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    食蟹猴左足三里穴針刺fMRI研究

    2012-08-05 11:17:26武鵬飛孫向東任慶國李傳福
    關(guān)鍵詞:食蟹機(jī)理針灸

    武鵬飛 孫向東 任慶國 李傳福 徐 惠

    (1.泰山醫(yī)學(xué)院,山東泰安 271016;2.泰安市計(jì)量測試所,山東 泰安 271000;3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250012)

    針刺(acupuncture)又稱針灸,是中國的傳統(tǒng)醫(yī) 學(xué),其療效得到普遍肯定,但是其原理卻一直無法以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)徹底闡明。足三里穴是足陽明胃經(jīng)的合穴,是補(bǔ)益要穴,是最常用的治療穴位之一。多年來的研究結(jié)果表明,針刺穴位與神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)有密切聯(lián)系,特別是與大腦特定皮層功能有關(guān)。功能磁共振成像(functional magnetic resonance imaging,fMRI)是建立在血氧水平依賴(BOLD)的基礎(chǔ)上的MRI技術(shù),通過檢測特定刺激引起的局部T2加權(quán)像信號(hào)的變化揭示特定刺激或任務(wù)與相應(yīng)腦組織的解剖與生理關(guān)系。fMRI的應(yīng)用為針刺機(jī)制的探討提供了有利的手段。

    非人靈長類動(dòng)物在結(jié)構(gòu)和生理功能等方面與人類相似,其生理、病理的研究結(jié)果對認(rèn)識(shí)人類生理、病理的發(fā)生機(jī)理等醫(yī)學(xué)研究有重要的參考意義。食蟹猴是較為常用的非人靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。通過針刺食蟹猴左三里穴fMRI的研究,可以探討足三里穴針刺刺激引起的非人靈長類動(dòng)物腦功能活動(dòng),并為病理狀態(tài)下的fMRI研究提供對照。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象

    食蟹猴(macaca fascicularis),屬于靈長目(order Primates)猴科(family Cercopithecidae),獼猴屬(genus Macaca),又名長尾獼猴、爪哇猴。采用食蟹猴6只,均為雄性,4 ~5 歲,體質(zhì)量 4.75 ~5.30 kg,平均4.94 kg。六只猴均營養(yǎng)狀態(tài)良好,精神狀態(tài)正常,無神經(jīng)系統(tǒng)病史,近期無藥物使用史。

    1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

    采用GE Signa Excite 3.0T MR掃描儀(Milwaukee,Wisconsin,USA),梯度場40 mT/m ,梯度切換率150 mT/m/ms。食蟹猴顱腦掃描使用正交膝關(guān)節(jié)線圈,啟用呼吸監(jiān)控。

    1.3 食蟹猴麻醉

    MR檢查前4 h禁食、水。麻醉采用氯胺酮+水合氯醛聯(lián)合麻醉。5%氯胺酮誘導(dǎo)麻醉,劑量5 mg/kg,下肢肌肉注射,10%水合氯醛灌腸維持麻醉,劑量1 ml/kg。

    1.4 針刺fMRI實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    對每只食蟹猴針刺左側(cè)足三里穴(zusanli,ST36)的同時(shí)進(jìn)行功能成像掃描。掃描時(shí),采用相同的周圍環(huán)境,食蟹猴頭周耳旁充填軟墊阻隔聲音,僅留微弱燈光供施針醫(yī)師針刺時(shí)使用。對于每只實(shí)驗(yàn)猴,針刺刺激采用"OFF-ON-OFF"組塊設(shè)計(jì)(圖1),即"靜息-刺激-靜息"設(shè)計(jì)模式。功能成像BOLD序列共采集128phase,其中第1~8phase為靜息狀態(tài)不予實(shí)驗(yàn)氣體氣味刺激;之后以每10phase為一個(gè)組塊,分別予以"刺激 -靜息 -刺激 -靜息",共12個(gè)組塊,采集120phase。每phase采集8層圖像,每次fMRI實(shí)驗(yàn)共采集1024幅圖像。針刺任務(wù)過程包括:刺入-捻轉(zhuǎn)-拔出。靜息狀態(tài)時(shí)銀針不留置體內(nèi)。

    圖1 fMRI"OFF-ON-OFF"組塊設(shè)計(jì)

