秦惠宏, 王 春, 潘 芬, 劉昌頎, 趙克溫, 張 泓
兒童呼吸道分離流感嗜血桿菌的耐藥性和基因分型
秦惠宏1,2, 王 春2, 潘 芬2, 劉昌頎2, 趙克溫1, 張 泓2
目的研究兒童呼吸道分離流感嗜血桿菌的耐藥性和該菌ftsI基因分型與耐藥表型的關(guān)系。方法收集2016年第一季度住院患兒鼻咽吸出物中分離到的流感嗜血桿菌141株;用紙片擴(kuò)散法檢測細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性;用Nitroce fi n紙片法檢測細(xì)菌的β內(nèi)酰胺酶; 用PCR技術(shù)對分離菌株進(jìn)行ftsI基因檢測;比較不同基因型菌株對抗菌藥物的耐藥情況。結(jié)果141株流感嗜血桿菌β 內(nèi)酰胺酶檢出率為40.4%(57/141)、氨芐西林耐藥率為53.2%(75/141)。檢出ftsI基因突變率為72.3%(102/141),以Ⅲ型為主(72/102,70.6%)。β 內(nèi)酰胺酶基因陰性氨芐西林耐藥型菌株(gBLNAR)對氨芐西林和頭孢呋辛的耐藥率高于β 內(nèi)酰胺酶基因陰性氨芐西林敏感型菌株(gBLNAS)(P<0.05)。結(jié)論兒童呼吸道分離流感嗜血桿菌ftsI基因突變率高,以Ⅲ型為主。ftsI基因突變增加了流感嗜血桿菌對氨芐西林和頭孢呋辛的耐藥性。
流感嗜血桿菌; 耐藥性;ftsI基因
Abstract: ObjectiveTo investigate the antibiotic resistance pro fi le andftsIgenotypes ofHaemophilus in fluenzaeisolates from respiratory tract in children.MethodsA total of 141 consecutive nonduplicate clinical strains ofH. in fluenzaewere collected from January to March 2016. Antimicrobial susceptibility was determined using Kirby-Bauer method. Beta-lactamase production was detected by nitroce fin disk test. PCR technique was employed forftsIgenotyping. Antimicrobial resistance was compared between differentftsIgenotypes.ResultsThe prevalence of β-lactamases was 40.4% (57/141) inH. influenzaeisolates. More than half(53.2%, 75/141) of the strains were resistant to ampicillin. Mutation offtsIgene was positive in 72.3% (102/141) of the isolates. The dominant genotype of genomic beta-lactamase-negative ampicillin-resistant (gBLNAR) strains was type III (72/102, 70.6%). The gBLNAR strains showed higher resistance rate to ampicillin and cefuroxime than the genomic beta-lactamase-negative ampicillinsusceptible (gBLNAS) strains (P<0.05).ConclusionsHigh prevalence offtsIgene mutation is found in the strains ofH. in fl uenzaeisolated from respiratory tract in children. The dominant genotype of gBLNAR strains was type III. Mutation offtsIgene inH.in fluenzaeis associated with higher resistance rate to ampicillin and cefuroxime.
