補(bǔ)陽還五湯含藥血清對肝纖維化小鼠形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1水平的影響

李春旭 費(fèi)洪新 張英博

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

補(bǔ)陽還五湯含藥血清對肝纖維化小鼠形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1水平的影響

李春旭 費(fèi)洪新 張英博

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的探討補(bǔ)陽還五湯含藥血清(SCBHD)對肝纖維化(LF)小鼠形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的影響。方法小鼠隨機(jī)分成對照組，模型組，秋水仙堿組(0.001 g/kg)，SCBHD高、中、低劑量組(37.06、18.53、9.26 g/kg)。采用30% CCl4(1 ml/kg)腹腔注射誘導(dǎo)LF小鼠。SCBHD連續(xù)灌胃小鼠，治療40 d后取材。放射免疫法檢測小鼠血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)和Ⅳ型膠原(CⅣ)水平。HE染色、Masson染色和透射電子顯微鏡(TEM)觀察小鼠肝臟鏡下結(jié)構(gòu)、計算脾、胸腺和肝指數(shù)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定肝組織TGF-β1水平。結(jié)果與模型組比較，SCBHD高、中劑量組小鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ明顯降低(P<0.05)，小鼠LF明顯減輕，脾和胸腺指數(shù)明顯升高伴有肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)，肝TGF-β1含量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論SCBHD能改善小鼠形態(tài)結(jié)構(gòu)，改善脾、胸腺、肝指數(shù)，這與降低小鼠肝TGF-β1表達(dá)有關(guān)。

肝纖維化；補(bǔ)陽還五湯

肝纖維化(LF)是肝硬化、肝癌的早期病理過程，可由多種因素誘發(fā)〔1，2〕。各種原因?qū)е赂谓M織損傷，肝臟內(nèi)肝巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1，引起肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和LF指標(biāo)的改變，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，引起血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)和Ⅳ型膠原(CⅣ)水平上調(diào)〔3〕。目前多采用CCl4誘導(dǎo)建立LF模型〔4〕，課題組前期研究顯示，補(bǔ)陽還五湯(BHD)可以治療阿爾茨海默病(AD)〔5～9〕，BHD有效成分黃芪多糖(APS)對AD的治療效果更好〔10〕。國外數(shù)據(jù)庫顯示BHD調(diào)控細(xì)胞周期〔11〕、改善動脈粥樣硬化〔12〕、抑制肝癌血管生成〔13〕等?，F(xiàn)在BHD研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)移到BHD含藥血清(SCBHD)，如SCBHD降低谷氨酸毒性〔14〕，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等〔15〕。國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報道SCBHD防治LF小鼠的實(shí)驗(yàn)研究，本實(shí)驗(yàn)擬探討SCBHD對LF小鼠形態(tài)學(xué)和TGF-β1的影響。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 BHD由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院周忠光教授購買，田明教授制備成水煎劑，制備成干粉后保存，BHD原藥材包括黃芪120 g(131109)、當(dāng)歸尾6 g(131001)、赤芍4.5 g(121003)、川芎3 g(20140501)、桃仁3 g(20140401)、地龍3 g(121002)、紅花3 g(130901)，組方提純成干粉的提純率為35.82%；秋水仙堿，西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號140808。

1.2動物 雄性、健康、5月齡、C57BL/6小鼠，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)公司，質(zhì)量合格證號：SCXK(京)2012-0001，由李寶龍副主任按照清潔級標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.3試劑 血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ試劑盒，TGF-β1酶聯(lián)免疫試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號：20140401；CCl4和其他試劑均為國產(chǎn)分析純，由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院張英博副教授提供。

1.4儀器 TGL-16G臺式離心機(jī)(上海，安亭科學(xué)儀器廠)，TCNAI-G2透射電子顯微鏡(荷蘭，Pheno公司)，Leica-2135切片機(jī)(德國，Leica公司)，電子天平(沈陽，龍騰電子稱量儀器有限公司)，6100RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國，RT公司)等。

