等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及其在病原檢測(cè)中的應(yīng)用

高 瑤，孟星宇，羅玉子，胡永浩，仇華吉*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理及其在病原檢測(cè)中的應(yīng)用

高 瑤1,2，孟星宇1，羅玉子1，胡永浩2*，仇華吉1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(IAT)作為一種新型的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，與PCR相比，該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)單便捷和成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病原檢測(cè)方面得以應(yīng)用，論文對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、依賴(lài)解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增(HDA)、依賴(lài)核酸序列的等溫?cái)U(kuò)增(NASBA)、鏈置換等溫?cái)U(kuò)增(SDA)、交叉引物擴(kuò)增(CPA)5種擴(kuò)增技術(shù)的原理、特點(diǎn)及應(yīng)用分別予以介紹，為該技術(shù)在病原檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；原理；病原檢測(cè)

體外核酸擴(kuò)增是分子生物學(xué)中一類(lèi)常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，Mullis K等[1]在20世紀(jì)80年代建立的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)應(yīng)用最為廣泛。PCR通過(guò)變性、退火和延伸3個(gè)階段特異地?cái)U(kuò)增目的片段。常規(guī)PCR技術(shù)存在以下缺陷：①PCR儀價(jià)格昂貴；②影響擴(kuò)增因素眾多；③耗時(shí)較長(zhǎng)等。因此，限制了其在基層的推廣使用。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(isothermal amplification technology，IAT)是一類(lèi)更具特色的核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)不同的酶和特異性引物在恒定溫度下進(jìn)行快速擴(kuò)增。與PCR方法相比，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)使用的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單且擴(kuò)增時(shí)間縮短[2]。

根據(jù)反應(yīng)原理的不同，等溫?cái)U(kuò)增可分為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依賴(lài)核酸序列的等溫?cái)U(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、依賴(lài)解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增(helicase-dependent amplification，HDA)、鏈置換等溫?cái)U(kuò)增(strand displacement amplification，SDA)和交叉引物擴(kuò)增(cross-priming amplification，CPA)等。這些技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，在病原檢測(cè)中有不同的應(yīng)用。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

1.1 原理

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是Notomi T等[3]于2000年建立的在恒溫條件下僅用一種酶進(jìn)行核酸快速擴(kuò)增的技術(shù)。①引物設(shè)計(jì)：針對(duì)靶基因3′端的F3c、F2c和F1c區(qū)及5′端的B1、B2和B3區(qū)6個(gè)特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物，上游內(nèi)引物FIP由F1c和F2組成，下游內(nèi)引物BIP由B1c和B2組成，上游外引物F3與F3c互補(bǔ)，下游外引物B3與B3c互補(bǔ)。②啞鈴狀模板構(gòu)造的形成：FIP引物中的F2序列與模板DNA上F2c結(jié)合，在鏈置換DNA聚合酶的作用下向前延伸并啟動(dòng)鏈置換反應(yīng)，外引物F3與模板F3c區(qū)域結(jié)合，共同置換出FIP延伸的單鏈，此單鏈上F1c與F1互補(bǔ)，堿基配對(duì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板，BIP引物與其結(jié)合并延伸，同時(shí)環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)。隨后，B3在聚合酶作用下置換出新的互補(bǔ)鏈，被置換的單鏈兩端均存在互補(bǔ)序列，可發(fā)生自我堿基配對(duì)形成啞鈴狀DNA結(jié)構(gòu)。③擴(kuò)增循環(huán)：以啞鈴狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與其F2c區(qū)結(jié)合開(kāi)始鏈置換合成，通過(guò)再循環(huán)和延伸得到長(zhǎng)度不同的DNA產(chǎn)物。整個(gè)過(guò)程在63℃左右45 min～60 min即可完成。其技術(shù)原理見(jiàn)圖1。

1.2 優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：該方法在等溫條件下進(jìn)行，不需要循環(huán)儀等昂貴的儀器；擴(kuò)增反應(yīng)快，一般在1 h內(nèi)完成；擴(kuò)增產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物含量較大，通過(guò)肉眼、電泳或比濁儀均可判定結(jié)果；敏感性高、特異性強(qiáng)，極適用于病原檢測(cè)。