Key words:Haemophilus in fluenzae; antimicrobial resistance;ftsIgene
流感嗜血桿菌是引起社區(qū)獲得性感染的重要病原體,可引起社區(qū)獲得性呼吸道感染、肺炎、支氣管炎、急性中耳炎、細(xì)菌性腦膜炎等疾病[1]??诜陌逼S西林、阿莫西林-克拉維酸和靜脈輸注的頭孢噻肟、頭孢曲松是臨床上感染流感嗜血桿菌患兒首選藥物。隨著β內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用,其耐藥率也逐年遞增。本研究對呼吸道感染患兒呼吸道分離的流感嗜血桿菌進(jìn)行耐藥性分析和ftsI基因檢測,明確兒童呼吸道分離流感嗜血桿菌的耐藥情況、ftsI基因分型,比較不同基因型菌株對抗菌藥物的耐藥情況。
1.1.1菌株來源 收集2016年第一季度上海市兒童醫(yī)院住院患兒鼻咽吸出物分離到的流感嗜血桿菌141株,剔除同一患者同次住院重復(fù)分離株。
1.1.2培養(yǎng)基、抗菌藥物紙片和藥敏培養(yǎng)基 用上??片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司的HTM 平皿??咕幬锛埰逼S西林、阿莫西林-克拉維酸、阿奇霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、頭孢呋辛、氨芐西林-舒巴坦、甲氧芐啶-磺胺甲唑均為英國OXOID公司產(chǎn)品。
1.1.3PCR擴(kuò)增試劑 日本TaKaRa公司產(chǎn)品。
1.1.4引物合成 參考文獻(xiàn)[2]和GenBank中相關(guān)基因序列。針對流感嗜血桿菌特異性外膜蛋白P6基因設(shè)計引物P6,用于確認(rèn)菌株為流感嗜血桿菌,針對流感嗜血桿菌的TEM-1型β 內(nèi)酰胺酶基因設(shè)計引物TEM-1,針對無Asn-526-Lys氨基酸置換的ftsI基因設(shè)計引物PBP3-S,針對同時存在Asn-526-Lys和Ser-385-Thr氨基酸置換的ftsI基因設(shè)計引物PBP3-BLN,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成,引物序列及產(chǎn)物長度見表1。
表1 PCR引物序列Table 1 Primers used in PCR
1.1.5主要儀器 -80 ℃和-20 ℃冰箱(海爾,山東青島),干式恒溫器GL-150B(其林貝爾,江蘇海門),高速離心機(jī)Thermo LEGEND MICRO 17(Thermo,美國),PCR擴(kuò)增儀Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler(ABI, 美 國 ), 成 像 系 統(tǒng)BIO-RAD Gel DocXR+(Bio-Rad,美國)。
1.2.1菌株的分離培養(yǎng)和鑒定 巧克力平皿上挑取可疑菌落,密涂于TSA平皿,貼上Ⅴ﹑Ⅹ和Ⅴ+Ⅹ因子,同時需要Ⅴ因子和Ⅹ因子才能生長的為流感嗜血桿菌。用廈門質(zhì)譜儀器儀表有限公司生產(chǎn)的Microtype MS微生物快速鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定確認(rèn)流感嗜血桿菌。
1.2.2藥敏試驗(yàn) 采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法。質(zhì)控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49247。藥敏試驗(yàn)結(jié)果按CLSI 2015年版M100-25標(biāo)準(zhǔn)判斷。采用Nitroce fi n紙片檢測流感嗜血桿菌中的β 內(nèi)酰胺酶。
1.2.3細(xì)菌DNA模板的制備 采用煮沸法提取流感嗜血桿菌的DNA。取流感嗜血桿菌混勻0.9%NaCl 0.5 mL,濃度高于1麥?zhǔn)蠁挝?,制備懸液。懸液于加熱器?00 ℃加熱10 min,冷卻后置于高速離心機(jī),離心力13 800 g,離心1 min,取上清液,即為DNA模板,-20 ℃保存。
