Runx2 通過抑制細胞巨自噬以誘導C2C12 細胞向成骨細胞分化*

余守和， 洪 岸

(基因工程藥物國家工程研究中心，教育部基因組藥物工程研究中心，廣東省生物工程藥物重點實驗室，暨南大學生命科學技術學院生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州510632)

Runx2(又稱Cbfa1、AML3 或PEBPa2A)是調(diào)節(jié)成骨分化及骨發(fā)育的關鍵因子，由Runt 結構域介導與順式原件OSE2(5'-TGTGGT-3')結合啟動靶基因轉錄［1］。Runx2 缺陷型的純合體小鼠缺乏骨骼礦化的能力，產(chǎn)后立即死亡;雜合體可存活，但骨骼系統(tǒng)存在缺陷［2］。Runx2 過表達的轉基因小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的癥狀［3］?？梢奟unx2 在骨發(fā)育過程中的重要作用。

細胞巨自噬(macroautophagy，后稱之為自噬)是互補于泛素-蛋白酶體的另外一種胞內(nèi)蛋白降解途徑，具有進化保守性［4］，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要因素。細胞自噬的順利進行依賴于胞內(nèi)一種囊泡的形成，即自噬體(autophagosome)。在自噬體中包被有受損的細胞器，錯誤折疊的蛋白，或蛋白聚集體等，它通過與溶酶體(lysosome)融合形成自噬溶酶體(autolysosome)以降解這些包被物［5-6］。自噬具有高度選擇性，這依賴于貨物受體(cargo receptor)與包被物的識別與結合，如Nbr1 與p62［7］。在生理條件下，細胞存在基礎水平的自噬，這種自噬具有維持細胞正常功能的作用［8］。在環(huán)境脅迫時自噬會被誘導增強，這種自噬則有抵御脅迫，延長細胞生存期，增強其活力的作用［9］。自噬可參與眾多生理過程的調(diào)節(jié)，如神經(jīng)退行性疾病發(fā)生，腫瘤形成，病原體感染及衰老等。目前發(fā)現(xiàn)自噬對機體骨形成及骨骼發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用［10］，但相關分子機制并不清楚。

在本研究中，我們利用已有的單因子誘導成骨分化模型C2C12/Runx2Dox［11］解析Runx2 調(diào)控成骨分化與自噬的關聯(lián)性。研究發(fā)現(xiàn)在誘導C2C12 細胞分化為成骨細胞過程中，Runx2 可抑制與自噬體形成密切相關基因微管相關蛋白1 輕鏈3b(microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，LC3b)及Beclin-1 表達，并可抑制LC3-I 向LC3-II 的轉換。抑制自噬可增強Runx2 誘導的成骨分化，而激活自噬則具有抑制作用。據(jù)此我們認為Runx2 通過阻斷自噬過程以誘導C2C12 細胞向成骨分化。

材 料 和 方 法

1 細胞與試劑

1.1 細胞 C2C12/Runx2Dox細胞是利用Tet-On Advanced 基因表達系統(tǒng)在小鼠成肌細胞C2C12 中建立的由Dox 調(diào)節(jié)Runx2 表達的單因子誘導成骨分化模型，為本實驗室自己構建。

1.2 試劑 Trizol reagent 與G418 購自Invitrogen;Tet-On System 專用胎牛血清與強力霉素(doxycycline，Dox)購自Clontech;潮霉素(hygromycin，Hyg)購自Merck;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自Santa Cruz;雷帕霉素(rapamycin，Rap)購自Sigma;LC3 抗體購自Novus;β-actin 抗體及相關II 抗購自Cell Signaling;ECL 化學發(fā)光顯色試劑盒購自Pierce;BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒，WB/IP 細胞裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天公司;RNA 逆轉錄及實時定量PCR 所用試劑均購自寶生物工程公司;柯達膠片購自廣州威佳;其它所用試劑及引物均購自上海生工。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用含有10% Tet-On System 專用胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)C2C12/Runx2Dox細胞，并加入500 mg/L Hyg 與800 mg/L G418，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，隔日換液1 次，細胞經(jīng)傳代和收獲，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。為分析Runx2 誘導C2C12 細胞向成骨分化與自噬的關系，在培養(yǎng)液中加入Dox (10 mg/L)分別培養(yǎng)0 d、1 d、3 d 及6 d 后收RNA 與蛋白樣品進行相應分析。

