siPGK1在調控黑色素瘤細胞對Vemurafenib敏感性中的作用及其機制*

劉 蓉， 宛 欣， 王 茜， 李凡璐， 景佳妮， 崔香麗

(山西醫(yī)科大學生理學系， 省部共建細胞生理學實驗室， 太原 030001)

siPGK1在調控黑色素瘤細胞對Vemurafenib敏感性中的作用及其機制*

劉 蓉， 宛 欣， 王 茜， 李凡璐， 景佳妮， 崔香麗△

(山西醫(yī)科大學生理學系， 省部共建細胞生理學實驗室， 太原 030001)

目的研究磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)對BRAFV600E突變型惡性黑色素瘤(MM)對Vemurafenib(Zelboraf)敏感性的影響及其機制。方法采用分子生物學、細胞生物學、藥理學相關實驗方法(MTT、Western blot、FCM、Colongenic)探討: ①PGK1以及Vemurafenib對MM細胞的存活增殖能力的影響；②通過siPGK1基因增加Vemurafenib藥敏感性的機制。結果①沉默PGK1基因后再給以BRAFV600E選擇性抑制劑Vemurfenib，MM細胞系的存活率明顯下降，并呈一定的劑量依賴性；②siPGK1增加MM細胞對Vemurafenib的藥物敏感性與激活凋亡信號通路有關。結論siPGK1通過激活凋亡信號通路增加MM細胞對Vemurafenib的藥物敏感性，從而抑制細胞的存活和增殖能力。

黑色素瘤, siPGK1, Vemurafenib, 細胞凋亡

黑色素瘤(melanoma metastasis，MM)是一種常見的并且發(fā)病率持續(xù)增長的惡性腫瘤。晚期MM患者大約25%有1年的存活率，平均存活率只有6.2個月[1]。全球每年大概有132，000例新增MM患者[2]，中國每年大概有20，000例新增MM患者。據(jù)統(tǒng)計，2016年惡性MM的新患病人數(shù)為76,380例，死亡10,130例[3]，成為北美第六大常見腫瘤。引起MM的原因有很多：陽光曝曬、室內增黑、宿主個體差異、長期接觸含氯化學試劑，六價金屬鉻、職業(yè)等。其中陽光照射是MM發(fā)生的最主要原因[4, 5]。病人的預后根據(jù)地域的不同而不同，隨著早期診斷和治療可以減少死亡率。目前針對MM的治療藥物已經有很多上市藥，如：BRAF抑制劑(vemurafenib，dabrafenib)、MAPK/MEK抑制劑(trametinib，cobimetinib)等，顯著有效地提高晚期MM患者轉移性疾病的預后[6]。皮膚型MM按基因型可分為四類：BRAF突變、NRAS突變、NF-1缺失和三類野生型[7]。大約50%的MM的BRAF基因發(fā)生點突變。BRAF突變成V600E，激活MAPK(RAS-RAF-MEK-ERK)信號通路，從而促進腫瘤細胞的持續(xù)生長。這個突破性的發(fā)現(xiàn)導致vemurafenib的臨床發(fā)展[1, 8]。Vemurafenib是一種選擇性BRAF抑制劑，于2011年八月經FDA批準上市，用于不能手術切除的MM及代謝性MM的臨床治療[9]。早期作用效果顯著，但是隨著治療時間的的持續(xù)會出現(xiàn)一定的耐藥性，尤其是在治療6～8個月之后，這可能與其耐藥機制有關[7]。最常見的副作用包括皮膚反應、光敏性、頭痛和關節(jié)痛等。因此，尋找新的治療途徑及靶點就顯得尤為重要。

