蛇代謝綜合征繼發(fā)感染細菌的分離鑒定及致病性試驗

韓林梅,蘇接瑜，覃炳雄，曾 蕓*，李 軍，廖河康

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530004；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；3.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；4.廣西陸生野生動物救護研究中心與疫源疫病監(jiān)測中心，廣西南寧 530001)

蛇代謝綜合征繼發(fā)感染細菌的分離鑒定及致病性試驗

韓林梅1,蘇接瑜1，覃炳雄1，曾 蕓1*，李 軍2,3*，廖河康4

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530004；2.廣西獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001；3.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；4.廣西陸生野生動物救護研究中心與疫源疫病監(jiān)測中心，廣西南寧 530001)

近年來，廣西人工飼養(yǎng)的蛇發(fā)生代謝障礙綜合征后，病死率較高，為查清原因，對臨床接診的18例蛇代謝障礙綜合征病例的心、肝、脾等臟器病料進行細菌分離鑒定，并測定分離菌對小鼠和蛇的致病力。結(jié)果從18例病蛇的不同組織器官中分離到10株細菌，PCR結(jié)合生化試驗方法，鑒定出4種細菌，分別為糞腸球菌、克氏葡萄球菌、緩慢葡萄球菌和弗格森氏大腸埃希菌，并對其進行種系發(fā)育關(guān)系分析。所鑒定的4種細菌對昆明小鼠和蛇的致病力差異較大，克氏葡萄球菌和弗格森氏大腸埃希菌對昆明小鼠有較強致病性，糞腸球菌和緩慢葡萄球菌對昆明小鼠致病力較弱；克氏葡萄球菌對眼鏡蛇有致病性，其余菌對王錦蛇、眼鏡蛇、滑鼠蛇均無致病性。

代謝綜合征；細菌；鑒定；致病力；蛇

蛇代謝綜合征是指蛇體自身代謝物排泄障礙引起尿酸沉積在血管、黏膜或?qū)嵸|(zhì)器官引發(fā)的物質(zhì)代謝失常的綜合征[1]。該病分原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型。原發(fā)型以短期高蛋白飼養(yǎng)為誘因，以肥胖蛇多見，呈散發(fā)性發(fā)病，病死率低，只有繼發(fā)感染才出現(xiàn)比較高的病死率；繼發(fā)型則與細菌感染、用藥混亂、長期缺水等因素有關(guān)[2]。

引起蛇發(fā)病的細菌多是革蘭陰性細菌,少部分屬于革蘭陽性細菌。蛇口腔中的常在菌包括假單胞菌、變形桿菌、克雷伯菌、腸桿菌、細球菌和棒狀桿菌；糞便中的常在菌有變形桿菌、沙門菌、亞利桑那菌和球菌[3]。王金才等[4]從黑眉錦蛇分離到沙門菌和變形桿菌；何偉成從蟒蛇分離到氣單胞菌[5]；李婉萍等[6]從蟒蛇分離到銅綠假單胞菌；李方青等[7]從王錦蛇、灰鼠蛇分離出變形桿菌；肖楊等[8]從滑鼠蛇、草花蛇中分離到沙門菌；曾蕓等[9]從眼鏡蛇分離出變形桿菌。

近年來，廣西人工飼養(yǎng)蛇的代謝障礙綜合征呈現(xiàn)病死率較高，為了查清原因，本文對臨床接診的18例蛇代謝障礙綜合征病例進行細菌分離和鑒定，并對分離細菌進行小鼠與蛇的致病力試驗，分析蛇發(fā)生死亡的主要原因，探尋解決方法，為有效防治蛇代謝綜合征提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 20日齡的昆明小鼠15只，平均體重20 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心；3月齡眼鏡蛇(53 g)、滑鼠蛇(50 g)、王錦蛇(48 g)各15條，由南寧市馨宇蛇類養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 病例來源 南寧市及周邊鄰縣養(yǎng)蛇場送檢的患病蛇。

1.1.3 主要試劑和器材 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA提取試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司產(chǎn)品；微量生化反應(yīng)管，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；麥氏比濁管由廣西大學動物科學技術(shù)學院藥理實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢與臨床診斷 將送檢蛇在實驗室進行病理剖檢，觀察患病蛇的主要病理變化；同時取內(nèi)臟器官表面的白色物進行顯微鏡檢和200 g/L NaOH溶解試驗。

