基于HPLC-MS/MS Q-TOF 分析糖尿病腎病維持性血透患者含糖透析的代謝特征*

徐 丹， 孟 宇， 胡 波， 馮艷艷， 尹良紅

(暨南大學附屬第一醫(yī)院腎內科，廣東 廣州510630)

我國糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發(fā)展至終末期腎功能衰竭的人數(shù)逐漸增加［1］，DN 維持性血透(maintenance hemodialysis，MHD)患者約為總血透人數(shù)的36.39%［2］。使用無糖透析液血液透析過程中，DN 患者低血壓、低血糖等并發(fā)癥發(fā)生率較高，影響透析質量，目前研究發(fā)現(xiàn)使用含糖透析液明顯減少這些并發(fā)癥的發(fā)生［3-4］，然而含糖透析對患者機體代謝的影響尚未明確。代謝組學是研究生物體系受外部刺激而產生的所有代謝產物的變化及其動態(tài)變化的規(guī)律［5］，可用于探索含糖透析的代謝特征。本研究采用高效液相色譜－四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀(high-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-MS/MS QTOF)，其具有分析速度快、靈敏度及分辨率高、質量范圍寬的特點，有助于在分析血清樣本全體代謝物，初步研究單次含糖透析的代謝特征。

材 料 和 方 法

1 研究對象

根據納入及排除標準選擇在我院門診MHD 患者10 例，原發(fā)病均為2 型糖尿病、糖尿病腎病，采用自身對照研究，形成無糖透析組(glucose-added dialysate group，G－組)和含糖透析組(glucose-free dialysate group，G+組)，另在我院體檢中心隨機選取10例健康人形成健康對照組(healthy control group，H組)。MHD 患者血液透析前不使用胰島素。

1.1 納入標準 (1)符合ESRD 的診斷標準，內生肌酐清除率≤10 mL/min;(2)年齡＞18 歲，規(guī)律透析3 個月以上，每周3 次，每次4 h;(3)2 周內沒有使用除胰島素以外的影響血糖的藥物及任何調脂藥物，取血前2 d 空腹血糖及餐后2 h 血糖分別控制在7.77 mmol/L 與11.10 mmol/L 以內。實驗前均使用無糖透析液血透。

1.2 排除標準 (1)研究進行時的現(xiàn)癥感染患者;(2)1 個月內有嚴重心力衰竭、心肌梗死等心血管合并癥，及嚴重貧血、心力衰竭、出血傾向，急性腦血管意外、肝功異常、肝硬化等疾病患者;(3)血透中發(fā)生低血糖或低血壓患者退出本研究，低血糖的診斷標準:血糖＜3.9 mmol/L(據2010 中國糖尿病指南);低血壓的診斷標準:收縮壓＜90 mmHg(1 mmHg =0.133 kPa);(4)不愿簽署知情同意書患者。

2 血液透析方法

采用德國費森尤斯4008S 透析機，聚風膜中空纖維透析器，膜面積為1.6 m2，超濾系數(shù)6.4 mL·h－1·mmHg－1。G－組采用廣州康盛生物科技有限公司提供無糖碳酸氫鹽透析液，其成分為:鈉離子135.0 mmol/L，鉀離子2. 0 mmol/L，鈣離子1. 25 mmol/L，鎂離子1.0 mmol/L，氯離子108.6 mmol/L，醋酸鹽6.0 mmol/L，碳酸氫鹽30.0 mmol/L，含糖透析液由相同廠家提供，葡萄糖濃度為5.5 mmol/L，余成分同無糖透析液。透析時間4 h，血流速200 ～230 mL/min，透析液流速500 mL/min、溫度37 ℃，超濾量＜干體重×5%，全身肝素化抗凝，首劑20 mg，6 mg/h 持續(xù)泵入，透析結束前30 min 停止泵入。