缺點(diǎn)：對(duì)引物設(shè)計(jì)要求極高，設(shè)計(jì)的4條引物Tm互有差別且需要識(shí)別6個(gè)不同的區(qū)域[4]。擴(kuò)增的靶序列長(zhǎng)度需控制在300 bp以下，故不能擴(kuò)增較長(zhǎng)的目的片段。由于靈敏度高，在操作中極易出現(xiàn)假陽(yáng)性，故試驗(yàn)要嚴(yán)格區(qū)分溶液配制區(qū)、樣品處理區(qū)和檢測(cè)區(qū)。

a．引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)；b．啞鈴狀模板構(gòu)造形成的原理圖 a．Primer design site；b．The schematic of forming dumbbell-shaped template structure

1.3 發(fā)展與應(yīng)用

最初LAMP引物設(shè)計(jì)采用2對(duì)引物識(shí)別6個(gè)位點(diǎn)，后來(lái)Nagamine K等[5]建立了一種通過(guò)加入額外的引物(環(huán)引物)加速LAMP反應(yīng)的方法。改進(jìn)的LAMP方法采用環(huán)引物，反應(yīng)時(shí)間比原始LAMP方法縮短一半。雖然內(nèi)引物和環(huán)引物都通過(guò)環(huán)反應(yīng)，但它們的反應(yīng)機(jī)制不同。Hong T C等[6]研究出一種新型的逆轉(zhuǎn)錄LAMP檢測(cè)方法，在LAMP反應(yīng)混合體系中加入病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，實(shí)現(xiàn)一步法擴(kuò)增，可快速檢測(cè)非典型肺炎病毒(Severe acute respiratory syndrome virus，SARSV)。結(jié)果顯示，RT-LAMP最低檢測(cè)限為0.01 pfu，而RT-PCR只能檢測(cè)1 pfu，因此，RT-LAMP的靈敏度較RT-PCR提高了100倍；RT-LAMP的檢測(cè)特異性是100%，而RT-PCR是87%。

近年來(lái)，LAMP已用于多種細(xì)菌和病毒的檢測(cè)。其中將逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(RT-LAMP)與化學(xué)發(fā)光(chemiluminescence，CL)結(jié)合建立的H7N9病毒檢測(cè)方法，經(jīng)優(yōu)化可檢測(cè)到103拷貝/mL的H7N9流感病毒RNA，與RT-PCR-CL相比，處理時(shí)間顯著縮短[7]。同時(shí)LAMP還可與膠體金試紙條聯(lián)合，在1對(duì)內(nèi)引物中間設(shè)計(jì)1組探針，擴(kuò)增產(chǎn)物直接用試紙條檢測(cè)，使檢測(cè)結(jié)果更直觀(guān)、易于判定。

2 依賴(lài)解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2.1 原理

依賴(lài)解旋酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(HDA)是由美國(guó)NEB公司研究人員Vincent M等在2004年建立的一種模擬生物體內(nèi)DNA自然復(fù)制的擴(kuò)增技術(shù)。HDA擴(kuò)增過(guò)程可分為5個(gè)階段：解旋酶解開(kāi)DNA雙鏈；單鏈DNA結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)結(jié)合其上得到完整的單鏈DNA；引物結(jié)合；聚合酶催化合成靶序列和解旋酶解新鏈再循環(huán)。反應(yīng)初，在輔助蛋白的輔助下解旋酶與雙鏈DNA結(jié)合，把雙鏈DNA解成單鏈；體系中的SSB馬上與產(chǎn)生的單鏈DNA結(jié)合，防止單鏈重新形成雙鏈；同時(shí)引物與單鏈結(jié)合，在聚合酶的催化下合成靶序列。新合成的序列作為模板進(jìn)入新一輪擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)不斷循環(huán)，目的片段呈指數(shù)增長(zhǎng)[8-9]。其原理見(jiàn)圖2。

圖2 HDA的原理(Jeong Y J et al.2009)

