銀川地區(qū)牛乳中頭孢類藥物與慶大霉素殘留的檢測(cè)

陳 程，吳 帆，王藝暉，王桂琴

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

銀川地區(qū)牛乳中頭孢類藥物與慶大霉素殘留的檢測(cè)

陳 程，吳 帆，王藝暉，王桂琴*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

抗生素殘留一直是威脅食品安全的重大問題，為了解銀川地區(qū)牛乳中抗生素殘留情況，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，對(duì)銀川地區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)和超市共計(jì)350份乳樣進(jìn)行了頭孢類藥物和慶大霉素殘留的檢測(cè)。結(jié)果顯示，來自養(yǎng)殖場(chǎng)的200份乳樣中，有4份樣品的頭孢類藥物檢測(cè)結(jié)果不合格，5份樣品的慶大霉素檢測(cè)結(jié)果不合格，分別占檢測(cè)樣品的2%和2.5%。來自超市的150份乳樣中，有3份樣品的頭孢類藥物檢測(cè)結(jié)果不合格，2份樣品的慶大霉素檢測(cè)結(jié)果不合格，分別占檢測(cè)樣品的2%和1.3%。說明在銀川地區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)和超市的牛乳中均存在頭孢類藥物和慶大霉素殘留超標(biāo)的問題。

頭孢類藥物；慶大霉素；殘留；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

牛乳及牛乳制品中含有人們需要的豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，牛乳中所含有的氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)人體的發(fā)育有著重要的促進(jìn)作用。然而，近年來乳品不安全事件頻發(fā)，抗生素殘留超標(biāo)問題讓人們恐懼，人們一度談“乳”色變[1]。因此，牛乳及牛乳制品的檢測(cè)監(jiān)控技術(shù)和體系建立已成為保障廣大消費(fèi)群體健康的重要課題[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一項(xiàng)非常成熟的檢測(cè)技術(shù)，在醫(yī)學(xué)、生化及食品檢測(cè)等各個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。

頭孢類藥物和慶大霉素是寧夏地區(qū)獸醫(yī)臨床常用抗生素。頭孢菌素(Cephalosporins) 類抗生素是一類具有β內(nèi)酰胺環(huán)的廣譜半合成抗生素[3]，慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素。長期食用抗生素殘留的動(dòng)物源性食品會(huì)對(duì)人類的健康造成很大威脅。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定牛乳中頭孢氨芐、頭孢噻呋等藥物最高殘留為100 ng/mL，慶大霉素最高殘留為200 ng/mL[4]。為了解這兩類抗生素在銀川地區(qū)牛乳中殘留的情況，本試驗(yàn)采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)牛乳中頭孢類藥物和慶大霉素的殘留進(jìn)行檢測(cè)，以期為銀川地區(qū)的牛乳中抗生素殘留監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳樣 鮮牛乳，采自銀川地區(qū)10個(gè)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，共200份。超市成品乳，不同廠家、不同批次的市售純牛乳，共150份。

1.1.2 主要儀器和試劑盒 離心機(jī)、微量移液器，Eppendorf有限公司產(chǎn)品；振蕩器，中國其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；頭孢類藥物快速檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20151203-1)、慶大霉素快速檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20151104-12)，深圳市寶安康生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試劑盒與牛乳樣品的前處理 ①從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，至室溫(20℃～25℃)平衡30 min以上，注意每種液體試劑使用前均需搖勻，然后將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1∶1稀釋，將40 mL濃縮洗滌液用去離子水按照1∶19稀釋，或按所需用量配制洗滌液。②將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置，為了便于檢測(cè)與測(cè)定過程中標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的辨別，按照微量測(cè)試孔條上的編號(hào)，分別在1號(hào)～2號(hào)和3號(hào)～12號(hào)微孔條上添加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。③取1 mL乳樣于4℃、3 000 r/min離心15 min后，去除上層脂肪，取上清液移至干凈的離心管中，按1∶39的比例與配好的復(fù)溶液稀釋后取50 μL進(jìn)行ELISA分析。

1.2.2 ELISA試驗(yàn) ①加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔，然后加入抗體工作液50 μL/孔。振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境中反應(yīng)30 min。取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250 μL/孔洗板4次～5次，每次間隔15 s～30 s，用吸水紙拍干,拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破。②每孔加入酶標(biāo)記物100 μL,蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30 min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液250 μL/孔洗板4次～5次，用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破。③每孔加入底物A液50 μL,再加入底物B液50 μL,振蕩搖勻，25℃環(huán)境中避光顯色15 min。④每孔加入終止液50 μL,輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀與450 nm處，測(cè)定OD值。