3 樣本采集及制備

受試者樣本均在空腹8 h 以上并于晨間7:30 食用統(tǒng)一標準餐后30 min 采集，MHD 受試者無菌采集血液透析前、后周圍靜脈血5 mL，健康對照組與MHD 患者采血間隔一致，作為血液透析前、后健康對照，采血間期均不進食。靜脈血注入促凝采血管內，常溫下靜置15 min 后3 000 r/min 離心5 min，取上清液置于EP 管中儲存于－80 ℃的冰箱內待測。檢測時，樣本于室溫下解凍，取100 μL 樣本加入無水甲醇300 μL 置于1.5 mL EP 管漩渦混勻，13 200 r/min 離心5 min，取上清液作為檢測血清樣本。

4 儀器與條件

4.1 色譜條件 美國Agilent 1200 系列高效液相色譜儀(Agilent 1200 HPLC):ZORBAX SB-C18 柱(150 mm ×2.1 mm，內徑1.8 μm)，柱溫25 ℃;進樣量20 μL，流速0.25 mL/min。流動相:A 為甲醇(色譜醇，J ＆ K Chemica)，B 為純凈水;梯度洗脫:1 ～5 min，A∶B 為50∶50;6 ～35 min，A∶B 為95∶5。

4.2 質譜條件 Bruker 公司microTOF-QⅡ質譜儀，電噴霧離子源(ESI)，正離子電離模式，TOF 離子飛行方式采用V 模式，帽電壓－500 V，毛細管電壓3 500 V，霧化器壓力0.6 bar，干燥氣流速6.0 L/min，干燥氣溫度180 ℃，全程掃描質譜分析時碰撞電壓7 eV，離子化電壓5 eV，采集速度為0.1s，校正溶液進樣速度100 μs/min，校正頻率為5 s，四極桿掃描范圍質荷比(mass charge ratio，M/Z)50 ～1 000;二級質譜分析時碰撞電壓10 ～40 eV 不等。

5 數(shù)據處理及統(tǒng)計學處理

采用Markerlynx 軟件對原始數(shù)據進行峰檢測和匹配，利用SIMCA-P 12.0 軟件將全部樣本的質譜數(shù)據導出，以M/Z、保留時間(retention time，RT)和峰強度(intensity)為數(shù)據，使用SIMCA-P 12.0 自帶程序進行正交信號校正(orthogonal signal correction，OSC)，其中的組別變量為Y 變量，并用主成分分析(principal component analysis，PCA)和OSC-偏最小二乘判別分析(partial least square discriminate analysis，PLS-DA)來分析數(shù)據。數(shù)據以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0 軟件完成，采用獨立或配對樣本t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。本實驗使用METLIN Database 查詢相關可能候選物信息(http://metlin. scripps. edu/metaba_search_alt2.php)。

結 果

1 研究對象一般情況

血液透析后患者血糖G－組和G+組有顯著差異，G+組高于G－組，超濾量、空腹、血液透析前血糖等指標無顯著差異。H 組與MHD 組在年齡、性別等方面無顯著差異，而血紅蛋白和血糖有顯著差異，見表1。

表1 研究對象一般情況Table 1. General characteristics of the subjects (mean±SD.n=10)

2 代謝組學結果與分析

2.1 G－組、G+組和H 組的TIC 圖 血清樣品經LC-MS/MS Q-TOF 分析，代表性單個總離子流圖(total ion chromatograms，TIC)顯示血液透析前G－組和G+組血清樣本色譜峰總離子流在28 ～35 min 段有差異，說明血液透析前G－組和G+組部分代謝物可能存在差異;血液透析后G－組與G+組、H 組與血液透析前、后MHD 組血清樣本色譜峰總離子流在同一保留時間色譜峰大小、高低表達有差異，說明血液透析后G－組和G+組代謝物存在差異，H 組與血液透析前、后MHD 組代謝物均存在差異，見圖1。

2.2 G－組、G+組和H 組的PCA 分析 用SIMCA-P 12.0 軟件對數(shù)據進行Pareto 縮放，將信號強度相對總強度進行歸一化處理后進行PCA。各樣品在第一主成分與第二主成分構成的平面上的投影得分圖即PCA 得分圖能夠直觀反映樣品間的相似或差異性［4］。由圖2、3 可見，PCA 模型可將血液透析前、血液透析后MHD 組與H 組樣本完全區(qū)分，即MHD 患者與研究中健康人代謝狀態(tài)不同。圖2 中，G+組與G－組血清樣本血液透析前分布較一致，即2 組透析前代謝狀態(tài)無明顯差異，具有可比性;圖3 中，模型雖然不能有效區(qū)分血液透析后G+組與G－組，但G－組血液透析后組內代謝狀態(tài)差異大。