1.5方法

1.5.1SCBHD的制備 BHD原藥材黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、桃仁3 g、地龍3 g、紅花3 g，每份BHD藥材為142.5 g，通過人與小鼠的體表面積進(jìn)行換算得到18.53 g/kg的BHD是小鼠的安全有效劑量，采用18.53 g/kg對C57BL/6小鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)4次灌胃，第1、2次間隔20 h，第2、3次間隔4 h，末次給藥1 h后，獲得C57BL/6小鼠眼球混合血，靜置、分層，3 000 r/min離心10 min，取SCBHD分裝，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2動物分組 取C57BL/6小鼠48只，隨機(jī)分成對照組，模型組，秋水仙堿組，SCBHD高、中、低劑量組，每組8只。

1.5.3復(fù)制LF模型 參考文獻(xiàn)〔4〕誘導(dǎo)LF小鼠模型，用30% CCl4(1 ml/kg，使用橄欖油配制)腹腔注射C57BL/6小鼠，每周對小鼠注射2次，共8 w，通過C57BL/6小鼠尾靜脈采血，檢驗(yàn)小鼠血清學(xué)指標(biāo)，確認(rèn)LF小鼠模型制備成功。對照組采用同樣方法腹腔注射小鼠等量100%橄欖油。

1.5.4給藥方法 對照組、模型組灌胃等量生理鹽水，秋水仙堿組灌胃秋水仙堿0.001 g/kg，SCBHD高、中、低劑量組分別灌胃SCBHD(相當(dāng)于BHD原藥材37.06、18.53、9.26 g/kg)，灌胃40 d。

1.5.5LF指標(biāo) C57BL/6小鼠灌胃結(jié)束后，禁食20 h，采眼球混合血，靜置、分層，TGL-16G臺式離心機(jī)(上海，安亭科學(xué)儀器廠)3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝，保存，采用放射性免疫法檢測血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量。

1.5.6蘇木素-伊紅(HE)染色 C57BL/6小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，水合氯醛麻醉，剪開腹腔，剪開胸腔，暴露心臟，左心室灌注100 ml生理鹽水，沖刷小鼠循環(huán)系統(tǒng)，然后用4%多聚甲醛緩慢、勻速灌注4%多聚甲醛80 ml，直到小鼠的尾巴僵硬為止，取材肝臟，固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)制備石蠟切片和HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝結(jié)構(gòu)。

1.5.7Masson染色 C57BL/6小鼠灌胃結(jié)束后，水合氯醛麻醉，心臟灌注80 ml生理鹽水，沖刷小鼠循環(huán)系統(tǒng)，然后4%多聚甲醛灌注，取材肝，制備石蠟切片，經(jīng)過脫蠟至水，鉻化處理，蒸餾水洗滌，Weigert蘇木精液染核，鹽酸酒精分化，蒸餾水洗滌，Masson 麗春紅酸性品紅液染色，2%冰醋酸水溶液浸洗，1%磷鉬酸水溶液分化，苯胺藍(lán)染色，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡鏡下觀察。

1.5.8透射電子顯微鏡 C57BL/6小鼠灌胃結(jié)束后，禁食20 h，水合氯醛麻醉，心臟灌注80 ml生理鹽水，沖刷小鼠循環(huán)系統(tǒng)，然后2.5%戊二醛灌注，取材肝、2.5%戊二醛和四氧化鋨分別固定、脫水、包埋、切片等，TCNAI-G2透射電子顯微鏡(荷蘭，Pheno公司)觀察肝組織。

1.5.9臟器指數(shù) C57BL/6小鼠灌胃結(jié)束后，斷頭處死各組小鼠，取材脾、胸腺、肝，電子天平(沈陽，龍騰電子稱量儀器有限公司)稱重，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)