2 結(jié)果

2.1 頭孢類藥物測(cè)定結(jié)果

2.1.1 粗略判定 用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/mL)。假設(shè)樣本1的光密度值為0.3，樣本2的光密度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液光密度值分別是：0為2.243，1 ng/mL為1.816，3 ng/mL為1.415，9 ng/mL為0.74，27 ng/mL為0.313，81 ng/mL為0.155。則樣本1的濃度范圍是27 ng/mL～81 ng/mL，樣本2的濃度范圍是3 ng/mL～9 ng/mL，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中頭孢類藥物實(shí)際濃度。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本光密度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的光密度值(B)，再乘以100%，即百分光密度值。

以所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本光密度值的平均值為B，以標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為B0，以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率(y=B/B0)為縱坐標(biāo)，以頭孢類藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制頭孢類藥物快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

圖1 頭孢類藥物快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

將樣本的百分吸光率帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中頭孢類藥物實(shí)際濃度，從而可知其頭孢類藥物殘留量。由圖1可得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-20.224x+112.32，相關(guān)系數(shù)為0.996 8，可見其各數(shù)據(jù)之間具有非常好的相關(guān)性，表明該頭孢類藥物快速檢測(cè)試劑盒針對(duì)頭孢類藥物殘留的檢測(cè)分析是準(zhǔn)確可靠的。

2.1.3 乳樣中頭孢類藥物檢測(cè)結(jié)果 使用ELISA快速檢測(cè)試劑盒對(duì)分別來自規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和超市共計(jì)350份乳樣進(jìn)行頭孢類藥物殘留檢測(cè)，并使用藥物類殘留檢測(cè)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。 經(jīng)統(tǒng)計(jì)，在200份采自規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)的乳樣中有4份不合格樣品，即不合格率為2%；而來自150份超市的乳樣有3份不合格樣品，不合格率為2%(表1)。

表1 乳樣中抗生素殘留合格率的檢測(cè)

2.2 慶大霉素測(cè)定結(jié)果

2.2.1 粗略判定 用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/mL),假設(shè)樣本1的光密度值為0.310，樣本2的光密度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液光密度值分別是：0為1.510，0.1 ng/mL為1.320，0.3 ng/mL為1.030，0.9 ng/mL為0.660，2.7 ng/mL為0.389，8.1 ng/mL為0.198。則樣本1的濃度范圍是2.7 ng/mL～8.1 ng/mL，樣本2的濃度范圍是0.3 ng/mL～0.9 ng/mL，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實(shí)際濃度。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本光密度值的平均值(C)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的光密度值(C),再乘以100%，即百分光密度值。

以所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本光密度值的平均值為C，以標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為C0，以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率(y=C/C0)為縱坐標(biāo)，以慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制慶大霉素快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

圖2 慶大霉素快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線

將樣本的百分吸光率帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中慶大霉素實(shí)際濃度，從而可知慶大霉素殘留量。由圖2可得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-18.215x+101.01，相關(guān)系數(shù)為0.992 5,可見其各數(shù)據(jù)之間具有非常好的相關(guān)性，表明該慶大霉素快速檢測(cè)試劑盒針對(duì)慶大霉素的殘留進(jìn)行檢測(cè)分析是準(zhǔn)確可靠的。

2.2.3 乳樣中慶大霉素檢測(cè)結(jié)果 使用ELISA快速檢測(cè)試劑盒對(duì)分別來自規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和超市的350份乳樣進(jìn)行慶大霉素的殘留進(jìn)行檢測(cè)，并使用藥物類殘留檢測(cè)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，采自規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的200份乳樣中有5份不合格樣品，即不合格率為2.5%，而來自超市的150份的乳樣有2份不合格樣品，不合格率為1.3%(表1)。