Figure 1. TIC of the 3 groups.A:G － group before hemodialysis;B:G + group before hemodialysis;C:H group one hour after meals;D:G － group after hemodialysis;E:G + group after hemodialysis.圖1 3 組的TIC 圖

Figure 2. PCA score plot of the 3 groups before the hemodialysis.圖2 血液透析前3 組樣本的PCA 得分圖

Figure 3. PCA score plot of the 3 groups after the hemodialysis.圖3 血液透析后3 組樣本的PCA 得分圖

3 血液透析后G－組和G+組的OSC-PLS-DA 分析

PCA 模型示H 組與MHD 組患者代謝狀態(tài)差異明顯，且不能排除透析因素影響，本研究進一步對比分析未納入H 組患者血清樣本。為了減少除透析液因素外，血透患者的個體差異對分析結果的正確性影響，采用OSC 對數(shù)據濾噪，保留有效的數(shù)據信息，提高模型的效力和說明能力。OSC 后建立OSC-PLSDA 模型，R2X =0.395，R2Y =0.947，Q2 =0.918。圖4、5 分別為透析后G－組和G+組的OSC-PLS-DA得分圖(圖4)和載荷圖(圖5)。與圖3 相比，圖4 中血液透析后G－組、G+組血清樣本完全區(qū)分開，可見其代謝物狀態(tài)存在差異，亦表明OSC-PLS-DA 比PCA 具有更好的分類能力。圖5 表示樣本中檢測到的代謝物的分布，距離原點越遠，對分離貢獻越大，可能是差異代謝物。

4 血液透析后G－組和G+組差異代謝物鑒定

本研究質譜數(shù)據主要經過去噪音、質譜峰提取、反卷積處理、峰排列、對齊、合并、縫隙填補處理、數(shù)據導出等過程處理海量實驗數(shù)據，以避免潛在標志物篩選受到干擾。VIP 值可以量化OSC-PLS-DA 載荷圖上每個變量對分類的貢獻。VIP 值越大變量在不同類間的區(qū)別最顯著。對VIP ＞3 的變量進行配對樣本t 檢驗，將t 檢驗中P ＜0.05 的變量作為主要差異性代謝物，再根據M/Z 在參考文獻及METLIN代謝物數(shù)據庫中查詢，并與二級質譜數(shù)據進行比對從而確定差異代謝物分子式及名稱(詳見表2)。具體過程如下:以RT 28.25 min、M/Z 為377.0305 的目標代謝物為例，據分析物電噴霧正離子模式加H的機理，目標代謝物［M+H］+代謝物離子的M/Z 為377.0305，據RT 為28.25 min 的質譜圖(圖6A)，離子代謝物［2M +H］+(M/Z 655.6008)、［M +Na］+(M/Z 394.0316)和［M-2H］－(M/Z 331.2276)可能來源于同一目標代謝物。以代謝物離子［M +H］+(M/Z 377.0305)為母離子，進行二級質譜掃描，同時優(yōu)化碰撞能量，選擇豐度較高的2 種碎片離子作為定性與定量特征離子，最大程度提高檢測的靈敏度。其二級質譜分析得到［M-2H］－(M/Z 331.2276)及［MH］－(M/Z 44.9882)豐度最高(圖6B)，在METLIN Database 搜索與［M+H］+(M/Z 377.0305)相匹配的代謝物，并與其二級質譜進行分析對比，推斷出此代謝物為石膽酸，分子量為376.2977，分子式見圖6C。以此類推，得出其余4 種物質的分子量和分子式。