    1.5 針刺取穴

    選擇左側(cè)足三里穴。針刺過程由同一名有10年針刺經(jīng)驗(yàn)的針灸醫(yī)師完成。取穴時(shí)按照針灸動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的常規(guī),根據(jù)猴與人體型大小比例,在食蟹猴體表選取相同部位。銀針選用0.35mm×40mm標(biāo)準(zhǔn)銀針。食蟹猴麻醉前備皮,用75%醫(yī)用酒精消毒,在清醒狀態(tài)下進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)針刺,觀察動(dòng)物在針刺穴位捻轉(zhuǎn)時(shí)出現(xiàn)與針刺非穴位處不同的抽動(dòng)、不適的表現(xiàn),認(rèn)為得氣,穴位準(zhǔn)確,確定針刺位置并用龍膽紫標(biāo)記定位,正式實(shí)驗(yàn)時(shí)采用相同的穴位位置。針刺手法采用"平補(bǔ)平瀉"法,捻轉(zhuǎn)均勻,提插幅度適中。

    1.6 fMRI掃描參數(shù)

    食蟹猴麻醉后仰臥于檢查床上,頭置于正交膝關(guān)節(jié)線圈內(nèi)正中,聽眥線垂直于床面,頭周圍用軟墊充填以減少磁敏感偽影。

    MRI掃描序列包括液體衰減反轉(zhuǎn)回復(fù)(fluidattenuated inversion recovery,F(xiàn)LAIR)T1WI序列、fMRI-BOLD掃描。FOV均為14 mm。首先使用軸位FLAIR T1WI序列進(jìn)行解剖像掃描,掃描線平行于前后連合連線(AC-PC線),掃描范圍自頂部皮膚至延髓下端,包括全部腦組織。FLAIR T1WI序列參數(shù):TR 2400 ms,TE 9.4 ms,TI 860 ms,ETL 8,Bandwidth:31.25,矩陣320 ×224,NEX 1。掃描層厚2.1 mm,層間隔 0.2 mm。FLAIR T1WI掃描圖像作為fMRI掃描的定位像。fMRI-BOLD掃描采用梯度回波-回波平面成像(gradient echo-echo planar imaging,GRE -EPI)序列,TR 3000 ms,TE 60 ms,F(xiàn)A:90°,矩陣64 ×64,NEX 1,采用壓脂技術(shù),間隔采集。鑒于該設(shè)備限定每次fMRI掃描總層數(shù)不得超過1024層,為得到更多的圖像數(shù)據(jù),將整個(gè)猴腦分為上下兩部分分兩次掃描,每次掃描8層,兩次掃描通過復(fù)制定位像和定位線的方法使掃描層面相延續(xù)。第二次掃描緊接第一次掃描進(jìn)行,以免時(shí)間延遲導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)猴體位變化。fMRI掃描序列的掃描方位、位置、層厚、層間距、層數(shù)、視野等參數(shù)與FLAIR T1WI掃描序列完全一致。每次實(shí)驗(yàn)掃描一半顱腦,8層,128 phase,掃描時(shí)間 6min24s,得到 1024 幅圖像,整個(gè)猴腦共掃描16層,得到2048幅圖像。

    1.7 fMRI數(shù)據(jù)處理

    采用運(yùn)行于Matlab(7.0.1)平臺(tái)的專業(yè)醫(yī)學(xué)圖像處理軟件-統(tǒng)計(jì)參數(shù)圖2(statistical parametric mapping 2,SPM2)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。猴腦fMRI SPM2處理包括以下10個(gè)過程:刪除前8 phase靜息態(tài)采集圖像、轉(zhuǎn)換圖像格式、頭動(dòng)校正、去頭皮、圖像標(biāo)準(zhǔn)化、fMRI設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)調(diào)入、評估、計(jì)算結(jié)果、解剖圖像覆蓋等過程。

    刪除前8 phase靜息態(tài)采集圖像:實(shí)驗(yàn)之初,食蟹猴尚未達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),因此丟棄前8 phase(64幅)靜息態(tài)采集圖像;將同一種實(shí)驗(yàn)的腦上下兩部分圖像按解剖層面、掃描順序合并排序,使用ADCSee軟件將圖像批處理改名,每種功能狀態(tài)的fMRI掃描共得到1920幅圖像。

    轉(zhuǎn)換圖像格式:MRI掃描獲得的圖像數(shù)據(jù)是DICOM格式,需要用MRICro軟件將其轉(zhuǎn)換成SPM可以分析的4D、3D的ANALYZE數(shù)據(jù)格式。