大多數(shù)腫瘤細胞，即使是在有充足的氧存在的情況下，仍利用糖酵解途徑供能，即Warburg效應。丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)和磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)是糖酵解通路中僅有的兩種ATP生成酶。PK是一種促進磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和ADP轉化為丙酮酸和ATP的速率限制性糖酵解酶原。PGK1是糖酵解通路中產生ATP的第一個酶原，分別促進1,3-雙磷酸甘油酸(1,3-bisphos- phoglycerate, 1,3-BPG)和ADP可逆性轉化為3-磷酸甘油(3-phosphoglycerate, 3-PG)和ATP[10, 11]。PGK1 在人類乳腺癌、胰腺導管腺癌、抗放射性的星形膠質瘤、多重耐藥性的卵巢癌細胞以及轉移性的胃癌、結腸癌、肝癌細胞中表達均上調[12-15]。但是PGK1對MM細胞的影響及其促進腫瘤的形成的機制仍不是很清楚。

本課題就PGK1基因和BRAF突變抑制劑Vemurafenib的相互作用展開研究，探討沉默PGK1基因后，MM細胞對Vemurafenib敏感性的影響及其機制，為MM的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人MM細胞株： A375m、A375mR、C8161-C9、1205LU、UACC903 購自美國 ATCC 公司；DMEM 培養(yǎng)基(Lot 28316013)購自美國cellgro公司；胎牛血清(FBS)購自美國biologicals公司；0.25% Trypsin-EDTA(1X)(Lot:1572281)、Pen Strep(Lot：1835957)、Opti-MEM 培養(yǎng)基(Lot:1491090)購自美國Gibco公司；LipofectamineTMRNAiMAX Reagent (Lot:1836078)購自美國Invitrogen公司；Control siRNA-A (sc-37007,Lot: K0816)、PGK1 siRNA(h) (sc-36215,Lot: H2504)購自美國Santa Cruze公司；Vemurafenib，Gene Operation；Pierce 660 nm Protein Assay Reagent 購自美國Thermo公司；MTT(ThiazolylBlue Tetrazolium Bromide, approx.98% TLC) 購自美國Sigma公司；METHYLENE BLUE 購自美國Sigma公司；PGK1(Y-12)抗體(sc-17943，Lot:G1513)購自美國Santa Cruze公司；PARP Rabbit抗體(Lot:9542)、beta-Actin(D6A8,Lot:8457S)購自美國Cell Signaling公司；Polyclonal Goat Anti-Rabbit、Anti-Goat Immunoglobulins/HRP 購自美國Dako公司； Mammalian Protein Extraction Reagent(Lot:121217JE)購自美國Genlantis公司；Protease Inhibitor Cocktail Tablets購自美國Roche公司；2-MERCAPTOETHANOL(Lot:MR29303)購自美國MP Biomedicals公司；Western blot相關試劑購自美國Bio-Rad公司。

1.2 MTT檢測細胞活力

按5000個/孔的密度將MM細胞株接種到96孔板中，并于含5% CO2的37℃細胞孵育箱中過夜，給以不同濃度的Vemuragenib處理72 h。然后每孔加入2 mg/ml MTT 50 μl,繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，之后棄去培養(yǎng)基，每孔再加入100 μl DMSO,于搖床上混勻10 min 分別在570 nm 和 690 nm 處讀取OD值。對于轉染siPGK1及Control siRNA的MM細胞株則給以不同濃度的Vemurafenib處理48 h，其余相同。

1.3 siRNA轉染

轉染前一天將細胞分為siNT和siPGK1兩組，并保證轉染當天細胞濃度達到60%～80%；轉染當天分別將siNT(20 μmol/L，5 μl)、siPGK(10 μmol/L，10 μl)、RNAiMAX(10 μmol/L，10 μl)與Opti-MEM 培養(yǎng)基(250 μl)混勻，室溫靜置5 min；將siNT、siPGK分別與RNAiMAX混合并室溫靜置反應20 min；更換培養(yǎng)皿DMEM全培養(yǎng)基為不含抗生素但含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將混合試劑分別加入到培養(yǎng)皿中，轉染5～6 h 后更換含抗生素的培養(yǎng)基，并于含5% CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.4 克隆集落形成實驗

