GRIM-19在子宮腺肌病中的表達(dá)及促進(jìn)疾病發(fā)展的機(jī)制研究

蔣 靜，陳 燕，吳 宏

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川南充 637000)

GRIM-19在子宮腺肌病中的表達(dá)及促進(jìn)疾病發(fā)展的機(jī)制研究

蔣 靜，陳 燕，吳 宏

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川南充 637000)

目的研究誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-19(GRIM-19)在子宮腺肌病患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平，并探討其在疾病發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。方法取30例子宮腺肌病患者異位和在位內(nèi)膜組織，采用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測內(nèi)膜組織中GRIM-19、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(pSTAT3)和內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)水平。采用TUNEL檢測內(nèi)膜組織凋亡，CD34抗體直接檢測內(nèi)膜組織新生血管形成。構(gòu)建GRIM-19 siRNA和重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞后檢測下游信號分子pSTAT3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)和VEGF的變化。結(jié)果與對照組相比，子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中GRIM-19表達(dá)水平降低。在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中細(xì)胞凋亡減少，微血管密度、pSTAT3和VEGF表達(dá)水平升高。轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞，下調(diào)GRIM-19表達(dá)可顯著激活pSTAT3和VEGF。結(jié)論GRIM-19通過抑制細(xì)胞凋亡和增加新生血管形成，促進(jìn)子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展。

凋亡誘導(dǎo)因子；子宮腺肌病；凋亡；血管生成

子宮腺肌病是育齡女性常見的婦科疾病，由子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)侵襲至子宮肌層，并引起肌層顯著增厚。目前子宮腺肌病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(GRIMs)是一種近年來研究發(fā)現(xiàn)的由干擾素/維甲酸合并誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡基因編碼，通過反義RNA敲除技術(shù)篩選出的凋亡蛋白[1]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-19(GRIM-19)是GRIMs家族成員之一，在多種正常組織中表達(dá)，而在腫瘤如腎透明細(xì)胞癌和前列腺癌中GRIM-19表達(dá)明顯降低[2]。GRIM-19可與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性[3]。持續(xù)活化的STAT3可抑制細(xì)胞凋亡，并直接上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)，刺激新生血管形成[4]。研究GRIM-19在子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平，并探索其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，可能為子宮腺肌病的治療提高新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本收集 子宮內(nèi)膜標(biāo)本選取本院2014年1月至2015年12月經(jīng)腹或腹腔鏡子宮切除術(shù)患者中經(jīng)病理證實(shí)的30例子宮腺肌病患者(年齡31～41歲，體質(zhì)量指數(shù)17.66～29.4 kg/m2，增殖期子宮內(nèi)膜17例，分泌期子宮內(nèi)膜13例)，10例非子宮腺肌病患者(年齡33～39歲，體質(zhì)量指數(shù)18.8～26.8 kg/m2，增殖期子宮內(nèi)膜6例，分泌期子宮內(nèi)膜4例)。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，納入研究的患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：近3個月口服避孕藥或其他激素藥物；子宮內(nèi)膜癌；盆腔子宮內(nèi)膜異位癥；子宮肌瘤；卵巢囊瘤。收集的子宮內(nèi)膜標(biāo)本分別保存于液氮和4%甲醛固定。

1.2TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 制備內(nèi)膜組織石蠟包埋切片，利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Roche)進(jìn)行脫蠟、漂洗、蛋白酶K處理、固定和封閉。設(shè)置陽性對照和陰性對照，配置Dnasel反應(yīng)液，孵育并滴加100 μL TdT酶反應(yīng)液標(biāo)記，避光孵育60 min后滴加DAB顯色液，漂洗后中性樹膠封片。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野計數(shù)TUNEL染色陽性細(xì)胞。

1.3免疫組織化學(xué) 收集內(nèi)膜組織甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，脫蠟后加入定量pH6.0檸檬酸鹽緩沖液和3%H2O2，用血清封閉后滴加一抗，GRIM-19單抗(Abcam，1∶500)、pSTAT3單抗(Abcam，1∶100)、VEGF抗體(Abcam，1∶150)、CD34單抗 (Zhongshan，1∶100)，4 ℃孵育過夜。沖洗后滴加二抗，孵育30 min后沖洗顯色，復(fù)染后封片。采用Image Pro-plus進(jìn)行免疫組織化學(xué)吸光度測量。