1.2.2 細菌分離 無菌采取臨床診斷為代謝障礙綜合征患病蛇的心、肝、脾和腎，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑單個菌落繼續(xù)劃線接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進行細菌的純分離，觀察并記錄細菌的生長特性，并進行革蘭染色分類。

1.2.3 分離菌的生化試驗 參照《伯杰細菌鑒定手冊》[10]的操作方法，將純化的細菌分別接種于生化反應(yīng)管，置37℃恒溫培養(yǎng)24 h～48 h觀察生化反應(yīng)結(jié)果，同一項目進行2個重復。

1.2.4 16 S rRNA測序鑒定 選擇菌落形態(tài)、生長特性和生化反應(yīng)完全不一樣的細菌分離株，按細菌基因組DNA提取試劑盒的說明提取細菌DNA，采用通用引物16 S-1492R和16S-27F擴增細菌16 S rRNA[11]，擴增產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，對序列進行同源性比對及種間比對。

1.2.5 DNA序列數(shù)據(jù)的處理及分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建 從GenBank上獲取已登錄的所有糞腸球菌C1W1基因序列、克氏葡萄球菌S4基因序列、緩慢葡萄球菌BGZ-7基因序列和弗格森氏大腸埃希菌DH-32基因序列進行種內(nèi)比對。序列信息見表1。

應(yīng)用Lasergene7(SeqMan)對表1序列及測序結(jié)果進行校對。糞腸球菌以C1W1基因以外的基因為外群?？耸掀咸亚蚓訩J888112、KJ441744和JX102547為外群。緩慢葡萄球菌以KX950708、KX525724和KM378611為外群。弗格森氏大腸埃希菌以KT287075、JX013427為外群。應(yīng)用Clustal W在線軟件進行多重序列比對，然后利用MEGA5鄰位相連法(Neighbor-join-ing,NJ)分別進行構(gòu)建樹。

1.2.6 細菌對小鼠和蛇致病力測定 將測序鑒定的細菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，用滅菌生理鹽水洗下菌落，采用麥氏比濁法將細菌配制為3×109CFU/mL的細菌懸液[12]，按0.2 mL/10 g給昆明鼠腹腔注射細菌懸液，每種細菌接種3只昆明鼠，對照組注射等劑量的生理鹽水，觀察并記錄接種細菌后昆明鼠的反應(yīng)和死亡率，死亡昆明鼠進行細菌分離鑒定。從死亡鼠的心肝肺回收到接種菌，對照鼠試驗期內(nèi)無異常。

表1 4種菌的參考菌株

按上述方法分別將細菌接種于眼鏡蛇、滑鼠蛇、王錦蛇，每種蛇接種3條，觀察并記錄不同種類蛇接種細菌后的反應(yīng)和死亡率，死亡蛇進行細菌分離鑒定。從死亡蛇心肝分離到接種菌，對照蛇在試驗期內(nèi)無異常。

2 結(jié)果

2.1 病理解剖與臨床診斷

送檢的18例患病蛇心包膜和肝臟表面可見有大量的白色沉積物(圖1)，腎臟腫大充滿白色顆粒樣物、輸尿管有白色沉積物(圖2)，光學顯微鏡下觀察白色沉積物呈結(jié)晶狀(圖3)，白色沉積物滴加200 g/L NaOH后，緩慢溶解(圖4)。

圖1 王錦蛇心和肝白色沉積物

2.2 細菌分離結(jié)果與細菌生長特性

從18病患病蛇的病理剖檢與臨床診斷為代謝障礙綜合征的心、肝、脾和腎中分離得到10株細菌，細菌的生長特性見表2。

2.3 分離菌的生化反應(yīng)結(jié)果

按照生化特性試驗方法進行生化鑒定，4種菌株結(jié)果與東秀珠、蔡妙英主編《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]中摩氏摩根菌的生化特性相一致。

圖2 滑鼠蛇輸尿管堵塞

圖3 顯微鏡下結(jié)晶物形態(tài)(40×)

圖4 顯微鏡下結(jié)晶物溶解形態(tài)(40×)

1號、2號、3號分離菌：精氨酸雙水解、馬尿酸鹽水解、D-木糖、蔗糖、D-乳糖、D-甘露醇的生化反應(yīng)呈陽性，硝酸鹽還原、VP、棉籽糖呈陰性(表3)。

4號、5號、6號分離菌：馬尿酸鹽水解、D-甘露醇、D-乳糖呈陽性，硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、 VP、D-木糖、棉籽糖、蔗糖呈陰性(表4)。