2.2 優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：HDA是一種真實(shí)模擬體內(nèi)擴(kuò)增的等溫核酸擴(kuò)增方法，且引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單[10]。HDA依靠解旋酶、SSB和DNA聚合酶催化靶序列擴(kuò)增，因此可以在恒溫下進(jìn)行，適于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

缺點(diǎn)：受解旋酶解旋速度的限制，HDA只能擴(kuò)增短序列。雖然HDA擴(kuò)增原理簡(jiǎn)單，但體系擴(kuò)增步驟復(fù)雜，優(yōu)化受限，尚未廣泛用于病原檢測(cè)和基因擴(kuò)增。

2.3 發(fā)展與應(yīng)用

為提高HDA反應(yīng)效率，研究人員從細(xì)菌中提取到一種耐熱的解旋酶(Tte-UvrD)，可在60℃～65℃擴(kuò)增目的片段，體系不需添加DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MutL和SSB。該方法已應(yīng)用于痰液、胸膜液和尿液樣品中結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)[11]，通過(guò)磁珠捕獲擴(kuò)增的DNA序列，進(jìn)行擴(kuò)增后雜交試驗(yàn)，以提高靈敏性和特異性。同時(shí)，還可以利用熱穩(wěn)定的HDA體系建立一種檢測(cè)RNA片段的擴(kuò)增方法[12]。

另外，通過(guò)對(duì)T7噬菌體復(fù)制機(jī)制的研究，在最初反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上又建立了一種高效快速的HDA檢測(cè)方法，稱(chēng)為環(huán)狀HDA體系(circular HDA system,cHDA)。T7噬菌體復(fù)制系統(tǒng)可以擴(kuò)增環(huán)形DNA和長(zhǎng)達(dá)10 kb的目的片段[13]。Schwenkbier L等[14]成功將磁珠法提取植物DNA、HDA和DNA芯片雜交技術(shù)相結(jié)合，建立了一種植物疫霉的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限可達(dá)10 pg/μL。

3 依賴(lài)核酸序列的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

3.1 原理

依賴(lài)核酸序列等溫?cái)U(kuò)增(NASBA)是一種由Compton J報(bào)道的可對(duì)RNA序列進(jìn)行擴(kuò)增的新技術(shù)[15]。反應(yīng)體系包括AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7 RNA聚合酶、RNase H和2種特別設(shè)計(jì)的特異性引物等。RNA模板鏈進(jìn)入反應(yīng)體系后，含有T7啟動(dòng)子的引物P1先與模板鏈3′端結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補(bǔ)鏈，然后RNase H降解與DNA雜交結(jié)合的RNA鏈，隨后引物P2與單鏈DNA的3′端結(jié)合并延伸，最后依賴(lài)于DNA的T7 RNA聚合酶通過(guò)識(shí)別雙鏈DNA上的T7啟動(dòng)子合成大量RNA補(bǔ)償鏈，反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行。NASBA還可用于DNA的擴(kuò)增，即在擴(kuò)增前將DNA加熱變性，再依原理加入相應(yīng)的酶進(jìn)行反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物仍然是RNA[16]。其原理見(jiàn)圖3。

圖3 NASBA的原理(Gao S D et al.2009)

3.2 優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：NASBA在42℃即可進(jìn)行大量擴(kuò)增。因反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈RNA，不易造成交叉污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性，同時(shí)還能通過(guò)雜交檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感性和特異性，是一種適合檢測(cè)RNA序列的擴(kuò)增技術(shù)[17]。

缺點(diǎn)：反應(yīng)成分復(fù)雜，成本高，需要3種酶共同作用完成擴(kuò)增。

3.3 發(fā)展與應(yīng)用

基于NASBA的一系列優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已應(yīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等研究中。植物細(xì)胞壁中含有大量多糖、酚類(lèi)物質(zhì)，提取植物病毒RNA也存在著穩(wěn)定性差和效率低等問(wèn)題，而RNA本身容易降解，導(dǎo)致最終提取的RNA病毒含量較低，對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度和穩(wěn)定性要求較高。而NASBA技術(shù)將反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)一步完成，適合各種RNA樣品的分析。因此,NASBA技術(shù)與分子信標(biāo)結(jié)合建立了草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus，SVBV)的檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 ng[18]。