1.4蛋白提取及Western blot 使用Tissue Protein Extraction Reagent(Cwbio)提取內(nèi)膜組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，50 μg/孔上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)膜封閉，孵育抗體并顯色。抗體稀釋濃度如下：GRIM-19 (Abcam∶mAb，1∶1 000)，pSTAT3(Abcam∶mAb，1∶5 000)，STAT3(Abcam∶mAb，1∶1 000)，VEGF (Abcam∶pAb，1∶1 500)，GAPDH(Abcam∶mAb，1∶3 000)。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Ishikawa細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)院細(xì)胞資源中心，采用DMEM培養(yǎng)基和10%FBS培養(yǎng)。pEGFP-N1、GRIM-19重組質(zhì)粒(pEGFP-N1-GRIM-19)和FAM-siRNA、GRIM-19-siRNA(5′-GGAUUGGAACCCUGAUCUATT-3′)均由上海吉凱基因合成及鑒定。采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后48 h提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié) 果

2.1子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中GRIM-19的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)方法檢測子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織以及對照組子宮內(nèi)膜中GRIM-19表達(dá)水平。結(jié)果顯示GRIM-19染色主要位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞，子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中GRIM-19表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)，并且子宮腺肌病患者異位內(nèi)膜組織中GRIM-19表達(dá)低于在位內(nèi)膜組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1A。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜GRIM-19蛋白表達(dá)較對照組明顯降低(P<0.05)，見圖1B。

2.2子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中細(xì)胞凋亡情況 采用TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織細(xì)胞凋亡情況。與對照組內(nèi)膜組織相比，子宮腺肌病患者在位和異位內(nèi)膜組織中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，其中異位病灶內(nèi)膜組織中凋亡細(xì)胞數(shù)少于在位內(nèi)膜組織，見圖2。不同內(nèi)膜組織中凋亡細(xì)胞數(shù)不隨月經(jīng)周期而改變，增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜凋亡細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3子宮腺肌病內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)和新生血管形成 疾病發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生促進(jìn)血管新生。本實(shí)驗(yàn)中采用免疫組織化學(xué)法檢測內(nèi)膜組織中VEGF的表達(dá)，通過檢測新生血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34表達(dá)來確定內(nèi)膜組織中微血管密度。結(jié)果顯示，增殖期和分泌期子宮內(nèi)膜組織中染色的VEGF主要位于腺上皮細(xì)胞內(nèi)。與對照組內(nèi)膜組織相比，子宮腺肌病患者在位和異位內(nèi)膜組織中VEGF表達(dá)明顯升高(P<0.05)，其中異位病灶內(nèi)膜組織中VEGF表達(dá)量最高，見圖3A。3組內(nèi)膜組織中，增殖期與分泌期子宮內(nèi)膜VEGF表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜VEGF蛋白表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，見圖3B。與對照組內(nèi)膜相比，子宮腺肌病患者異位內(nèi)膜組織中微血管密度明顯升高，見3C。

2.4GRIM-19通過STAT3調(diào)控VEGF表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法檢測內(nèi)膜組織中pSTAT3表達(dá)。結(jié)果顯示對照組內(nèi)膜組織中pSTAT3主要位于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中pSTAT3主要位于腺上皮細(xì)胞。在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中pSTAT3表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)，見圖4A。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜pSTAT3蛋白表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，而兩組總STAT3蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4B。

A：子宮腺肌病患者在位、異位內(nèi)膜組織和對照組正常內(nèi)膜組織中GRIM-19免疫組織化學(xué)染色×400光鏡圖及染色陽性細(xì)胞平均密度分?jǐn)?shù)；B：子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜組織和對照組正常內(nèi)膜組織中GRIM-19蛋白表達(dá)及蛋白相對表達(dá)量柱狀圖。*：P<0.05，**：P<0.01

圖1子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中GRIM-19的表達(dá)情況

A：子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織和對照組內(nèi)膜組織TUNEL凋亡染色(×400)，黑色箭頭所示為凋亡細(xì)胞TUNEL染色陽性。B：不同組織中TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)。*：P<0.05，**：P<0.01