1.2.4PCR擴(kuò)增 反應(yīng)總體積50 μL,包括10 mmol/L dNTP 4 μL,10×buffer 5 μL,Taq DNA 聚合酶 1 μL,上下游引物各 1 μL,DNA 模版 2.5 μL,無菌去離子水35.5 μL。擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性10 min,隨后 94 ℃ 45 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,循環(huán)30次,最后72 ℃再延伸10 min。
1.2.5瓊脂糖凝膠電泳 取PCR產(chǎn)物5 μL,與1 μL含溴酚藍(lán)的loading buffer點(diǎn)樣液混勻,加到含GelRed核酸染料的2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中,電場強(qiáng)度3 V/cm,電泳35 min后,紫外燈下判讀結(jié)果,并保存凝膠成像。
1.2.6流感嗜血桿菌基因分型 根據(jù)流感嗜血桿菌的bla基因以及ftsI基因,將其分為4種基因型。其中,β內(nèi)酰胺酶基因陰性氨芐西林耐藥菌株(gBLNAR)和β 內(nèi)酰胺酶基因陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥株(gBLPACR)又根據(jù)ftsI基因不同的氨基酸置換分成不同的亞型,見表2。
表2 流感嗜血桿菌基因型Table 2 Genotypes ofHaemophilus in fl uenzae
1.2.7統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用WHONET5.6和SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
141株流感嗜血桿菌中β 內(nèi)酰胺酶檢出率為40.4%(57/141)。產(chǎn)酶株均檢測到TEM-1型bla基因。根據(jù)流感嗜血桿菌是否產(chǎn)β 內(nèi)酰胺酶,分別分析其對9種抗菌藥物的耐藥性。β 內(nèi)酰胺酶陽性菌株對抗菌藥物耐藥率均高于β 內(nèi)酰胺酶陰性菌株。產(chǎn)酶流感嗜血桿菌對氨芐西林、阿奇霉素耐藥率高于非產(chǎn)酶株(P<0.05),見表3。
表3 流感嗜血桿菌對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility ofHaemophilus in fl uenzaestrains in terms of β-lactamase status(%)
141株流感嗜血桿菌中,102株(72.3%)發(fā)生ftsI基因突變。102株突變株中,ftsI基因上發(fā)生 Asn-526-Lys(N526K)無 Ser-385-Thr(S385T)氨基酸置換,即Ⅱ型的比率為29.4%(30/102),同時發(fā)生Asn-526-Lys和Ser-385-Thr氨基酸置換(N526K+S385T),即Ⅲ型的比率為 70.6%(72/102)。
18株BLNAR均檢出ftsI基因突變,其中15株為Ⅲ型,3株為Ⅱ型。
2.4.1流感嗜血桿菌的基因分型 141株流感嗜血桿菌中,β 內(nèi)酰胺酶基因陰性氨芐西林敏感(gBLNAS)占13.5%(19/141),gBLNAR(Ⅱ)占12.1%(17/141),gBLNAR(Ⅲ)占34.0%(48/141),β 內(nèi)酰胺酶基因陽性氨芐西林耐藥(gBLPAR)占14.2%(20/141),gBLPACR(Ⅱ)占9.2%(13/141),gBLPACR(Ⅲ)占17.0%(24/141)。電泳分型圖,見圖1。
圖1 流感嗜血桿菌β 內(nèi)酰胺酶基因和ftsI基因結(jié)合分型Figure 1 Genotype ofHaemophilus in fl uenzaebased on bothblaandftsIgenes
2.4.2不同基因型別流感嗜血桿菌耐藥性分析 gBLNAR對氨芐西林和頭孢呋辛的耐藥率高于gBLNAS菌株(P<0.05), 對其余抗菌藥物gBLNAR和gBLNAS流感嗜血桿菌的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué) 意 義(P>0.05),gBLNAR( Ⅲ ) 與 gBLNAR(Ⅱ)菌株對氨芐西林的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),gBLNAR(Ⅲ) 對頭孢呋辛的耐藥率高于gBLNAR(Ⅱ)菌株(P<0.05),見表4。