1.5.10肝TGF-β1含量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死，剪開腹腔皮膚、腹膜，取材肝組織，勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝，-80℃保存，6100RT-雷杜酶標(biāo)儀(美國，RT公司)上450 nm波長處測定吸光度(A)，繪制TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定肝TGF-β1含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 鏡下可見對照組肝細(xì)胞規(guī)則排列，肝板清晰，肝雙核細(xì)胞較多，肝細(xì)胞質(zhì)豐富；模型組肝雙核細(xì)胞較少，肝板內(nèi)肝細(xì)胞質(zhì)較少；秋水仙堿組，SCBHD高、中、低劑量組肝板較寬，肝細(xì)胞質(zhì)豐富，肝結(jié)構(gòu)不同程度地得到改善，其中高劑量組可以見到圓形規(guī)則的膽小管。見圖1。

2.2Masson染色結(jié)果 鏡下可見對照組肝細(xì)胞規(guī)則排列，膠原纖維較少；模型組肝板較寬，膠原纖維較多；秋水仙堿組，SCBHD高、中、低劑量組肝細(xì)胞之間膠原纖維不同程度地減少，肝板較清晰。見圖2。

2.3透射電子顯微鏡觀察肝組織 鏡下可見對照組肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體未出現(xiàn)腫脹；模型組肝細(xì)胞器較少，線粒體數(shù)量減少，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，出現(xiàn)異?？张荩磺锼蓧A組，SCBHD高、中、低劑量組肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)不同程度地增加。見圖3，圖4。

2.4血清LF指標(biāo)結(jié)果 與對照組比較，模型組血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量明顯升高(P<0.05)，預(yù)示模型組肝組織細(xì)胞外基質(zhì)大量降解，模型穩(wěn)定；與模型組比較，秋水仙堿組，SCBHD高、中劑量組血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ含量明顯降低(P<0.05)，預(yù)示SCBHD減少肝組織細(xì)胞外基質(zhì)大量降解。見表1。

2.5臟器指數(shù) 與對照組比較，模型組LF小鼠脾和胸腺指數(shù)明顯降低伴有肝指數(shù)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組，SCBHD高、中劑量組LF小鼠脾和胸腺指數(shù)明顯升高伴有肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 SCBHD對各組小鼠血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ及臟器指數(shù)的影響

與模型組相比：1)P<0.05

圖1 光學(xué)顯微鏡觀察肝組織(HE染色，× 400)

圖2 光學(xué)顯微鏡觀察肝組織(Masson染色，× 400)

圖3 透射電子顯微鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(透射電子顯微鏡，× 2 550)

圖4 透射電子顯微鏡觀察肝細(xì)胞質(zhì)超微結(jié)構(gòu)(透射電子顯微鏡，× 16 500)

2.6肝組織TGF-β1含量比較 與對照組〔(19.85±3.244)μg/L〕比較，模型組肝組織TGF-β1含量〔(30.053±3.661)μg/L〕明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿〔(21.165±4.106)μg/L〕組，SCBHD高、中劑量組〔(22.145±4.588)、(23.764±4.432)μg/L〕肝組織TGF-β1含量明顯降低(P<0.05)，低劑量組肝組織TGF-β1含量〔(29.131±3.734)μg/L〕無明顯變化(P>0.05)。