2.2 總RNA 抽提 細胞培養(yǎng)好后用PBS 洗2 遍，并加入適量Trizol 試劑室溫充分裂解10 min，后收集于1.5 mL Eppendorf 管中。每管樣品加入1/5 倍體積的氯仿，劇烈振蕩混勻30 s，室溫靜止10 min，4℃下12 000 r/min 離心15 min。取上清液至新的Eppendorf 管，加等體積異丙醇，-20 ℃靜置15 min。4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，棄上清，DEPC 水配制的75%乙醇0.5 mL 洗滌沉淀1 次，12 000 r/min 離心10 min。棄上清，空氣干燥10 min，加50 μL DEPC 水溶解RNA 沉淀，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 逆轉錄PCR ( reverse transcription PCR) 取1 μg 總RNA 并加入DEPC 水到總體積為12 μL，65 ℃保溫5 min 使RNA 變性。隨后立即冰上冷卻，以防RNA 復性。在該PCR 管中分別加入0.5 μL 隨機引物，Oligo dT 引物，RNase inhibitor，逆轉錄酶MMLV，2 μL 10 μmol/L dNTP，4 μL 5 ×buffer，將上述20 μL 反應溶液30 ℃保溫10 min，42 ℃保溫60 min，72 ℃保溫10 min，最終逆轉為所需的cDNA。

2.4 實時定量PCR( real-time quantitative PCR) 采用SYBR Green PCR Master Mix 試劑，在基因公司的擴增儀上進行反應，PCR 反應體系為:cDNA 1 μL，基因上、下游10 μmol/L 引物各0.8 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，加H2O 補至20 μL。同時按照相同方式準備檢測內(nèi)參表達水平的反應液。每個樣品設3 個復孔。反應條件為:95 ℃10 s 預變性，95 ℃5 s，60 ℃30 s，72 ℃15 s，40 個循環(huán)。操作步驟按照說明書進行。反應結束后，使用系統(tǒng)軟件分析PCR 過程各檢測樣本的Ct (threshold cycle)值。由熔解曲線判斷PCR 反應的特異性，用基于2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。檢測分析時所用內(nèi)參照是18S rRNA。所用PCR 引物都由上海生工合成，見表1。

表1 實時定量PCR 檢測所用引物的序列Table 1. The sequences of the primers used for real-time qPCR detection

2.5 Western blotting 檢測LC3-I 向LC3-II 的轉換情況 按照碧云天WB/IP 細胞裂解液配送的蛋白提取說明書抽提總蛋白，并用BCA 蛋白定量試劑盒分析抽提蛋白濃度。采用15% 膠上樣40 mg 總蛋白進行聚丙烯酰氨凝膠電泳，并在4 ℃條件下轉至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，4 ℃Ⅰ抗孵育過夜，洗滌后Ⅱ抗室溫孵育1 h。再次洗滌后使用ECL 化學發(fā)光顯色試劑盒顯影，膠片(柯達)曝光。

2.6 堿性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP) 染色

將培養(yǎng)好的細胞用PBS 洗3 次以去除培養(yǎng)基，而后用95%乙醇固定細胞10 min，晾干，依照碧云天的BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒所提供的相應操作步驟進行染色分析，并晾干拍照。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間有顯著差異者用LSD-t 檢驗進行兩兩比較，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Runx2 誘導C2C12 細胞向成骨細胞分化時可下調(diào)LC3b 及Beclin-1 表達

