zhǎng)。菌株MCDA01最適生長(zhǎng)的NaCl濃度為4.0%,無(wú)NaCl時(shí)有一定的生長(zhǎng),屬于耐鹽海洋微生物。

圖6 NaCl濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of the concentration of NaCl on the growth of strain MCDA01

圖7 溫度對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of the temperature on enzyme production of the strain MCDA01

2.3 菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶條件的確定

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響 如圖7所示,在20 ℃時(shí)菌株MCDA01產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的量最高,而15 ℃僅為最高產(chǎn)酶量的80%。溫度超過(guò)20 ℃時(shí),菌株的產(chǎn)酶量迅速下降。到30 ℃時(shí),菌株的產(chǎn)酶量降到最高產(chǎn)酶量的20%左右。

2.3.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響 如圖8所示,發(fā)酵時(shí)間大于24 h后隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,菌株MCDA01的產(chǎn)酶量顯著增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)菌株MCDA01的產(chǎn)酶量最高。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)72 h時(shí),菌株MCDA01的相對(duì)酶活下降。

圖8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of the time on enzyme production of strain MCDA01

2.3.3 pH對(duì)菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 如圖9所示,隨著初始pH的升高,菌株MCDA01的產(chǎn)酶量逐漸增加,當(dāng)pH達(dá)到8.0時(shí)的產(chǎn)酶量達(dá)到最大,pH<5.0或>10.0時(shí)的酶產(chǎn)量會(huì)降低。菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH為8.0。

圖9 pH對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of initial pH on enzyme production of strain MCDA01

2.3.4 裝液量對(duì)菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 如圖10所示,當(dāng)裝液量不足20%時(shí),酶產(chǎn)量逐漸增加;當(dāng)裝液量為20%時(shí),菌株MCDA01的產(chǎn)酶量達(dá)到最大值;當(dāng)裝液量超過(guò)20%時(shí),菌株的產(chǎn)酶量下降。

圖10 裝液量對(duì)菌株MCDA01產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of liquid volume on enzyme production of strain MCDA01

2.3.5 誘導(dǎo)劑幾丁質(zhì)濃度對(duì)菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 如圖11所示，當(dāng)不添加誘導(dǎo)劑幾丁質(zhì)時(shí),菌株MCDA01的相對(duì)酶活為0,而誘導(dǎo)劑幾丁質(zhì)的添加量為1%～5%時(shí)產(chǎn)酶量達(dá)到最大值,低于1%或高于5%時(shí),產(chǎn)酶量降低。綜合考慮成本和產(chǎn)酶量,選擇1%的幾丁質(zhì)添加量。

圖11 幾丁質(zhì)濃度對(duì)MCDA01產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of the concentration of chitin on enzyme production of strain MCDA01

2.4 菌株MCDA01發(fā)酵產(chǎn)酶條件正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由R值可知,各個(gè)因素對(duì)酶活力影響大小順序依次為:培養(yǎng)基起始pH>裝液量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>誘導(dǎo)劑幾丁質(zhì)濃度。由表4可知,16組實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)組合為A3B2C2D4E1,由K值可知,最優(yōu)組合為A2B3C2D2E1。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,A2B3C2D2E1的酶活達(dá)到201.37 U/mL,因此確定A2B3C2D2E1為發(fā)酵產(chǎn)酶的最優(yōu)組合,即發(fā)酵時(shí)間60 h,發(fā)酵溫度20 ℃,培養(yǎng)基起始pH7,裝液量20%,誘導(dǎo)劑濃度1%。

表4 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Table 4 Design and analysis of L16(45)orthogonal test

3 結(jié)論

從黃海海州灣燕尾港海域的海泥中篩選得到5株產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶的菌株,從中選定一株酶活最高的菌株MCDA01,通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析將菌株MCDA01鑒定為天目不動(dòng)桿菌(Acinetobacterschindleri)。目前,尚無(wú)天目不動(dòng)桿菌分泌幾丁質(zhì)脫乙酰酶的報(bào)道。發(fā)酵條件優(yōu)化后,菌株MCDA01產(chǎn)酶水平達(dá)到201.37 U/mL,與初始酶活相比提高了4.14倍。本實(shí)驗(yàn)豐富了產(chǎn)幾丁質(zhì)脫乙酰酶菌株的品種資源,并且為菌株MCDA01的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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Screeningandidentificationofamarinebacteriaproducingchitindeacetylaseandoptimizationofitsfermentationconditions

GUZhang-hui1,LIUShu2,HUSheng-yuan1,LAIJiang-li1,WANGShu-jun2,JIAOYu-liang1,FANGYao-wei1,2,*

(1.College of Marine Science and Technology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.Jiangsu Marine Resources Development Research Institute,Lianyungang 222005,China)

TS201.3

A

1002-0306(2017)18-0129-06

2017-03-20

顧張慧(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：海洋微生物生物技術(shù)，E-mail：18262792387@163.com。

*通訊作者:房耀維(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：海洋微生物生物技術(shù)，E-mail：foroei@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201687);中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016M592245);教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金;江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(BK20151282);江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(SWYY-195);江蘇省高?！扒嗨{(lán)工程”；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目；淮海工學(xué)院科研創(chuàng)新基金(Z2014016)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(160034);青島博士后基金。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.025