將400個MM細胞接種于35 mm的細胞培養(yǎng)皿中，并于含5% CO2的37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后給用不同濃度的Vemurafenib處理，培養(yǎng)14 d,棄去培養(yǎng)基并用1%的Methylene blue 1 ml/plate 染色30 min，用流動的自來水沖洗干凈后晾干并統(tǒng)計。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

100 μl 20000-100000 MM細胞株細胞懸液，加入100 μl含Annexin V 和 7-aminoactinomycin D (7ADD)的Guava Nexin試劑，避光反應20 min，用Guava Easy-CyteTM Plus Flow Cytometry System (Millipore )流式分析儀檢測細胞凋亡。

1.6 Western blot 檢測蛋白表達

MM細胞棄去培養(yǎng)基后用冷的PBS沖洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，并于冰上裂解10 min；收集裂解液并15 000 r/min，4℃離心20 min；收集上清液，測蛋白濃度；計算上樣蛋白質量為10 μg所需樣品體積，加入4×上樣緩沖液，98℃煮沸10 min；上樣，電泳，轉膜；5%脫脂奶粉封閉1 h；一抗4℃搖床孵育過夜；二抗室溫搖床孵育1 h；ECL顯影，暗室曝光。檢測PGK1、PARP、β-actin的表達量變化。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 BRAF突變型MM細胞株PGK1表達

首先采用Western blot檢測5個MM細胞株A375m、A375mR、C8161-C9、1205LU、UACC903中PGK1的表達，結果發(fā)現(xiàn)4個BRAFV600E細胞株A375m、A375mR、1205LU、UACC903的PGK1表達均高于野生型C8161-C9，其中A375m PGK1的表達量約為C8161-C9的2.26倍(P<0.01)， A375mR PGK1的表達量約為C8161-C9的1.69倍(P<0.05)，1205LU PGK1的表達量約為C8161-C9的1.20倍，UACC903 PGK1的表達量約為C8161-C9的2.04倍(P<0.05, 圖1A)。采用沉默PGK1(siPGK1)基因從而減少MM細胞株中PGK1蛋白的表達來檢測PGK1蛋白對MM細胞株細胞存活能力的影響，和siNT組相比siPGK1明顯降低PGK1的表達量(圖1B)。siPGK1后BRAFV600E細胞株的克隆集落形成能力明顯降低，且1205LU的下降最為顯著，UACC903的集落形成能力下降最少(圖1C)。MTT檢測PGK1基因敲除后細胞的存活能力，A375m的存活能力下降最多(0.297±0.026)，A375mR的存活能力下降最少(0.138±0.039, 圖1D)

Fig.1The effects of PGK1 on cell survival and proliferation in melanoma cell lines A： The expression of PGK1 in 5 MM cell lines(Western blot); B: The silencing level of PGK1.siNT(10 μmol/L, 72 h), siPGK1(15 μmol/L, 72 h); C: Effect of siPGK1 to colony formation in melanoma cells; D: Effect of siPGK1 to cell viability in melanoma cells, MTT(2 mg/ml，48 h)*P<0.05,**P<0.01vsC8161-C9 and siNT

2.2抑制PGK1的表達對MM細胞的Vemurafenib敏感性的影響

Vemurafenib是一種選擇性BRAFV600E抑制劑，明顯降低A375m、1205LU、UACC903的存活能力，且對A375m的抑制作用效果最為顯著。1 μmol/L Vemurafenib即可使細胞株A375m、A375mR的存活能力分別下降至0.35±0.01(P<0.01)、0.37±0.02(P<0.01)；但給與10 μmol/L Vemurafenib后A375mR表現(xiàn)出明顯的耐藥性，其存活能力反而上升(0.45±0.02，P<0.01)，而A375m的存活能力進一步下降(0.22±0.009，P<0.01)。對野生型C8161-C9的抑制作用并沒有另外4株BRAFV600E突變的細胞明顯(圖2B)。接下來用MTT法檢測siPGK1轉染之后Vemurafenib對4株細胞存活率的影響，結果表明，siPGK1確實能夠增加BRAFV600E突變的MM細胞株的藥物敏感性，抑制細胞的生長和增殖。其中以A375m、1205LU的抑制效果較為明顯； A375mR在給以10 μmol/L Vemurafenib后，耐藥性使細胞存活能力上升；UACC903在給以較大劑量濃度后可明顯降低其存活能力(圖2C)?？寺〖鋵嶒炦M一步說明siPGK1和Vemurafenib有協(xié)同作用，可以抑制BRAFV600E突變的MM細胞的生長和增殖能力。但在本實驗中，隨著長時間的Vemurafenib處理，A375mR的藥物抵抗作用消失，10 μmol/L Vemurafenib處理14 d，集落形成率由1下降到0.49±0.04(P<0.05)，siPGK1之后，更是從1下降到0.26±0.02(P<0.05，圖2 D)。