侵襲性曲霉菌(Invasive aspergillosis，IA)可危及免疫受損患者的生命，因此對(duì)早期感染患者快速、靈敏的檢測(cè)至關(guān)重要。Du L等[19]建立了檢測(cè)曲霉菌的NASBA-ELISA方法以滿(mǎn)足需要。在高度保守的18 S rRNA區(qū)域特異位點(diǎn)處設(shè)計(jì)引物，并標(biāo)記地高辛(digoxigenin，DIG)，DIG標(biāo)記的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在鏈霉親和素包被的微量滴定板上的特異性生物素化DNA探針雜交，通過(guò)加入與ALP和底物(磷酸4-硝基苯酯二鈉)連接的抗DIG抗體來(lái)比色檢測(cè)雜交體。NABSA-ELISA方法的檢測(cè)限為1 CFU，與其他細(xì)菌和真菌無(wú)交叉反應(yīng)。與RT-PCR和半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)相比，NASBA-ELISA、RT-PCR和GM-ELISA的靈敏度分別為80.56%、72.22%、58.33%，特異性為80.00%、84.00%、82.00%。總之，NASBA與ELISA結(jié)合，可用于大規(guī)模樣品檢測(cè)并有半定量結(jié)果，具有很好的參考價(jià)值。

4 鏈置換等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

4.1 原理

Walker G T等[20]于1992年報(bào)道了關(guān)于鏈置換擴(kuò)增(SDA)的研究，標(biāo)志著一種新的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的誕生。反應(yīng)體系包括限制性核酸內(nèi)切酶、鏈置換DNA聚合酶、兩對(duì)引物等。反應(yīng)包括3個(gè)階段：①引物與DNA單鏈上對(duì)應(yīng)的靶DNA序列結(jié)合，使靶DNA兩端帶上被化學(xué)修飾的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列；②核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將DNA鏈打開(kāi)缺口，DNA聚合酶在缺口處向3′端延伸并置換出DNA單鏈；③被替換下來(lái)的DNA單鏈可分別與引物結(jié)合并延伸形成雙鏈。在37℃條件下反復(fù)循環(huán)2 h，擴(kuò)增靶序列的拷貝數(shù)可達(dá)108。其原理見(jiàn)圖4。

圖4 SDA的原理(Walker G T et al.1992)

4.2 優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：鏈置換依靠具有鏈置換活性的DNA聚合酶進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，基于此，其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相繼出現(xiàn)，使核酸擴(kuò)增方法效率更高、更快速簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn)：SDA必須使用修飾過(guò)的dNTP，不能完成長(zhǎng)片段的擴(kuò)增；在建立缺口時(shí)要加入非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸，因此成本增加的同時(shí)擴(kuò)增效率卻降低；SDA產(chǎn)物兩端還殘留著核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列，不能用于克隆。

4.3 發(fā)展與應(yīng)用

SDA在疾病和基因診斷等方面已有報(bào)道。為了彌補(bǔ)其缺點(diǎn)，鄧世瓊等[21]將缺口酶Nt.Bst- NBI代替限制性?xún)?nèi)切酶，通過(guò)體系優(yōu)化建立了一種低成本的新型檢測(cè)方法，可在30 min內(nèi)檢測(cè)到2 pmol/L的質(zhì)粒DNA，具有很好的應(yīng)用前景。

馬雯[22]將SDA與電化學(xué)傳感技術(shù)聯(lián)用構(gòu)建核酸多酶標(biāo)記體系，建立了一種高效、快速的miRNA檢測(cè)方法。利用磁性納米顆粒作為液相檢測(cè)的微載體，將探針連接至微載體后體系中的miRNA與微載體上的探針結(jié)合，可將引物與聚合酶連接到探針上進(jìn)行延伸并進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，加入鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(streptavidin-alkaline phosphatase，Sa-ALP)通過(guò)磁性分離，可在磁性顆粒上標(biāo)記大量酶而產(chǎn)生酶促產(chǎn)物抗壞血酸，經(jīng)電極氧化為脫氫抗壞血酸，最終檢測(cè)產(chǎn)生的氧化峰電流。該方法檢測(cè)限為9 fM，與熒光定量PCR結(jié)果一致。