    頭動(dòng)校正:在Matlab程序中載入SPM2軟件,利用SPM2的realign功能進(jìn)行頭動(dòng)校正,實(shí)現(xiàn)頭部圖像對齊。頭動(dòng)校正后觀察校正曲線(圖2),平移(translation)>1/2個(gè)體素或旋轉(zhuǎn)(rotation)>0.5°的圖像認(rèn)為體位移動(dòng)過大,需要丟棄。本實(shí)驗(yàn)全部圖像均為有效圖像。

    圖2 SPM2 realign校正曲線

    去頭皮:因食蟹猴頭皮組織厚、多,影響圖像分析,手工切去食蟹猴功能圖像的頭皮組織。使用MRICro軟件的ROI功能,沿腦實(shí)質(zhì)邊緣,逐層切去頭皮及骨組織。以同樣方式切去食蟹猴模板的頭皮組織,使二者相匹配。

    圖像標(biāo)準(zhǔn)化:圖像標(biāo)準(zhǔn)化是指利用統(tǒng)一的腦圖像模板來標(biāo)準(zhǔn)化不同個(gè)體的腦,使得不同個(gè)體的腦組織功能活動(dòng)情況統(tǒng)一到同一個(gè)腦坐標(biāo)空間中,以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算,得到規(guī)律性的結(jié)果。食蟹猴腦模板采用 Black KJ等[1](Washington University School of Medicine,St.Louis,MO)制作的食蟹猴模板。模板為食蟹猴顱腦軸位T1WI圖像,體素大小為0.5 mm×0.5 mm ×0.5 mm,從頂部皮膚至延髓下方共89層橫斷面。標(biāo)準(zhǔn)化前,將程序默認(rèn)的部分用于成人圖像處理的參數(shù)根據(jù)食蟹猴的實(shí)際進(jìn)行修改。使用SPM2程序的normalize功能進(jìn)行圖像標(biāo)準(zhǔn)化處理。

    fMRI設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)調(diào)入、評估、計(jì)算結(jié)果、解剖圖像覆蓋:在SPM2中,為fMRI刺激設(shè)計(jì)建立模型,調(diào)入圖像數(shù)據(jù)。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    通過SPM軟件,采用隨機(jī)效應(yīng)模式(random effect mode)進(jìn)行組分析(group analysis)。采用單樣本t檢驗(yàn)(one sample t-test)來分析特定任務(wù)刺激下組激活的狀態(tài)。設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,激活區(qū)濾過的標(biāo)準(zhǔn)為<10個(gè)體素。統(tǒng)計(jì)結(jié)果覆蓋于食蟹猴模板圖像上。

    2 結(jié)果

    針刺左側(cè)足三里穴可以觀察到在針刺刺激時(shí),左側(cè)中央前回、右側(cè)中央后回、雙側(cè)島葉、楔前葉、右側(cè)顳葉激活(圖3A),信號(hào)增高,其中,激活最強(qiáng)點(diǎn)位于右側(cè)顳上回(T=6.59),坐標(biāo)(14,-15,2);額葉、頂葉、枕葉、扣帶回散在多數(shù)負(fù)激活點(diǎn),在針刺刺激時(shí)信號(hào)減低(圖3B),其中,激活最強(qiáng)點(diǎn)位于右側(cè)中央前回(T=9.2),坐標(biāo)(18,-5,10)。