3 討論

目前用于檢測(cè)藥物殘留的方法主要有微生物法[5-7]、色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法[8-18]、免疫分析法等[19-23]。微生物檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，但其檢測(cè)周期長且結(jié)果誤差較大。色譜法或色譜-質(zhì)譜等聯(lián)用技術(shù)雖然靈敏度高，但是樣品前處理及測(cè)定操作繁瑣、費(fèi)用高，不適于大量樣品的快速檢測(cè)。而本試驗(yàn)所用ELISA檢測(cè)的350個(gè)樣品中每80個(gè)樣品為一個(gè)檢測(cè)批次，每批次檢測(cè)用時(shí)僅75 min左右。從ELISA快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)(R2=0.989)可以看出，各標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)間相關(guān)性較高。由此可見，ELISA快速檢測(cè)試劑盒具有較高的靈敏性、高效性、特異性和簡(jiǎn)便性等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于獸藥殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩查。

頭孢菌素由于其具有殺菌力強(qiáng)、毒副作用小、過敏反應(yīng)少等特點(diǎn)[23]，在畜牧動(dòng)物養(yǎng)殖中廣泛用于奶牛乳房炎的預(yù)防與治療，但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等多方面原因，在乳產(chǎn)品中殘留過多，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到人體中，對(duì)人體造成重大危害[24]。本試驗(yàn)利用ELISA方法對(duì)銀川地區(qū)350份牛乳進(jìn)行頭孢類藥物和慶大霉素殘留檢測(cè)，陽性率均為2%。我國各地區(qū)的牛乳中都有一定程度的抗生素殘留,其陽性率有一定差異。導(dǎo)致陽性率差異的原因有多方面，可能與檢測(cè)方法的特異性和靈敏度有關(guān)，另外可能還與抗生素的使用情況、乳牛的飼養(yǎng)管理等有關(guān)。

由于該試劑盒使用前是在2℃～8℃環(huán)境冷藏(不可冷凍)，故使用前應(yīng)當(dāng)將試劑盒中所有試劑溫度回升至室溫20℃～25℃，否則會(huì)導(dǎo)致所有的OD值偏低。其次，從本試驗(yàn)各個(gè)環(huán)節(jié)和結(jié)果來看，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。若在洗板過程中如果出現(xiàn)洗板干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性、重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。另外，混合要均勻否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。由于反應(yīng)終止液為2 mol/L硫酸，試驗(yàn)過程中需做好防護(hù)工作，避免試劑接觸皮膚，造成不必要的損傷。

本試驗(yàn)使用ELISA快速檢測(cè)試劑盒分別對(duì)來自銀川地區(qū)部分規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和超市共計(jì)350份乳樣進(jìn)行頭孢類藥物和慶大霉素的殘留檢測(cè)，結(jié)果顯示，銀川地區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)的牛乳中頭孢類藥物殘留檢測(cè)合格率為98%，慶大霉素檢測(cè)合格率為97.5%。來自超市的牛乳中頭孢類藥物殘留檢測(cè)合格率為98%，慶大霉素檢測(cè)合格率為98.7%。說明在銀川地區(qū)的牛乳中存在頭孢類藥物和慶大霉素殘留及殘留超標(biāo)現(xiàn)象，需繼續(xù)加大監(jiān)控力度，確保乳品安全。

[1] Rajapandiyan P,Tang W L,Yang J.Rapid detection of melamine in milk liquid and powder by surface-enhanced Raman scattering substrate array[J].Food Control,2015,56(3):155-160.

[2] Ahmed K M F,Hafez R S,Morgan,et al.Detection of some chemical hazards in milk and some dairy products[J].African J Food Sci,2015,9(4):187-193.

[3] The European Commission.Commission Regulation (EU)N037/2010 0f 22 December 2009 on pharm acologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in food stuffs of animal origin[J].Offical J Eur Commun,2010,15:1-27.

[4] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告.關(guān)于發(fā)布《動(dòng)物性食品中獸藥殘留最高殘留限量的通知》[S].2002-12-24.

[5] 馬麗蘋,糾 敏,秦翠麗,等.微生物抑制法檢測(cè)牛奶中青霉素類藥物的殘留[D].河南洛陽：河南科技大學(xué),2013.

[6] Cazedey E C,Salgado H R.A novel and rapid microbiological assay for ciprofloxacin hydrochloride[J].J Pharmac Analy,2013,3(5):382-386.

[7] 王金鳳,楊化新,陳金泉,等.新技術(shù)在氨基糖苷類藥物質(zhì)控方面的應(yīng)用和進(jìn)展[J].中國藥事,2014,28(4):409-412.

[8] 鄭 天,屠小燕.高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品工業(yè)上的應(yīng)用[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,26(2)：3-5.