用Dox (10 mg/L)處理C2C12/Runx2Dox細胞0 d、1 d、3 d 及6 d 后進行real-time qPCR 分析，首先檢測了Runx2 及成骨分化標記基因ALP 及OC 的表達情況(圖1A)，結果發(fā)現(xiàn)三者的表達水平明顯上調(diào)的，說明誘導分化模型的可靠性。在此基礎上我們進一 步 分 析 了 LC3b、Beclin-1、SQSTM1/p62 和LAMP-2 的表達，結果發(fā)現(xiàn)Runx2 可明顯下調(diào)LC3b(圖1B)與Beclin-1(圖1C)表達水平，特別是自噬體標記基因LC3b，但對SQSTM1/p62 與LAMP-2 無明顯影響(未提供數(shù)據(jù))。此結果說明，Runx2 誘導C2C12 細胞向成骨分化與自噬過程存在關聯(lián)性。

2 Runx2 誘導C2C12 細胞向成骨細胞分化時可抑制LC3-I 向LC3-II 的轉換

Western blotting 檢測結果表明，隨著誘導時間延長，Runx2 的表達持續(xù)增加，在誘導6 d 時達最高水平(圖2A 與2B)。同時發(fā)現(xiàn)Runx2 表達對LC3-I 向LC3-II 轉換具有明顯抑制作用，且這種抑制作用具有明顯的誘導時間依賴性(圖2C)。在Dox 處理3 d后，抑制效果就很明顯(圖2C)。LC3-II 的灰度掃描結果也說明了這一點(圖2D)。此結果說明，Runx2誘導C2C12 細胞向成骨分化時可抑制自噬體形成，阻滯自噬流。

3 抑制自噬可促進Runx2 誘導的成骨分化進程

用0、1、3、5、10 及20 mmol/L 的3-MA 預處理細胞1 h，隨后加入Dox (10 mg/L)誘導14 d 后進行ALP 活性分析。結果表明，與Dox 處理樣品相比，在使用低濃度3-MA 時(1、3 及5 mmol/L)，ALP 活性隨著處理濃度增加而增加;在使用高濃度時(10 與20 mmol/L)，ALP 活性隨著處理濃度增加而降低(圖3A)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，低濃度的3-MA 對細胞沒有明顯毒性，但高濃度會導致細胞大量死亡(圖3B)，這說明3-MA 高濃度所產(chǎn)生的ALP 活性降低現(xiàn)象是由于細胞數(shù)量減少導致的，揭示3-MA 增強ALP 活性的作用具有低濃度依賴性。此外，我們又用3-MA(5 mmol/L)分別處理細胞1 d、3 d 及6 d 后利用real-time qPCR 分析ALP 及OC 表達情況，結果發(fā)現(xiàn)3-MA 處理可明顯促進二者表達(圖3C 與3D)。此外，3-MA 處理對自噬相關基因的表達無明顯影響(未提供數(shù)據(jù))。以上研究結果說明，抑制自噬可增強Runx2 誘導C2C12 細胞分化為成骨細胞的能力。

4 激活自噬可抑制Runx2 誘導的成骨分化進程

Figure 1. The expression levels of LC3b and Beclin-1 were down-regulated during Runx2-induced osteogenic differentiation of C2C12 cells. C2C12/Runx2Dox cells were treated with Dox (10 mg/L)for the times indicated.The mRNA levels of ALP (A)，OC(A)，Runx2(A)，LC3b (B)，and Beclin-1(C)were detected by real-time qPCR and normalized to 18S rRNA. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs untreated sample (0 d).圖1 Runx2 在誘導C2C12 細胞向成骨分化時下調(diào)LC3b 與Beclin-1 表達

Figure 2. The conversion of LC3-I into LC3-II was inhibited during Runx2-induced osteogenic differentiations of C2C12 cells. C2C12/Runx2Dox cells were treated with Dox (10 mg/L)for the times indicated. The protein levels of Flag-Runx2(A)and LC3(B)were detected by Western blotting. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs untreated sample (0 d).圖2 Runx2 誘導C2C12 細胞向成骨分化過程中抑制LC3-I 向LC3-II 的轉換

Figure 3. The Runx2-induced osteogenic differentiation of C2C12 cells was promoted by 3-MA treatment. A:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with the indicated concentrations of 3-MA for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of 3-MA for 14 d. The ALP activity was determined by ALP staining. B:Representative phase-contrast micrographs showing C2C12/Runx2Dox cells after 14 d of treatment with Dox or 3-MA (×100). C，D:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with 3-MA (5 mmol/L)for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of 3-MA for the time indicated. The mRNA levels of ALP and OC were detected by real-time qPCR and normalized to 18S rRNA.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Dox-treated sample at each time point.圖3 3-MA 處理可促進Runx2 誘導的C2C12 細胞向成骨分化進程