7號、8號分離菌：棉籽糖、蔗糖、 D-甘露醇、D-乳糖、硝酸鹽還原呈陽性，精氨酸雙水解，馬尿酸鹽水解,VP 、D-木糖陰性(表5)。

9號、10號分離菌對吲哚、 OPNG、葡萄糖產(chǎn)氣、賴氨酸脫羧、精氨酸雙水解、鳥氨酸脫羧、D-甘露醇、氰化鉀陽性，對甲基紅、檸檬酸鹽利用、三糖鐵產(chǎn)硫化氫、馬尿酸鹽水解、苯丙氨酸脫氫陰性(表6)。

表2 10株細菌的生長特性

表3 病原分離株生化特性試驗結(jié)果

注：+，陽性；-，陰性。

Note：+,Positive;-,Negative.

表4 病原分離株生化特性試驗結(jié)果

注：+，陽性；-，陰性。

Note：+,Positive;-,Negative.

表5 病原分離株生化特性試驗結(jié)果

注：+，陽性；-，陰性。

Note：+,Positive;-,Negative。

表6 病原分離株生化特性試驗結(jié)果

注：+，陽性；-，陰性。

Note:+,Positive;-,Negative.

2.4 16 S rRNA測序結(jié)果

根據(jù)細菌形態(tài)特點和生化性質(zhì)表現(xiàn)一致的，選擇代表株2號菌株、5號菌株、7號菌株和9號菌株進行DNA提取和16 S rRNA序列擴增，擴增結(jié)果見圖5。獲得的序列在NCBI上進行同源性比對，結(jié)果2號、5號、7號、9號菌株分別與糞腸球菌(KF254548.1)、克氏葡萄球菌(JQ660155.1)、緩慢葡萄球菌(KM378611.1)、弗格森埃森菌(KF646704.1)高度同源，同源性達99%以上。

2.5 種系發(fā)育關(guān)系分析

糞腸球菌蛇分離株(56)與KF254548構(gòu)成一個單獨分支。KY523584、KY523583、KY010411、KX018440、KU200452與本株同屬一個分支(圖6)。

克氏葡萄球菌蛇分離株(S4-437)與HQ179005、JQ660155、HM321442屬同一分支，HQ179005和JQ660155構(gòu)成一個單獨分支。與KJ888112、KC441744、JX102547屬于不同分支(圖7)。M.DNA標準DL 2 000; 1. 2號菌株; 2. 5號菌株; 3. 7號菌株；4. 9號菌株；5.陽性對照；6.陰性對照緩慢葡萄球菌蛇分離株(BGZ-7)所構(gòu)建的樹與克氏葡萄球菌形狀像似，與HQ437165、KC951997、HM815537、FJ893453屬于同分支，HQ437165和KC951997構(gòu)成一個單獨分支。與KX950708、KX525724、KM378611屬于不同分支(圖8)。

M.DNA Marker DL 2 000; 1. No.2; 2:No.5; 3. No.7;4.No.9;5.Positive control;6.Negative control

圖5細菌16 S rRNA PCR擴增結(jié)果

Fig.5 PCR amplification results of 16 S rRNA

圖6 糞腸球菌系譜關(guān)系

圖7 克氏葡萄球菌系譜關(guān)系

弗格森氏大腸埃希菌蛇分離株(DH-32)與KF646704單獨屬于一分支。與KT275828、KX162658、KP418799屬于同一分支。同屬于KT287075分支之一(圖9)。

2.6 分離菌對動物的致病力

昆明小鼠腹腔注射細菌懸液4 h后，出現(xiàn)不同程度的呼吸急促。6 h后出現(xiàn)精神沉郁、打堆、被毛豎立、顫抖的現(xiàn)象。8 h～24 h，小鼠陸續(xù)死亡。24 h后存活者繼續(xù)飼養(yǎng)1周，沒有出現(xiàn)死亡。

圖8 緩慢葡萄球菌系譜關(guān)系

圖9 弗格森氏大腸埃希菌系譜樹

接種5號、9號分離菌的3只昆明小鼠全都死亡，死亡率100%。接種2號分離菌的3只組死亡2只，死亡率66%。接種7號分離菌的3只組死亡1只，死亡率33%。從死亡昆明小鼠心、肝分離到接種菌。