3 討 論

本研究表明，SCBHD高、中劑量可改善小鼠肝組織LF程度，減少肝組織ECM，減少肝組織膠原纖維的含量，以此治療LF。

LF伴有肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，模型組肝結(jié)構(gòu)較差；而SCBHD高、中劑量可改善LF小鼠肝組織病變，預(yù)示中藥復(fù)方制劑SCBHD對LF形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定的改善作用。LF伴有免疫功能降低，增強(qiáng)免疫功能是臨床治療LF的一條有效途徑之一，模型組LF小鼠脾、胸腺降低，預(yù)示脾臟產(chǎn)生B細(xì)胞較少，進(jìn)而生成漿細(xì)胞較少，參與機(jī)體體液免疫能力較差，同時伴有胸腺產(chǎn)生T細(xì)胞較少，進(jìn)而參與機(jī)體細(xì)胞免疫能力較差，綜合反映模型組免疫功能降低。SCBHD高、中劑量可增加LF小鼠脾、胸腺指數(shù)，預(yù)示脾臟產(chǎn)生的B細(xì)胞較多，參與機(jī)體體液免疫能力較差，同時伴有胸腺產(chǎn)生T細(xì)胞較多，進(jìn)而參與機(jī)體的細(xì)胞免疫能力較強(qiáng)，綜合反映SCBHD高、中劑量組免疫功能增強(qiáng)。肝指數(shù)結(jié)果顯示，SCBHD高、中劑量可不同程度地減少肝肝代償性增生，避免肝組織損傷，以此增加對肝臟的保護(hù)作用，減輕LF的肝損傷程度。

在LF中，肝巨噬細(xì)胞分泌TGF-β1含量增加，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞大量增殖，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)ECM沉積，最終促進(jìn)肝組織演化為LF。本研究結(jié)果顯示SCBHD高、中劑量組小鼠肝組織TGF-β1含量降低，說明SCBHD高、中劑量可干擾肝組織內(nèi)肝星狀細(xì)胞大量增殖，減少成纖維細(xì)胞生成，減弱小鼠LF程度。本實(shí)驗(yàn)通過對比，肝組織TGF-β1含量降低伴有肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改善，LF指標(biāo)得到改善，免疫功能增強(qiáng)，肝指數(shù)得到部分恢復(fù)，推測SCBHD高、中劑量治療LF機(jī)制與降低肝組織TGF-β1含量水平有關(guān)。

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〔2017-02-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

EffectsofserumcontainingBuyangHuanwuDecoctiononmorphologyandtransforminggrowthfactor-β1ofliverfibrosismice

LIChun-Xu，F(xiàn)EIHong-Xin，ZHANGYing-Bo.

CollegeofPathology，QiqiharMedicalUniversity，Qiqihaer161006,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the effects of serum containing Buyang Huanwu Decoction (SCBHD) on morphology and transforming growth factor-β1(TGF-β1) of liver fibrosis(LF) mice.MethodsMice were randomly divided into control, model, colchicine (colchicine 0.001 g/kg), high-, medial- and low-dose SCBHD group (SCBHD 37.06, 18.53, 9.26 g/kg). LF mice were induced by using intraperitoneal injection of 30% CCl4 (1 ml/kg). The mice were killed after 40 days continuous treating. The radioimmunoassay was used to determine hyaluronic acid (HA), laminin(LN), procollagen Ⅲ (PCⅢ) and Ⅳ collagen(CⅣ) levels in LF mice. After the treatment, all animals were sacrificed，morphology of the liver tissue was observed by HE staining，Masson staining and transmission electron microscopy，and the organ coefficients of splenic，thymus and liver were calculated. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the content of TGF-β1 in the liver tissue.ResultsCompared with the model group, HA, LN, PCⅢ and CⅣ in serum of LF mice significantly were decreased; the liver pathological variations of LF mice were obvious; the organ coefficients of splenic and thymus were significantly increased and organ coefficients of liver were significantly decreased; TGF-β1 in the liver of LF mice were significantly decreased in high-, medial-dose SCBHD groups(allP<0.05).ConclusionsSCBHD could attenuate liver injury in LF mice and organ coefficients of splenic，thymus and liver. The mechanisms possibly contribute to down-regulating expression of TGF-β1 in LF mice.

Liver fibrosis；Buyang Huanwu Decoction

R56

A

1005-9202(2017)19-4693-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81373777，81173599)；黑龍江省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(No.12531788)；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院院內(nèi)科研博士專項(xiàng)基金(No.QY2016B-21)

張英博(1973-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事肝纖維化、腫瘤研究。

李春旭(1965-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事肝纖維化、腫瘤研究。