針對(duì)SDA必須使用修飾過(guò)的dNTP的問(wèn)題，優(yōu)思達(dá)公司研發(fā)出一種切刻內(nèi)切酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(nicking enzyme mediated isothermal amplification，NEMA)，將限制性?xún)?nèi)切酶用嗜熱切刻內(nèi)切酶替換，該方法不但減少成本，還能擴(kuò)增長(zhǎng)片段。王紀(jì)東等[23]已建立了檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌質(zhì)粒的NEMA技術(shù)，得到450 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出NEMA試劑盒并獲得專(zhuān)利。

5 交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

5.1 原理

交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(CPA)是杭州優(yōu)思達(dá)生物公司新研發(fā)的一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，中國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)[24]。根據(jù)交叉引物數(shù)量的不同，CPA可分為雙交叉擴(kuò)增和單交叉擴(kuò)增。

雙交叉引物擴(kuò)增包括3對(duì)引物(兩條交叉引物、兩條剝離引物和兩條探針)、Bst DNA聚合酶、甜菜堿及其他必要成分。正向交叉引物中的1s與模板互補(bǔ)序列結(jié)合，在鏈置換DNA聚合酶的作用下完成延伸，剝離引物3s將合成的DNA單鏈置換下來(lái)，反向交叉引物2a與其結(jié)合并延伸，經(jīng)剝離引物4a置換，即可產(chǎn)生帶有交叉引物位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。以帶有交叉引物位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，通過(guò)交叉引物和DNA聚合酶的循環(huán)雜交、延伸，就可得到大量重復(fù)帶有交叉位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物。其原理見(jiàn)圖5。

單交叉引物擴(kuò)增體系中只有一條交叉引物，首先交叉引物中的1s與模板互補(bǔ)序列結(jié)合延伸，剝離引物4s置換出新合成的單鏈，將2a引入到擴(kuò)增產(chǎn)物中，在鏈置換DNA聚合酶作用下，以新合成的單鏈為模板，引入特異引物3a、2a，得到兩條不同的單鏈DNA。2a和交叉引物分別與單鏈DNA產(chǎn)物迅速結(jié)合并延伸，形成兩條不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物。以此產(chǎn)物為模板，引物1s或3a、2a與其結(jié)合、延伸，不斷循環(huán)雜交，最終得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物。其原理見(jiàn)圖6。

a．引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)；b．帶有交叉引物位點(diǎn)擴(kuò)增模板的產(chǎn)生 a．Primer design site；b．Generation of the template with cross-priming site

a．引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)；b．帶有引物位點(diǎn)模板的產(chǎn)生 a．Primer design site；b．Generation of the template with primer site

5.2 優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，在水浴鍋內(nèi)63℃左右條件下1 h即可得到大量產(chǎn)物，結(jié)合膠體金試紙條技術(shù)可快速得到檢測(cè)結(jié)果。

缺點(diǎn)：反應(yīng)體系復(fù)雜，方法不穩(wěn)定，有假陽(yáng)性現(xiàn)象[25]。

5.3 發(fā)展與應(yīng)用

為解決開(kāi)蓋檢測(cè)帶來(lái)的污染，尤思達(dá)公司發(fā)明了一次性核酸檢測(cè)裝置，并相繼研發(fā)了多種檢測(cè)試劑盒。趙婷婷等已成功建立了炭疽芽胞桿菌的CPA檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)5.4 pg，對(duì)炭疽Sterne疫苗株的檢測(cè)限為6×103CFU/mL，與其他相似菌株均無(wú)交叉反應(yīng)[26]。表明建立的方法特異性好、靈敏度高，可應(yīng)用于國(guó)境檢疫及公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域。