眼鏡蛇、王錦蛇、滑鼠蛇腹腔注射細菌懸液24 h后，蛇均未出現(xiàn)異常。36 h后，接種5號分離菌的眼鏡蛇相繼出現(xiàn)離窩，精神不振，反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象，72 h后，3條眼鏡蛇全部死亡，死亡率100%。存活蛇繼續(xù)飼養(yǎng)1周，均未出現(xiàn)死亡。從死亡眼鏡蛇心、肝分離到與接種菌。

3 討論

通過對臨床診斷為蛇代謝障礙綜合征的18個病例進行細菌分離，結(jié)果獲得10株細菌，生化和16 S rRNA分子鑒定為3株糞腸球菌，3株克氏葡萄球菌，2株緩慢葡萄球菌，2株弗格森氏大腸埃希菌。動物致病力試驗可知分離菌對昆明鼠具有明顯的致病力，但是對蛇致病力較弱，而且分離菌對蛇種間的致病力有差異，只有克氏葡萄球菌對眼鏡蛇具有明顯的致病性。

緩慢葡萄球菌、克氏葡萄球菌、糞腸球菌和弗格森氏大腸埃希菌均為條件性致病菌，廣泛分布于環(huán)境、人和動物的體表或腸道?；加写x障礙綜合征的蛇隨著病情發(fā)展，機體免疫力下降等影響，可能會繼發(fā)引起這些細菌感染，進一步加劇病情，從而出現(xiàn)高的死亡率[14]。所以對蛇代謝障礙綜合征的診斷和治療中不能忽視可能出現(xiàn)的細菌繼發(fā)感染。

人工飼養(yǎng)的蛇類可能都會出現(xiàn)代謝障礙綜合征，但在臨床檢出率中以眼鏡蛇發(fā)病率較高，這很可能與眼鏡蛇飲食習慣有關(guān)[15]，眼鏡蛇對食物種類、品質(zhì)要求不高，且具有暴食的特點，一次性會食入大量的食物，加上規(guī)?；⒚芗B(yǎng)殖，蛇活動空間小，長期大量食入高蛋白的雞胚、鴨胚或青蛙，可能會引起代謝障礙疾病。因此通過控制食物投放量、采取定期投放、提供合適的運動空間等方式可以有效地預防蛇代謝障礙綜合征的出現(xiàn)。

不同動物對同種細菌的免疫能力存在著差異，而本試驗出現(xiàn)的差異很大，最大的原因可能是溫度的影響，在做細菌對蛇的試驗時溫度過低，不利于細菌的繁殖生長，同時低溫使蛇進入半冬眠狀態(tài)，血液流動減慢，細菌感染速度減慢。同時，從第2天溫度上升，第3天有蛇死亡，而分離出來的菌為所注射的細菌，可以得出溫度影響是最大的原因。

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Abstract:The snake metabolic syndrome was broken in artificial feeding snakes in Guangxi recently. For its high mortality, the pathogens of snake metabolic syndrome were investigated. Bacteria were isolated and identified from heart, liver, spleen of 18 cases of snake metabolic syndrome, and their pathogenicity were tested in mice and snakes.The results showed that 10 strains of bacteria were isolated from different organs of sick snakes.Enterococcusfaecalis,Staphylococcuskloosii,Staphylococcuslentus,Escherichiafergusoniiwere identified by PCR and biochemical tests.The virulences of 4 species of bacteria to mice and snakes were different.StaphylococcuskloosiiandEscherichiafergusoniihad strong pathogenicity to mice,however,EnterococcusfaecalisandStaphylococcuslentusappeared low virulence.Enterococcusfaecalis,StaphylococcuslentusandEscherichiafergusoniiwere avirulent toElaphecarinata,cobra andPtyasmucosus,except thatStaphylococcuskloosiiwas virulent to cobra.

Keywords:metabolic syndrome; bacteria; identification; pathogenicity；snake

IdentificationandPathogenicityofBacteriaIsolatedfromSnakeMetabolicSyndrome

HAN Lin-mei1,SU Jie-yu1,QIN Bing-xiong1,ZENG Yun1,LI Jun2,3,LIAO He-kang4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004 ,China; 2.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,Nanning,Guangxi,530001,China; 3.GuangxiKeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalTechnology,Nanning,Guangxi,530001,China; 4.GuangxiTerrestrialWildlifeRescueResearchCenterandEndemicDiseaseMonitoringCenter,Nanning，Guangxi,530001,China)

S865.32

A

1007-5038(2017)08-0043-06

2016-12-06

南寧市2016年科技項目(20163355)

韓林梅(1989-)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事藥理與毒理學研究。*