圖2子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織細(xì)胞凋亡情況

A：子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織和對照組內(nèi)膜組織VEGF免疫組織化學(xué)染色(×400)和染色陽性細(xì)胞平均密度分?jǐn)?shù)；B：子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜組織和對照組正常內(nèi)膜組織中VEGF蛋白表達(dá)及蛋白相對表達(dá)量柱狀圖；C：子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織和對照組內(nèi)膜組織CD34免疫組織化學(xué)染色(×200)和微血管密度統(tǒng)計分析柱狀圖。*：P<0.05，**：P<0.01

圖3子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織VEGF表達(dá)和微血管密度分析

A：子宮腺肌病患者在位、異位內(nèi)膜組織和對照組正常內(nèi)膜組織中pSTAT3免疫組織化學(xué)染色(×400)及染色陽性細(xì)胞平均密度分?jǐn)?shù)；B：子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜組織和對照組正常內(nèi)膜組織中pSTAT3和總STAT3蛋白表達(dá)及蛋白相對表達(dá)量柱狀圖。*:P<0.05，**:P<0.01

圖4子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中pSTAT3的表達(dá)情況

A：Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染GRIM-19 siRNA和Control siRNA 48 h后GRIM-19、pSTAT3、STAT3和VEGF蛋白表達(dá)及蛋白相對表達(dá)量柱狀圖；B：Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-GRIM-19和空載pEGFP后×400熒光和普通鏡光鏡圖；C：Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-GRIM-19和空載pEGFP 48 h后GRIM-19、pSTAT3、STAT3和VEGF蛋白表達(dá)及蛋白相對表達(dá)量柱狀圖。*：P<0.05，**：P<0.01

圖5上調(diào)和下調(diào)GRIM-19對pSTAT3和VEGF表達(dá)的影響

小干擾RNA(GRIM-19 siRNA和Control siRNA)轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示相較于空白對照組，轉(zhuǎn)染GRIM19 siRNA后Ishikawa細(xì)胞表達(dá)GRIM-19明顯減少(P<0.05)，而pSTAT3及其下游VEGF表達(dá)明顯增加(P<0.05)，見圖5A。Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-GRIM-19上調(diào)GRIM-19表達(dá)，熒光顯微鏡下評估轉(zhuǎn)染效率，見圖5B。與空載質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-GRIM-19后細(xì)胞表達(dá)GRIM-19明顯增加(P<0.05)，pSTAT3和VEGF表達(dá)減少(P<0.05)；總STAT3表達(dá)在兩組細(xì)胞內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5C。

3 討 論

子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。解剖上子宮內(nèi)膜基底層缺乏黏膜下層，使得子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)易于侵入子宮肌層，并在肌層內(nèi)形成異位病灶。然而，觸發(fā)子宮內(nèi)膜“侵襲”子宮肌層的具體機(jī)制尚未完全明確。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)在異位病灶組織內(nèi)存在一系列形態(tài)功能改變，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和新生血管的形成等。這些功能改變增強(qiáng)了異位病灶內(nèi)腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的侵襲能力，使得異位的內(nèi)膜組織更易在子宮肌層內(nèi)“擴(kuò)散轉(zhuǎn)移”。研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67是一種細(xì)胞增殖常用標(biāo)記蛋白，在子宮腺肌病內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)[6]。因此，子宮內(nèi)膜細(xì)胞異常的細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡可能明顯影響子宮腺肌病的發(fā)展過程。同時，異位內(nèi)膜病灶的建立需要新生血管形成并供給血液[7]。在本研究中，筆者檢測了子宮腺肌病患者內(nèi)膜組織中GRIM-19的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡和新生血管形成情況，發(fā)現(xiàn)GRIM-19通過調(diào)控細(xì)胞凋亡和血管形成，在子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少，這與Taguchi等[8]的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果提示抑制細(xì)胞凋亡可能是子宮腺肌病發(fā)生過程中一個重要的步驟。有研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)GRIM-19可增強(qiáng)IFN-維甲酸介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。眾多研究提示GRIM-19對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長有重要影響。另外，GRIM-19在抑制腫瘤生長的過程中也起著關(guān)鍵作用，GRIM-19等位基因的缺失可增加活體細(xì)胞腫瘤易感性[9]。Hao等[10]研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)GRIM-19可顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞黏附和侵襲能力，而Huang等[11]的研究結(jié)果提示上調(diào)GRIM-19表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的黏附、遷移和侵襲過程。本研究中，子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中GRIM-19表達(dá)顯著減少。這些結(jié)果提示，內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞低表達(dá)GRIM-19可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡減少，從而誘導(dǎo)腺體和間質(zhì)侵襲至內(nèi)膜肌層交界區(qū)甚至子宮肌層，導(dǎo)致子宮腺肌病的發(fā)生。