[9] Han R W,Zheng N,Yu Z N,et al.Simultaneous determination of 38 veterinary antibiotic residues in raw milk by UPLC-MS/MS[J].Food Chem,2015,181:119-126.

[10] Gbylik-Sikorska M,Posyniak A,Sniegocki T,et al.Liquid chromatography-tandem mass spectrometry multiclass method for the determination of antibiotics residues in water samples from water supply systems in food-producing animal farms[J].Chemosphere,2015,119:8-15.

[11] 劉雪杰,邱宏端,陳濟(jì)琛,等.牛奶抗生素殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2013(5):300-302.

[12] Pérez R.QuEChERS methodologies as an alternative to solid phase extraction (SPE) for the determination and characterization of residues of cephalosporins in beef muscle using LC-MS/MS[J].J Chromatog B,2012,899(9):57-65.

[13] Jank L,Hoff R B,Tarouco P C,et al.β-lactam antibiotics residues analysis in bovine milk by LC-ESI-MS/MS: a simple and fast liquid-liquid extraction method.[J].Food Addit Contamin Part A,2011,29(4):497.

[14] Kukusamude C,Burakham R,Chailapakul O,et al.High performance liquid chromatography for the simultaneous analysis of penicillin residues in beef and milk using ionpaired extraction and binary water-acetonitrile mixture.[J].Talanta,2012,92(92):38-44.

[15] Gáspár A,Andrási M,Kardos S.Application of capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of cephalosporins[J].J Chromatog B,2002,775(2):239-246.

[16] Storey J M,Clark S B,Johnson A S,et al.Analysis of sulfonamides,trimethoprim,fluoroquinolones,quinolones, triphenylmethane dyes and methyltestosterone in fish and shrimp using liquid chromatography-mass spectrometry.[J].J Chromatog B,2014,972:38-47.

[17] Liu X,Yu Y,Zhao M,et al.Solid phase extraction using magnetic core mesoporous shell microspheres with C18-modified interior porewalls for residue analysis of cephalosporins in milk by LC-MS/MS[J].Food Chem,2014,150:206-212.

[18] Yibar A,Ozcan A,Karaca M Y.Determination of erythromycin,spiramycin,tilmicosin and tylosin in animal feedingstuffs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Kafkas Universitesi Veteriner Fakultesi Dergisi,2014,20 (3):439-444.

[19] 崔廷婷,鐘建三,張 瑜,等.動(dòng)物源性食品中紅霉素殘留的ELISA檢測(cè)[J].四川畜牧獸醫(yī),2015(1):29-31.

[20] 韓 青,王 靜,徐 豪,等.牛奶中替米考星間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī),2015(10):2625-2630.

[21] Al-Delaimy K,Mahmoud I.Aflatoxin M1 in milk and milk products in Jordan and methods for its reduction:A preliminary study[J].Bri J Appl Sci Technol,2015,6(6):597-605.

[22] 邢廣旭.氟喹諾酮類藥物多殘留免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究[D].河南鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[23] 洪云鶴,李偉青,林 中,等.動(dòng)物源性食品中頭孢菌素類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2016(13):370-375.

[24] 許 娜,孫海新,張 慧,等.牛奶中頭孢類藥物殘留的HPLC多聯(lián)檢測(cè)方法[J].中國乳品工業(yè),2016(2):50-52，60.

Abstract:Antibiotic residues have been a major threat to food security.In order to understand the residues of cephalosporins and gentamicin in cow milk in Yinchuan,cephalosporins and gentamicin residues were tested on 350 milk samples collected from farms and supermarkets by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that 4 samples of cephalosporin test results and 5 samples of gentamicin test results were unqualified in 200 milk samples from the farms,which accounting for 2% and 2.5% of the samples respectively.From the market in 150 milk samples,3 samples of cephalosporin test results were unqualified and 2 samples of gentamicin test results were unqualified, which accounting for 2% and 1.3% of the samples respectively.It revealed that the cephalosporin and gentamicin excessive residues in milk existed in the farms and supermarkets of Yinchuan.

Keywords:cephalosporins;gentamicin;residue;enzyme-linked immunosorbent assay

文獻(xiàn)綜述

DetectionandAnalysisofCephalosporinsandGentamicinResiduesinCowMilkinYinchuan

CHEN Cheng,WU Fan,WANG Yi-hui,WANG Gui-qin

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

S859.84

A

1007-5038(2017)08-0076-04

2016-07-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360626)

陳 程(1992-)，男，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究。*