分別用0、0.05、0.1、1、5 和10 μmol/L 的Rap 預處理細胞1 h，隨后用Dox(10 mg/L)處理14 d 后進行ALP 活性分析。結果發(fā)現(xiàn)，與Dox 處理樣品相比，Rap 處理具有抑制ALP 活性的作用，且這種抑制作用具有濃度依賴性，在10 μmol/L 時Rap 具有顯著的抑制效果(圖4A)，且對細胞無明顯毒性。此外，我們用Rap (10 μmol/L)分別處理細胞1 d、3 d 及6 d 后利用real-time qPCR 分析ALP 及OC 表達情況，結果發(fā)現(xiàn)Rap 處理可明顯抑制二者表達(圖4B 與4C)。此外我們也證實Rap 處理對自噬相關基因的表達無明顯調(diào)節(jié)作用(未提供數(shù)據(jù))。以上研究結果說明，激活自噬可減弱Runx2 誘導C2C12 細胞分化為成骨細胞的能力。

討 論

在本研究中，我們利用單因子誘導分化模型C2C12/Runx2Dox分析Runx2 誘導成骨分化與自噬的關系。通過分析自噬體形成標志LC3-I/LC3-II 比值，揭示了Runx2 誘導成骨分化與自噬之間存在負相關關系。通過聯(lián)合使用自噬抑制劑3-MA 及自噬激活劑Rap，進一步確認了二者之間的負相關關系。由此我們認為Runx2 通過抑制自噬體形成，阻滯自噬流，進而誘導C2C12 細胞分化為成骨細胞。

Figure 4. The Runx2-induced osteogenic differentiations of C2C12 cells was inhibited by Rap treatment. A:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with the indicated concentrations of Rap for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of Rap for 14 d. The ALP activity was determined by ALP staining. B，C:C2C12/Runx2Dox cells were pretreated with Rap (10 μmol/L)for 1 h. The cells were then treated with Dox (10 mg/L)in the presence of Rap for the time indicated. The mRNA levels of ALP and OC were detected by real-time qPCR and normalized to 18S rRNA. Mean ±SD.n =3.* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs Dox-treated sample at each time point.圖4 Rap 處理可抑制Runx2 誘導的C2C12 細胞向成骨分化進程

一般來說，自噬可分為5 步，即誘導自噬，貨物分子的識別與選擇，自噬體的形成，自噬體與溶酶體的融合，貨物分子的降解。在誘導C2C12細胞向成骨分化時，Runx2 可能會對自噬的某些步驟進行調(diào)節(jié)。在分析Runx2 誘導分化與自噬相關性時，我們首先在基因水平解析了Runx2 與自噬相關基因LC3b與Beclin-1 之間的表達負相關關系(圖1B 與1C)。為進一步明晰Runx2 與自噬的關系，我們又在蛋白水平分析了LC3-I 向LC3-II 的轉換情況，并證實Runx2 可顯著抑制LC3-II 的形成(圖2C)。由于LC3-II 是參與自噬體膜形成的重要組分［12］，其生成被抑制就會導致自噬體不能正常形成，自噬流被阻滯，可見Runx2 具有阻滯自噬流的作用。由于LC3-II 可以與自噬貨物受體分子p62 結合，在自噬體與溶酶體融合后被降解掉，因此除通過分析LC3-II 水平分析自噬流外，檢測p62 在蛋白水平的表達情況也是評估自噬流的一種方法［13］，這也提示我們p62表達水平發(fā)生變化可能是在蛋白水平，而不是基因水平。LAMP-2 是溶酶體的一種駐留蛋白，位于溶酶體膜上，負責調(diào)節(jié)自噬體與溶酶體的融合，缺失可導致融合受阻［14］。本研究發(fā)現(xiàn)在基因水平，Runx2 對LAMP-2 表達無明顯影響，這說明Runx2 對自噬的阻滯應該不是通過影響后期融合過程實現(xiàn)的。依據(jù)上述分析，我們初步推斷Runx2 對自噬的影響可能是在自噬體形成階段。