    圖3 針刺左側(cè)足三里穴猴腦正激活軸位斷層功能定位像

    圖4 針刺左側(cè)足三里穴猴腦負(fù)激活軸位斷層功能定位像

    3 討論

    3.1 BOLD -fMRI原理

    BOLD-fMRI是依靠血紅蛋白的磁性、根據(jù)MRI對組織磁化高度敏感的特點(diǎn)來研究人腦的功能,特別是大腦各功能區(qū)劃分或定位的無創(chuàng)性檢測技術(shù)。氧合血紅蛋白為逆磁性,脫氧血紅蛋白為順磁性,氧合血紅蛋白的磁敏感特性與一般組織相近,而脫氧血紅蛋白的順磁性會(huì)使局部血管內(nèi)及血管周圍出現(xiàn)非均勻性磁場,導(dǎo)致質(zhì)子的失相位、T2*的縮短以及MR信號(hào)的損失。當(dāng)腦組織中局部神經(jīng)元活動(dòng)時(shí),局部組織內(nèi)血流量及血氧消耗量均增加,但二者增加的比例不同,氧的供應(yīng)量超過代謝的耗氧量,使局部靜脈血氧濃度升高,脫氧血紅蛋白含量降低,體素內(nèi)失相位減少,T2*延長,在T2*加權(quán)像上信號(hào)強(qiáng)度增加。通過數(shù)學(xué)運(yùn)算,將靜息態(tài)的fMRI掃描數(shù)據(jù)與特定刺激狀態(tài)下的fMRI掃描數(shù)據(jù)相比較,MRI信號(hào)有明顯差異的腦組織區(qū)域即可推斷為特定刺激所引起的腦功能變化的區(qū)域,即腦功能區(qū)。fMRI最常用于顯示腦功能區(qū)活動(dòng)時(shí)信號(hào)增加的激活,即正激活,但是也可以顯示在功能區(qū)活動(dòng)時(shí)信號(hào)反而減低的激活,即負(fù)激活。目前,負(fù)激活的原理尚不清晰,可能與功能區(qū)活動(dòng)時(shí)耗氧量增加超過供氧量增加有關(guān)。

    fMRI自20世紀(jì)90年代出現(xiàn)以來,在認(rèn)知科學(xué)研究方面發(fā)揮了巨大的作用。人們利用fMRI做了很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能定位的研究,如:肢體運(yùn)動(dòng)、感覺刺激、情感刺激、學(xué)習(xí)記憶任務(wù)和藥物反應(yīng)實(shí)驗(yàn),都觀測到了特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng),并得出了非常有意義的結(jié)論,為精確了解各種神經(jīng)生理活動(dòng)提供了有價(jià)值的參考。

    3.2 針刺 fMRI

    針灸的實(shí)踐效果是廣為人可的,然而其作用機(jī)理一直未完全揭開。經(jīng)過神經(jīng)生理學(xué)的研究,初步認(rèn)為針灸刺激位于皮膚和肌肉內(nèi)的小的有髓傳入神經(jīng),將沖動(dòng)傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng),產(chǎn)生一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制,包括β2內(nèi)啡肽等物質(zhì)的釋放,阻斷痛覺傳入大腦;另外,針刺作用于中腦兩個(gè)下行系統(tǒng):血清素源性控制系統(tǒng)、腎上腺素源性控制系統(tǒng)來控制痛覺。

    多年來的研究結(jié)果表明,針灸穴位與神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)有密切聯(lián)系,特別是與大腦特定皮層功能有關(guān)。應(yīng)用fMRI可以直觀地檢測到針刺引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)[2-3],為針灸作用機(jī)理的揭示奠定了一定的基礎(chǔ)。1998年Cho ZH[4]等發(fā)表了第1篇有關(guān)針刺視覺相關(guān)穴位fMRI的研究論文,證實(shí)針刺與視覺相關(guān)的特定穴位可引起特異的腦部視覺中樞的激活。尹嶺[5]等利用fMRI方法探討針刺人足三里穴腦功能成像的實(shí)驗(yàn)方法和針灸治療的機(jī)理。Wu MT[6]等利用fMRI驗(yàn)證了針刺合谷穴和人的大腦邊緣系統(tǒng)的抑制相關(guān),支持了針刺鎮(zhèn)痛作用的機(jī)理。Lee JD[7]通過對比大腦中動(dòng)脈閉塞所致偏癱患者針灸治療前后的fMRI研究,觀測到針刺合谷、足三里、曲池等穴位對偏癱患者的血供恢復(fù)有益。Kong J[8]、Li G[9]等利用 fMRI研究手針和電針對正常人腦的激活效應(yīng),發(fā)現(xiàn)電針和手針刺激有不同的腦組織區(qū)域被激活。多數(shù)研究[10-16]發(fā)現(xiàn)針刺不同的穴位時(shí),第二軀體感覺區(qū)及島葉常能觀測到BOLD信號(hào)的增加。部分學(xué)者利用fMRI做動(dòng)物實(shí)驗(yàn),探討針灸的作用機(jī)理。金香蘭[17]等探討了針刺大鼠的fMRI的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法,并且得到針刺大鼠足三里穴引起的部分腦區(qū)MRI信號(hào)增加,顯示了fMRI在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中研究針刺作用機(jī)理的可行性。