2.3 Vemurafenib敏感性對細胞凋亡活化的影響

Annexin V和7ADD檢測結果顯示siPGK1和Vemurafenib聯(lián)合處理BRAFV600E突變的MM細胞株，凋亡比例隨著用藥濃度的增加而增加，其中A375m的凋亡效果最為明顯(圖3A)。PARP蛋白在siNT和siPGK1細胞株內表達并沒有特別明顯的變化，但是在給以Vemurafenib聯(lián)合處理后，PARP呈明顯裂解活躍狀態(tài)(圖3B)。表明Vmurafenib可以促進腫瘤細胞凋亡活化水平，并且聯(lián)合給以siPGK1處理后，激活效果更加明顯。進一步證明siPGK1增加BRAFV600E突變型MM細胞株對Vemurafenib的藥物敏感性可能是通過激活細胞凋亡而實現(xiàn)的。

3 討論

本課題對5株MM細胞同時進行研究，結果發(fā)現(xiàn)siPGK和Vemurafenib聯(lián)合使用對野生型MM細胞的作用并不明顯，但是對4株BRAF突變的MM作用效果也不盡相同。A357m 對Vemurafenib敏感，在較低劑量濃度下(為其他3株MM細胞的1/10)即可表現(xiàn)出較高的死亡率，siPGK和Vemurafenib聯(lián)合處理，凋亡率和存活率進一步提高。A375mR在低劑量濃度(<5 μmol/L)發(fā)生凋亡，但在10 μmol/L時反而出現(xiàn)凋亡下降，存活率上升的情況，但是從克隆集落形成試驗看，整體還是促進凋亡的，這可能與用藥時間有關，但其機制仍有待進一步的研究。1205LU細胞呈離散型生長，對siPGK和Vemurafenib聯(lián)合處理效果明顯。UACC903也是BRAF突變型，但是其對siPGK和Vemurafenib聯(lián)合治療并沒有另外3株明顯，其機制有待進一步研究。這也提示在臨床治療中要考慮個體差異，針對性治療。

Fig.2Combined treatment of siPGK1 and vemurafenib decreased melanoma cell lines’ survival ability A： Chemical structure of vemurafenib； B： Effect of vemurafenib on cell survival in melanoma cells (0,0.01,0.1,1,10 μmol/L，72 h)； C: The co-effection of siPGK1 and vemurafenib on cell survival and proliferation in melanoma cells(siNT 10 μmol/L，72 h；siPGK1 15 μmol/L，72 h)vemurafenib(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L，48 h); D: The co-effection of siPGK1 and vemurafenib to colony formation in melanoma cells. Vemurafenib(A375 m 0， 0.25, 0.5, 1 μmol/L； A375mR、1205LU、UACC903 0,2.5,5,10 μmol/L)*P<0.05vssiNT 0 μmol/L;#P<0.05vssiPGK1 0 μmol/L