表4 流感嗜血桿菌不同基因型對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 4 Susceptibility ofHaemophilus in fl uenzaestrains in terms ofblagene andftsIgene mutation
流感嗜血桿菌對β 內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制主要有2種,一種是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶(TEM-1型或ROB-1型),水解氨芐西林使其失活,這種耐藥機(jī)制導(dǎo)致氨芐西林耐藥稱β 內(nèi)酰胺酶陽性氨芐西林耐藥(BLPAR)流感嗜血桿菌;另一種是ftsI基因氨基酸位點(diǎn)突變引起青霉素結(jié)合蛋白(PBP)空間構(gòu)象的改變,使其對氨芐西林親和力下降,這種耐藥機(jī)制導(dǎo)致氨芐西林耐藥稱BLNAR流感嗜血桿菌。兩種機(jī)制同時出現(xiàn)導(dǎo)致阿莫西林-克拉維酸耐藥的菌株稱β 內(nèi)酰胺酶陽性阿莫西林-克拉維酸耐藥(BLPACR)流感嗜血桿菌[1]。1972年在歐洲首次報道氨芐西林耐藥,其耐藥機(jī)制是產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶。1980年首株BLNAR菌株被報道。ftsI基因有28種不同的突變模式和23個氨基酸置換位點(diǎn)。在抗菌藥物的選擇壓力下,流感嗜血桿菌的PBP3會發(fā)生兩種主要的適應(yīng)性改變[3]:一種是在KTG基序附近發(fā)生氨基酸置換,如發(fā)生Arg517His和Asn526Lys置換。另一種是在SSN基序附近發(fā)生氨基酸置換,如發(fā)生Met377Ile、Ser385Thr和Leu389Phe置換。根據(jù)不同位點(diǎn)的氨基酸置換,Ubukata等[1]將流感嗜血桿菌分為3型:Ⅰ型,在KTG基序附近發(fā)生Arg517His置換;Ⅱ型,在KTG基序附近發(fā)生Asn526Lys置換;Ⅲ型,在KTG基序附近發(fā)生Asn526Lys置換同時,在SSN基序附近發(fā)生Met377Ile、Ser385Thr和(或)Leu389Phe置換 。此次研究141株流感嗜血桿菌中,72.3%(102/141)發(fā)生ftsI基因突變。ftsI基因分型中,以Ⅲ型為主,占70.6(72/102),Ⅱ型占29.4%(30/102)。與葡萄牙、巴塞羅那等歐洲國家和地區(qū)以Ⅱ型為主不一致[4-5]。值得關(guān)注的是謝成彬等[6]報道了我國2011-2012年成都地區(qū)流感嗜血桿菌ftsI基因分型以Ⅰ/Ⅱ型為主,與本次研究以Ⅲ型為主不同,一種可能是由于地域不同,首選用藥習(xí)慣不同引起不同的ftsI基因突變,另一種可能是隨時間推移,ftsI基因突變有所改變。
本研究中,141株流感嗜血桿菌β 內(nèi)酰胺酶檢出率(40.4%),氨芐西林耐藥率(53.2%),BLNAR菌株檢出率(12.8%),頭孢呋辛耐藥率(32.6%),阿奇霉素非敏率(30.5%),分別較2012年本院各數(shù)據(jù)36.6%、44.7%、12.7%、14.6%、5.9%[7]均有增加,BLNAR菌株檢出平穩(wěn)。氨芐西林耐藥率高,不建議作為治療流感嗜血桿菌感染首選藥物。頭孢呋辛的耐藥率和阿奇霉素的非敏率明顯升高,可能與兒童患者用藥種類有限,將阿奇霉素和頭孢呋辛作為兒童呼吸道感染的常用藥物有關(guān)[8]。β 內(nèi)酰胺酶陽性菌株對抗菌藥物耐藥率均高于β 內(nèi)酰胺酶陰性菌株,表明產(chǎn)β 內(nèi)酰胺酶是流感嗜血桿菌對各種抗菌藥物耐藥性增加的主要原因。產(chǎn)酶流感嗜血桿菌對氨芐西林、阿奇霉素耐藥率高于非產(chǎn)酶株(P<0.05)。氨芐西林屬于β 內(nèi)酰胺類抗生素,流感嗜血桿菌產(chǎn)β 內(nèi)酰胺酶而耐藥。阿奇霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物,流感嗜血桿菌對這類抗生素耐藥可由先天或獲得性外排泵、核糖體甲基化及核糖體蛋白和RNA的變異引起[9],和細(xì)菌產(chǎn)酶是否有關(guān),具體有待進(jìn)一步研究。謝成彬等[6]對2011-2012年成都地區(qū)473株流感嗜血桿菌研究發(fā)現(xiàn)非產(chǎn)酶流感嗜血桿菌的ftsI基因突變對氨芐西林和第二代頭孢菌素影響較大,對第三代頭孢菌素影響較小,對非β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物影響很小,ftsI基因SSN基序的突變比KTG基序的突變更顯著地降低細(xì)菌對頭孢菌素敏感性。