    以人和大鼠等小動(dòng)物為對象通過fMRI研究針刺作用的報(bào)道[18-20]已不少,然而,迄今尚無人采用高級(jí)非人靈長類動(dòng)物進(jìn)行針刺fMRI的研究,并借此與人類的針刺fMRI研究相比較,以進(jìn)行針刺機(jī)理的探討。

    足三里穴是足陽明胃經(jīng)的合穴,是補(bǔ)益要穴,是最常用的治療穴位之一,它位于膝關(guān)節(jié)附近,離顱腦較遠(yuǎn),針刺操作不影響顱腦fMRI成像,因此本課題選用足三里穴。

    針刺左側(cè)足三里穴可以觀察到在針刺刺激時(shí),右側(cè)中央后回、左側(cè)中央前回、雙側(cè)島葉、楔前葉、右側(cè)顳葉激活;額葉、頂葉、枕葉、扣帶回散在多數(shù)負(fù)激活點(diǎn)。

    中央后回為軀體感覺區(qū),雖然實(shí)驗(yàn)猴處于麻醉狀態(tài),針刺刺激仍可以引起對側(cè)軀體感覺區(qū)的激活。中央前回主要作為軀體運(yùn)動(dòng)功能區(qū),針刺足三里穴引起同側(cè)的中央前回的激活。雙側(cè)島葉、楔前葉有較密集的激活,推測與針灸的復(fù)雜機(jī)理有密切的關(guān)系。

    針刺左側(cè)足三里穴引起的負(fù)激活在額葉、頂葉、扣帶回較多而散在,說明負(fù)激活的定位性較差,投射關(guān)系分散,引起的效應(yīng)廣泛。針刺足三里穴可觀察到扣帶回的負(fù)激活,扣帶回屬于邊緣系統(tǒng),邊緣系統(tǒng)在內(nèi)臟調(diào)節(jié)、情緒反應(yīng)、疼痛處理、情感認(rèn)知等方面具有重要意義,推測針刺引起的扣帶回的負(fù)激活在針刺機(jī)理及針灸止痛中有重要作用。

    針灸作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要組成部分,許多研究表明了針灸對于神經(jīng)、免疫系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用,因此針灸機(jī)理可能是通過自主神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)、體液免疫調(diào)節(jié)等復(fù)雜的過程來發(fā)揮治療作用的,應(yīng)用fMRI所觀測到的只是其復(fù)雜反應(yīng)過程的一部分,并不能反應(yīng)其全部,針刺時(shí)不同個(gè)體之間的差異可能較大,同一個(gè)體的重復(fù)的針刺也可能反映結(jié)果并不完全相同。

    3.3 麻醉的影響

    本實(shí)驗(yàn)中,為使食蟹猴顱腦位置固定,對食蟹猴進(jìn)行了麻醉。麻醉采用氯胺酮+水合氯醛聯(lián)合麻醉的方法。氯胺酮是一具有鎮(zhèn)痛作用的全麻藥??蛇x擇性抑制丘腦內(nèi)側(cè)核,阻滯脊髓網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)束的上行傳導(dǎo),興奮邊緣系統(tǒng)。氯胺酮起效快,蘇醒迅速。水合氯醛是催眠和抗驚厥藥,催眠作用溫和,引起近似生理性睡眠,不縮短REMS睡眠時(shí)間,無明顯后遺作用。上消化道或直腸給藥均能迅速吸收,1小時(shí)達(dá)高峰,維持4~8小時(shí)。

    麻醉劑影響到神經(jīng)系統(tǒng)的功能和化學(xué)遞質(zhì)的釋放,可能部分影響fMRI的結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)研究的是在氯胺酮和水合氯醛聯(lián)合麻醉下的針刺刺激的fMRI成像。

    3.4 本研究結(jié)果表明,可以在臨床使用的MRI設(shè)備上對非人靈長類動(dòng)物進(jìn)行腦fMRI的研究。在麻醉狀態(tài)下,針刺食蟹猴左側(cè)足三里穴,fMRI可以顯示不同腦組織區(qū)域的正激活和負(fù)激活。從正激活方面來看,針刺的作用機(jī)理可能與中央前回、島葉及顳上回有較密切關(guān)系。針刺足三里穴引起的負(fù)激活定位性較差,投射關(guān)系分散,引起的效應(yīng)廣泛??蹘Щ氐呢?fù)激活在針刺機(jī)理及針灸止痛中可能有重要作用。

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