Fig.3siPGK1 enhanced drug sensitive to vemurafenib through activating apoptosis pathway in melanoma cell lines A: The co-effection of siPGK1 and vemurafenib on cell apoptosis (Annexin V、7ADD，100 μl，20 min; A375 m 0, 0.25, 0.5 μmol/L； A375mR、1205LU、UACC903 0, 2.5, 5 μmol/L, 24 h); B: Western blot detected the co-effection of siPGK1 and vemurafenib to PGK1 and PARP (siNT 10 μmol/L, 72 h；siPGK1 15 μmol/L, 72 h; A375m 0，0.2 μmol/L； A375mR、1205LU、UACC903 0, 2 μmol/L,48 h)*P<0.05,**P<0.01vssiNT 0 μmol/L;#P<0.05,##P<0.01vssiPGK1 0 μmol/L

BRAF抑制劑(vemurafenib，dabrafenib)和MEK抑制劑(trametinib，cobimetinib)的聯(lián)合使用已經取代單一使用BRAF抑制劑治療MM的新的治療方法，并成為臨床治療BRAF突變型MM的標準。由于長期單一使用BRAF抑制劑會使病人獲得性藥物抵抗而失效，但是還沒有研究表明聯(lián)合用藥是否同樣會使病人發(fā)生獲得性藥物抵抗。也有研究者提出使用BRAF-MEK抑制劑的同時聯(lián)合使用免疫治療，這項治療方法仍在研究中[16-19]。本項實驗從腫瘤代謝的角度出發(fā)，將臨床治療藥物與重要代謝基因靶點結合，旨在尋找新的治療思路。結果顯示有一定的效果，在后期實驗可以考慮使用BRAF-MEK聯(lián)合抑制劑與PGK1結合。另外腫瘤細胞有其自身的代謝供能及凋亡調節(jié)機制，目前對腫瘤的治療有化療、放療、免疫治療等等[2]，同時也可以考慮從促進腫瘤細胞凋亡的角度出發(fā)，探索新的治療方法，如可以考慮使用一些促進腫瘤細胞凋亡的天然藥物成分[20、21]。本課題還可以在凋亡通路方面進行更深一步的探究，對抑制PGK1的表達增加MM細胞對Vemurafenib敏感性，促進細胞凋亡從而抑制細胞生長和增殖進行更深一步的研究。

致謝：實驗過程中得到美國賓州州立大學米爾頓赫爾希醫(yī)學中心藥學院楊金銘教授以及任行聰教授的大力幫助。在此表示誠摯的感謝。

[1] Hagen B, Trinh VA. Managing side effects of vemurafenib therapy for advanced melanoma[J].JAdvPractOncol, 2014, 5(6): 400-410.

[2] Niezgoda A, Niezgoda P, Czajkowski R. Novel approaches to treatment of advanced melanoma: a review on targeted therapy and immunotherapy[J].BiomedResInt, 2015, 2015: 851387.

[3] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016[J].CACancerJClin, 2016, 66(1): 7-30.

[4] Rochette PJ, Lacoste S, Therrien JP,etal. Influence of cytosine methylation on ultraviolet-induced cyclobutane pyrimidine dimer formation in genomic DNA[J].MutatRes, 2009, 665(1-2): 7-13.

[5] Howard LK, Janice MM. Melanoma[C].CancerTreatmentandResearch, 2016.

[6] Schadendorf D, Fisher DE, Garbe C,etal. Melanoma[J].NatureReviewsDiseasePrimers, 2015, 1: 1-20.

[7] Manzano JL, Layos L, Bugés C,etal. Resistant mechanisms to BRAF inhibitors in melanoma[J].AnnTranslMed, 2016, 4(12): 237-246.

[8] Demirsoy S, Martin S, Maes H,etal. Adapt, recycle, and move on: proteostasis and trafficking mechanisms in melanoma[J].FrontOncol, 2016, 6: 240.

[9] Shelledy L, Roman D. Vemurafenib: First-in-Class BRAF-mutated inhibitor for the treatment of unresectable or metastatic melanoma[J].JAdvPractOncol, 2015, 6(4): 361-365.

[10]Li X, Zheng Y, Lu Z. PGK1 is a new member of the protein kinome[J].CellCycle, 2016, 15(14): 1803-1804.