討 論

本實驗利用HPLC-MS/MS Q-TOF 分析單次使用含糖透析液與無糖透析液DN 維持性血液透析后患者血清代謝物差異，最終得到G+組氫化可的松、石膽酸和天冬氨酸較G－組含量低，而N-甲基煙酰胺和二羥基前列腺素F 較G－組含量高。

氫化可的松作為內源性糖皮質激素的一種，通過促進肝臟糖異生、脂肪細胞及肌肉組織對葡萄糖攝取和利用，升高血糖。同時還增強生長激素、胰高糖素等其它升糖激素的作用。4 h 無糖透析，患者丟失20 ～40 g 葡萄糖，造成人為饑餓狀態(tài)，血糖降低，為維持血糖穩(wěn)定，糖皮質激素升高，G－組氫化可的松水平較高也與機體這一生理過程相符。石膽酸通過激活糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase，GP)和分解糖原［6］，也有維持血糖穩(wěn)定的作用。G+組氫化可的松、石膽酸水平較低，提示使用含糖透析液較使用無糖透析液患者體內血糖穩(wěn)定，糖異生及糖原分解水平可能低于無糖透析。結合透后PCA 得分圖，含糖透析組DN 患者代謝狀態(tài)組內差異小，代謝水平穩(wěn)定。

Figure 6. The identification procedure of differential metabolites at retention time (RT)28.25 min.A:the mass spectrum at RT 28.25 min;B:the MS/MS spectrum of ion of M/Z 377.3050 at 28.25 min in plasma sample;C:the formula and possible fragment mechanism of lithocholic acid.圖6 保留時間28.25 min 處差異代謝物的鑒定

天冬氨酸作為能量物質可以通過糖異生轉化為葡萄糖，亦是一種興奮性神經遞質［7］。有實驗顯示血漿氨基酸水平有可能間接反映顱內氨基酸水平［8-9］。大腦不能合成葡萄糖，且糖原儲量極少，血糖降低，神經細胞供能不足，致神經元和神經膠質細胞去極化，天冬氨酸釋放增加，再攝取減少，使N-甲基-天冬氨酸受體過度興奮，引起離子通道病理性開放、鈣離子大量內流，細胞內鈣超載，嚴重時造成細胞中毒死亡［10］。G+組血清天冬氨酸含量較G－組低，可能與使用含糖透析液較使用無糖透析液患者體內血糖穩(wěn)定、糖異生降低、蛋白分解少有關，也提示使用含糖透析液患者顱內興奮性神經遞質水平可能較低，對患者腦細胞可能有潛在保護作用。

體外紅細胞孵育實驗發(fā)現(xiàn)N-甲基煙酰胺呈劑量依賴性促進紅細胞過氧化氫生成，降低紅細胞NAD/NADH 比值，提示N-甲基煙酰胺與氧化應激有關［11］。G+組N－甲基煙酰胺升高，提示使用含糖透析液可能不利于降低DN 維持性血透患者體內氧化應激狀態(tài);二羥基前列腺素F 在人體內的生物學功能尚不明確。8-異前列腺素F2α是前列腺素F2α的異構體，可作為衡量機體氧化應激狀態(tài)的重要指標［12］，G+組二羥基前列腺素F 升高是否進一步提示含糖透析加重DN 維持性血透患者體內氧化應激狀態(tài)，有待進一步研究。

本研究利用代謝組學的研究方法，初步分析單次使用含5.5 mmol/L 葡萄糖透析液與無糖透析液血液透析4 h 后DN 維持性血透患者的代謝特征。使用含糖透析液較無糖透析液患者體內血糖及代謝水平穩(wěn)定，減少糖異生水平，可能對于改善患者營養(yǎng)狀態(tài)具有優(yōu)勢，同時可能對透析患者腦細胞有潛在保護作用，但目前實驗結果來看可能有加重患者氧化應激狀態(tài)的風險。本研究結果亦顯示，將代謝組學及其技術運用于對含糖透析血清全體代謝物的水平上綜合評價是可行的，使用含糖透析液對DN 維持性血透患者代謝的影響及意義還有待深入研究。

表2 含糖透析組與無糖透析組有顯著差異的代謝物Table 2. The differential metabolites between G + group and G － group (n=10)

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