本研究中,gBLNAR對氨芐西林的耐藥率高于gBLNAS(P<0.05),gBLNAR(Ⅲ)和gBLNAR(Ⅱ)對氨芐西林的耐藥率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),說明非產(chǎn)β 內(nèi)酰胺酶流感嗜血桿菌中ftsI基因KTG基序上N526K突變增加其對氨芐西林耐藥性,SSN基序上S385T突變對氨芐西林耐藥性影響不大。gBLNAR對頭孢呋辛的耐藥率高于 gBLNAS(P<0.05),gBLNAR(Ⅲ) 對頭孢呋辛耐藥率高于gBLNAR(Ⅱ)(P<0.05),說明非產(chǎn)β 內(nèi)酰胺酶流感嗜血桿菌中ftsI基因KTG基序上N526K突變對頭孢呋辛耐藥性影響不大,SSN基序上S385T突變增加其對頭孢呋辛耐藥性,與謝成彬等[6]報道基本一致。gBLNAR和gBLNAS對非β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物(阿奇霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐啶-磺胺甲唑)和第三代頭孢菌素(頭孢噻肟)的耐藥率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明非產(chǎn)β 內(nèi)酰胺酶流感嗜血桿菌中ftsI基因突變對非β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物和第三代頭孢菌素幾乎無影響。另外,gBLNAS中有6株流感嗜血桿菌氨芐西林中介,可能存在此次研究中未涉及到的Arg517His 、Met377Ile、Ser385Thr或Leu389Phe氨基酸置換。法國、瑞士、德國等西方國家流感嗜血桿菌BLNAR的ftsI基因分型以Ⅱ型為主,Ⅲ型少見[8,10-11]。韓國2010年流感嗜血桿菌BLNAR的ftsI基因分型以Ⅱ型為主[12]。日本2007-2012年304株BLNAR中均發(fā)生ftsI基因突變,其中Ⅰ型8.2%,Ⅱ型9.5%,Ⅲ型占81.6%[13]。本次研究18株BLNAR中均檢出ftsI基因突變,其中15株為Ⅲ型, 3株Ⅱ型,BLNAR的ftsI基因突變以Ⅲ型為主,與日本報道一致。
綜上所述,由于流感嗜血桿菌對氨芐西林耐藥率高,不建議該藥作為治療流感嗜血桿菌感染的首選藥物。流感嗜血桿菌發(fā)生ftsI基因突變較常見,以Ⅲ型為主,突變增加了氨芐西林和頭孢呋辛耐藥率。關(guān)注流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)、對抗菌藥物的耐藥性和耐藥機(jī)制,有助于臨床合理用藥,延緩細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。
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Antimicrobial resistance pro file and genotypes of Haemophilus in fluenzae isolates from respiratory tract in children
QIN Huihong, WANG Chun, PAN Fen, LIU Changqi, ZHAO Kewen, ZHANG Hong. (Department of Pathophysiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China)
R378
A
1009-7708 ( 2017 ) 05-0532-06
10.16718/j.1009-7708.2017.05.009
2017-02-13
2017-05-12
上海市衛(wèi)計委重要薄弱學(xué)科建設(shè)(2015ZB0203)。
1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,上海 200025;
2. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科。
秦惠宏(1985—),女,學(xué)士,主管技師,主要從事細(xì)菌耐藥性研究。
趙克溫,E-mail: zkewen@sjtu.edu.cn。