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是一種高度傳播的冠狀病毒，可引起仔豬尤其是新生仔豬嚴(yán)重的腸道疾病。Wang F X等開(kāi)發(fā)了快速檢測(cè)PEDV的CPA-NATS方法，針對(duì)PEDV的N基因序列特異設(shè)計(jì)5條引物，其中兩個(gè)特異引物5′端分別連接生物素和FITC，可與膠體金試紙條上的相應(yīng)抗體結(jié)合，根據(jù)試紙條檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)處有無(wú)條帶判定擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果表明，該方法對(duì)PEDV的檢測(cè)特異性高，雖然檢測(cè)限與PCR一致，但用時(shí)少，不需要復(fù)雜的儀器，為現(xiàn)場(chǎng)快速準(zhǔn)確診斷該病提供了很好的解決方法[27]。

6 應(yīng)用前景及展望

診斷檢測(cè)方法的建立，最終目的均是應(yīng)用到實(shí)際檢測(cè)中去。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無(wú)需復(fù)雜的儀器，不需要熱變性與溫度循環(huán)，同時(shí)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此被寄予厚望。然而，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種新興技術(shù)仍具有很大的改進(jìn)空間。首先，LAMP、CPA、SDA和NASBA方法涉及到引物較多和引物設(shè)計(jì)要求較高等問(wèn)題，從而限制了其在病原檢測(cè)中的應(yīng)用。其次，等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物多為同一片段形成的多拷貝長(zhǎng)鏈，反應(yīng)體系中即使只含有一條因氣溶膠污染而存在的擴(kuò)增產(chǎn)物，其擴(kuò)增的目的片段濃度也提高了幾十倍甚至幾千倍，因此該方法極易產(chǎn)生假陽(yáng)性。針對(duì)這一問(wèn)題，Hsieh K等[28]在反應(yīng)體系中加入dUTP，將擴(kuò)增產(chǎn)物的胸腺嘧啶替換為尿嘧啶，同時(shí)加入的尿嘧啶-DNA-糖基化酶(uracil-DNA-glycosylase，UDG)通過(guò)特異性地降解尿嘧啶來(lái)消除污染。另外，杭州尤思達(dá)生物公司研制了一次性檢測(cè)裝置，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)階段及檢測(cè)階段均在密閉的檢測(cè)裝置內(nèi)進(jìn)行，避免開(kāi)蓋帶來(lái)的污染，有效解決了氣溶膠帶來(lái)的污染問(wèn)題[29]。

目前，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如何與可視化生物傳感器相結(jié)合并進(jìn)行高通量的現(xiàn)地檢測(cè)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。微流控芯片技術(shù)通過(guò)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，僅在一個(gè)芯片上即可完成核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)等過(guò)程，具有快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀(guān)和可進(jìn)行高通量篩選等優(yōu)點(diǎn)[30]。隨著相應(yīng)的便攜式裝置的開(kāi)發(fā)及費(fèi)用的降低，等溫?cái)U(kuò)增-微流控芯片技術(shù)必將成為下一代基因快速檢測(cè)的發(fā)展方向。

綜上所述，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以其操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力和不需要昂貴儀器的特性逐漸得到廣泛應(yīng)用，隨著對(duì)它們的不斷完善，一定會(huì)成為在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法。

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Abstract:Isothermal amplification technology is a new type of nucleic acid amplificationinvitrothat grows rapidly in recent years.Compared with traditional PCR,this technology takes advantages such as low cost,easy-to-operate,higher sensitivity and specificity.Many isothermal amplification technologies are applied to the detection of bacteria,viruses and other pathogens.Here the principle,feature and application of isothermal amplification technologies are reviewed including loop-mediated isothermal amplification (LAMP),helicase-dependent isothermal amplification (HDA),nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),strand displacement amplification (SDA),and cross priming amplification (CPA).It provides a reference for the practical applications in the detection of pathogens.

Keywords:isothermal amplification technology; principle; pathogen detection

ApplicationofIsothermalAmplificationTechnologyinDetectingPathogens

GAO Yao1,2,MENG Xing-yu1,LUO Yu-zi1,HU Yong-hao2,QIU Hua-ji1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Harbin,Heilongjiang,150069,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

S854.4

A

1007-5038(2017)08-0103-07

2017-02-09

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃畜禽重大疫病防控與高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(2016YFD0500705)

高 瑤(1991- )，女，河南鶴壁人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病分子診斷技術(shù)研發(fā)。*