自噬體這種具有生物膜的囊泡結構的形成是被自噬相關蛋白(autophagy-related proteins)調(diào)節(jié)的［15］，這也是自噬過程中最復雜的一個步驟。自噬體形成的雙層膜是新生膜，其形成的基礎是吞噬泡(phagophore)膜。Phagophore 膜有眾多來源，可來自線粒體，高爾基體或是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［16］，新生膜就是在這些來源膜的基礎上延展而來。延展過程首先依賴于PtdIns3K(class III phosphatidylinositol 3-kinase)復合體的形成，該復合體的激酶活性可被3-MA 靶向抑制，因此當我們用3-MA(5 mmol/L)處理細胞后發(fā)現(xiàn)ALP 活性明顯增加(圖3A)，這說明自噬體形成被抑制，自噬過程被阻滯后，Runx2 促C2C12 細胞向成骨分化能力增強了。此外，該復合體中有一個重要組分是Atg6/Beclin-1 在分化過程中，Runx2 可抑制該因子表達(圖1C)，這說明Runx2 阻滯自噬過程的一種方式是通過下調(diào)Beclin-1 表達以抑制PtdIns3K 激酶復合體的形成。新生膜在延展時，需要征募磷脂酰乙醇胺修飾的LC3 (LC3-II)至phagophore 膜上［12］，這個過程對新生膜的形成是必須的。目前在分析胞內(nèi)自噬體數(shù)量及自噬流強度時，都采用評估LC3-I/LC3-II 比 值 的 方法［17］。LC3-II 水 平 越 高，LC3-I/LC3-II 比值就越低，說明自噬體越多，胞內(nèi)自噬流越強。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Runx2 除抑制LC3b 轉錄外(圖1B)，還對LC3-I 向LC3-II 的轉換過程進行負調(diào)控(圖2C)，最終阻滯新生膜的延展與自噬體的形成。綜上可見，Runx2 一方面通過下調(diào)Beclin-1 表達的方式阻滯PtdIns3K 激酶復合體形成，導致起始phagophore 膜的組裝受到影響，另一方面通過下調(diào)LC3-II 的水平，影響phagophore 膜的延展及新生膜的形成，最終通過抑制自噬體形成的方式阻滯自噬流，從而促進C2C12 細胞分化為成骨細胞。

自噬相關基因在轉錄水平上被調(diào)節(jié)是屬于自噬的轉錄調(diào)節(jié)機制范疇，此外一些信號途徑對自噬過程也有重要調(diào)節(jié)作用［15］。我們熟知的與自噬密切相關的就是雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)途徑。細胞在處于脅迫條件下，如營養(yǎng)缺乏、缺氧、或是被病原體感染，會使該途徑失活，從而誘發(fā)自噬過程以抵御環(huán)境脅迫，維持生存需求。Rap 是該途徑的特異性抑制劑。在本研究中，為提供自噬具有抑制Runx2 誘導C2C12 細胞向成骨分化的正向證據(jù)，我們用Rap(10 μmol/L)處理后發(fā)現(xiàn)ALP 活性顯著降低(圖4A)，這說明mTOR 途徑與Runx2 誘導成骨分化的負相關關系。因此在后續(xù)研究中有必要分析在Runx2 誘導成骨分化過程中mTOR 途徑的狀態(tài)。

Runx2 是成骨分化、骨形成與骨骼發(fā)育的關鍵調(diào)節(jié)因子。Runx2 功能異常會引發(fā)一些遺傳性疾病，如鎖骨顱骨發(fā)育不全(cleidocranial dysplasia，CDD)綜合征。依據(jù)我們的研究成果可初步推斷，這些相關疾病的發(fā)生發(fā)展可能與自噬過程異常有一定的關聯(lián)性。因此，該研究成果可能會為這些臨床疾病的治療提供一個全新的思路。

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