為了進(jìn)一步探討GRIM-19介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，筆者檢測了GRIM-19相關(guān)基因STAT3的表達(dá)。Bu等[3]發(fā)現(xiàn)GRIM-19通過下調(diào)細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)，抑制STAT3介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和有絲分裂等過程。本實(shí)驗(yàn)中，子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中存在STAT3的異常激活，且GRIM-19呈相應(yīng)的低表達(dá)。同本研究結(jié)果一致，Yue等[12]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中GRIM-19低表達(dá)與pSTAT3的過度活化密切相關(guān)。pSTAT3在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。STAT3的磷酸化過程主要受上游酪氨酸激酶調(diào)控，包括細(xì)胞因子、生長因子、非受體酪氨酸激酶等。GRIM-19通過介導(dǎo)v-Src可顯著減少pSTAT3及下游相關(guān)基因的表達(dá)，如c-myc、cyclin B1和cyclin D1等[13]。這些結(jié)果提示，GRIM-19可通過抑制pSTAT3活化，從而減少子宮腺肌病內(nèi)膜細(xì)胞凋亡和生長。

VEGF作為新生血管形成過程中重要的因子，也是STAT3下游靶基因蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)在子宮腺肌病患者在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜組織中VEGF水平顯著升高[14]，同本研究結(jié)果一致。組織芯片研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中pSTAT3與VEGF的表達(dá)存在相關(guān)性，高表達(dá)的pSTAT3通過介導(dǎo)VEGF啟動子活性影響VEGF的表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)中，下調(diào)GRIM-19的表達(dá)可激活pSTAT3，促進(jìn)其下游VEGF表達(dá)。

綜上所述，低表達(dá)的GRIM-19可能通過調(diào)節(jié)GRIM-19-STAT3-VEGF信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，加快新生血管形成，從而促進(jìn)子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展。GRIM-19可能成為子宮腺肌病的治療新靶點(diǎn)。

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ExpressionofGRIM-19inadenomyosisanditsmechanismforpromotingdiseaseprogress

JiangJing,ChenYan,WuHong

(DepartmentofObstetricsandGynecology，AffiliatedHospitalofChuanbeiMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo study the expression level of GRIM-19 in endometrial tissue of the patients with adenomyosis and to investigate its molecular mechanism during disease occurrence and progress process.MethodsThe ectopic and eutopic endometrial tissues were obtained from 30 patients with adenomyosis.Immunohistochemistry and Western blot were performed to detect the expression of GRIM-19,pSTAT3 and VEGF.The endometrial tissue apoptosis was assayed by TUNEL.Immunohistochemistry with anti-CD34 antibody was performed to detect angiogenesis in endometrial tissue.GRIM-19 small interfering RNA(siRNA) and recombinant GRIM-19 plasmid were constructed and transfected into Ishikawa cells for detecting the change of downstream signal molecules pSTAT3,STAT3 and VEGF.ResultsThe expression level of GRIM-19 was decreased in the ectopic and eutopic endometrial tissues of patients with adenomyosis compared with control group.Apoptosis in ectopic and eutopic endometrial tissues was reduced;the microvessel density and expression levels of pSTAT3 and VEGF were increased.Transfecting Ishikawa cells and down-regulating GRIM-19 expression could significantly activate pSTAT3 and VEGF.ConclusionGRIM-19 promotes the occurrence and development of adenomyosis by inhibiting apoptosis and angiogenesis.

apoptosis inducing factor;adenomyosis;apoptosis;angiogenesis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.021

R711

A

1671-8348(2017)27-3811-05

2016-12-16

2017-05-14)

蔣靜(1973-)，碩士，副教授，主要從事婦產(chǎn)科疾病的高強(qiáng)度聚集超聲治療。