[11]Wang S, Jiang B, Zhang T, et al. Insulin and mTOR pathway regulate HDAC3-mediated deacetylation and activation of PGK1[J].PlosBiol, 2015, 13(9): el002243.

[12]Li X, Jiang Y, Meisenhelder J,etal. Mitochondria-translocated PGK1 functions as a protein kinase to coordinate glycolysis and the TCA cycle in tumorigenesis[J].MolCell, 2016, 61(5): 705-719.

[13]Ai J, Huang H, Lv X,etal. FLNA and PGK1 are two potential markers for progression in hepatocellular carcinoma[J].CellPhysiolBiochem, 2011, 27(3-4): 207-216.

[14]Sun S, Liang X, Zhang X,etal. Phosphoglycerate kinase-1 is a predictor of poor survival and a novel prognostic biomarker of chemoresistance to paclitaxel treatment in breast cancer[J].BrJCancer, 2015, 112(8): 1332-1339.

[15]Ahmad SS, Glatzle J, Bajaeifer K,etal. Phosphoglycerate kinase 1 as a promoter of metastasis in colon cancer[J].IntJOncol, 2013, 43(2): 586-590.

[16]Wang H, Zhang L, Yang L,etal. Targeting macrophage anti-tumor activity to suppress melanoma progression[J].Oncotarget, 2017, 8(11): 18486-18496.

[17]Ratterman M, Hallmeyer S, Richards J. Sequencing of new and old therapies for metastatic melanoma[J].CurrTreatOptionsOncol, 2016, 17(10): 52-61.

[18]Keating GM. Cobimetinib plus vemurafenib: a review in BRAF (V600) mutation-positive unresectable or metastatic melanoma[J].Drugs, 2016, 76(5): 605-615.

[19]de Golian E, Kwong BY, Swetter SM,etal. Erratum to: Cutaneous complications of targeted melanoma therapy[J].CurrTreatOptionsOncol, 2016, 17(11): 57-70.

[20]李秀娟, 李玉珍, 金春亭, 等. 姜黃素作用PTEN/PI3K/AKT通路誘導食管癌EC109細胞凋亡[J]. 中國應用生理學雜志, 2015, 31(2): 174-177.

[21]周開宇, 吉海龍, 史鵬飛. 苦參堿對體外人髓母細胞瘤D341細胞凋亡、增殖及凋亡相關蛋白的影響[J]. 中國應用生理學雜志, 2016, 32(1): 74-77.

SilencingofPKG1expressionenhancestheefficacyofvemurafenibagainstmelanomacell

LIU Rong, WAN Xin, WANG Xi, LI Fan-lu, JING Jia-ni, CUI Xiang-li△

(Department of Physiology, Cell Physiology Key Laboratory of Shanxi Province, Shanxi Medical University，Taiyuan 030001, China)

Objective: To explore whether targeting phosphoglycerate kinase 1 (PGK1) can enhance the sensitivity of BRAFV600Emutation melanoma cells to vemurafenib.MethodsThe methods of cell biology, molecular biology and pharmacology(MTT assay, Western blot, FCM, Colongenic assay) were used in this study.Results① Silencing of PGK1 expression increased the efficacy of vemurafenib in melanoma cells, as evidenced by greater killing in the tumor cells subjected to combined treatment of vemurafenib with siPGK1; ②The mechanism of enhanced sensitivity of melanoma cells to vemurafenib was associated with activation of apoptotic signaling pathway.ConclusionTargeting of PGK1 may represent a novel strategy of sensitizing melanoma cells to vemurafinib.

melanoma; PGK1; vemurafenib; apoptosis

R739.5; R-331

A

1000-6834(2017)04-289-05

國家自然科學基金(81272695)；山西省自然科學基金(2012011040-8)；山西醫(yī)科大學科技創(chuàng)新基金 ([2012]11)

2017-01-17

2017-05-13

△

Tel: +86-0351-4135075; E-mail: cuixlcxl@sina.com

10.12047/j.cjap.5559.2017.071