過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物最佳殺菌條件的研究

馮 秀，王愛(ài)玲，張振倉(cāng)，張為民，周宏超，張彥明，郭抗抗*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物最佳殺菌條件的研究

馮 秀1△，王愛(ài)玲1△，張振倉(cāng)2，張為民1，周宏超1，張彥明1，郭抗抗1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

以過(guò)硫酸氫鉀消毒劑為研究對(duì)象，以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為受試菌，通過(guò)懸液定量殺菌試驗(yàn)，研究在不同溫度、作用時(shí)間和干擾物存在條件下，過(guò)硫酸氫鉀的殺菌作用。結(jié)果顯示，有機(jī)干擾物不存在時(shí)，在設(shè)定溫度下(37、25、4℃)，濃度為312.5 mg/L～1 250 mg/L的過(guò)硫酸氫鉀對(duì)受試菌(107CFU/mL)作用5 min，殺菌率為100%；濃度為2 500 mg/L時(shí)，1 min可完全殺滅受試菌。當(dāng)有機(jī)物(牛血清白蛋白)在菌液中的終濃度為30 g/L時(shí)，室溫下作用10 min，完全殺滅大腸埃希菌濃度為625 mg/L，金黃色葡萄球菌為2 500 mg/L。有機(jī)物含量為250 g/L時(shí)，相同條件下對(duì)大腸埃希菌的殺菌率為99.99%，對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率為99.97%。研究結(jié)果為過(guò)硫酸氫鉀作為消毒劑的有效使用提供了參考。

過(guò)硫酸氫鉀；大腸埃希菌；金黃色葡萄球菌；殺菌效果

消毒是撲滅動(dòng)物疫情的重要措施之一，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物是一種無(wú)機(jī)酸性氧化劑，一般是指單過(guò)硫酸鉀或單過(guò)硫酸氫鉀，可用于畜舍消毒、水體消毒、紙漿漂白和羊毛織物的防縮處理等[1]，還可作為有機(jī)合成中的重要輔助劑、污水處理中含硫物質(zhì)的氧化劑及水產(chǎn)養(yǎng)殖中的供氧劑。過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物是由過(guò)硫酸氫鉀(KHSO5)、硫酸氫鉀(KHSO4)和硫酸鉀(K2SO4)組成的固體物質(zhì)，KHSO5是其主要的活性物質(zhì)，具有極強(qiáng)的氧化能力；易溶于水，可在水體中產(chǎn)生各種高活性的小分子自由基和活性氧等衍生物，一般不形成有毒副產(chǎn)物，使用安全性高，符合環(huán)保要求[2]；通常狀態(tài)下性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，活性高，可參與多種化學(xué)反應(yīng)；殺菌原理主要是利用單過(guò)硫酸氫鉀的特殊氧化能力和鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，即在水溶液中不斷產(chǎn)生新生態(tài)氧、次氯酸、自由羥基、過(guò)氧化氫，通過(guò)新生態(tài)氧和自由羥基的氧化作用可以改變細(xì)胞膜的通透性使之破裂，從而達(dá)到殺滅病原微生物的目的[3]。在動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，為了防止疫病病原的感染和發(fā)病，使用化學(xué)藥物進(jìn)行環(huán)境和場(chǎng)所的消毒是一項(xiàng)經(jīng)常性的工作，但是也存在由于長(zhǎng)期使用相同的消毒劑導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生了耐藥性，殺菌效果降低的問(wèn)題[4]。過(guò)硫酸氫鉀由于其獨(dú)特的殺菌原理，不僅可以殺滅氯制劑或表面活性劑所不能殺滅的致病菌，而且不會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性，所以以過(guò)硫酸氫鉀為主要成分的消毒劑在養(yǎng)殖場(chǎng)被廣泛的使用，但在使用過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題，如消毒劑的使用濃度、作用時(shí)間、環(huán)境干擾物及溫度都會(huì)影響其作用效果，雖然通過(guò)提高消毒劑濃度的方式可以提高消毒的效果，但是增加了成本，甚至?xí)?duì)環(huán)境造成污染和危害。由于環(huán)境中各種不同因素的影響(包括季節(jié)性的溫度變化和畜舍中有機(jī)物濃度大小等)，消毒劑在殺滅病原菌時(shí)所需要的濃度和作用時(shí)間也會(huì)發(fā)生改變[5]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，許多養(yǎng)殖人員在使用消毒劑對(duì)病原菌進(jìn)行撲滅時(shí)很少去評(píng)估環(huán)境因素對(duì)其殺菌效果的影響，使用濃度過(guò)高的消毒液會(huì)造成對(duì)消毒劑的浪費(fèi)，使用濃度過(guò)低的消毒液會(huì)導(dǎo)致病原菌不能被完全殺死。研究在不同溫度和不同有機(jī)物存在的情況下過(guò)硫酸氫鉀的殺菌效果來(lái)確定其在不同環(huán)境中的最佳使用濃度，確定消毒劑的最佳作用條件，合理的使用消毒劑，對(duì)提高養(yǎng)殖效益和保護(hù)環(huán)境安全都具有重要意義。

本研究以豬場(chǎng)常見(jiàn)的病原微生物為受試菌，對(duì)不同條件下過(guò)硫酸氫鉀的最佳殺菌作用進(jìn)行了研究。致病性大腸埃希菌是引起仔豬腹瀉的主要病原之一，為革蘭陰性菌，作為腸道致病菌的代表，大腸埃希菌不僅在公共衛(wèi)生學(xué)方面具有重要的檢測(cè)意義，而且可作為消毒試驗(yàn)效果的指示菌[6]；金黃色葡萄球菌為革蘭陽(yáng)性菌，在養(yǎng)豬場(chǎng)廣泛存在，屬于條件致病菌，易引起哺乳仔豬和斷奶仔豬發(fā)生滲出性皮炎，嚴(yán)重者可能會(huì)引起敗血性死亡[7]。作為豬場(chǎng)常見(jiàn)的致病菌。大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌易引起仔豬感染發(fā)病和食品污染，不僅給養(yǎng)豬戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還威脅到了食品安全和人類健康[8-9]。因此，本研究選擇大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作為受試菌，研究過(guò)硫酸氫鉀的最佳殺菌條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)均從豬場(chǎng)送檢的病料中分離獲得，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基 牛血清白蛋白(批號(hào)：JS10780)，上海金穗生物科技有限公司產(chǎn)品；硫代硫酸鈉(CAS號(hào)7772-98-7)，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；過(guò)硫酸氫鉀(批號(hào)：091101)。

磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制：取2.83 g的無(wú)水磷酸氫二鈉和1.36 g的磷酸二氫鉀，加蒸餾水溶解，pH調(diào)至7.2，定容至1 000 mL，121℃高壓蒸汽滅菌10 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

中和劑(硫代硫酸鈉)的制備：100 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)加入300 mg硫代硫酸鈉，121℃高壓蒸汽滅菌15 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

過(guò)硫酸氫鉀消毒劑的配制：100 g/L臨用前用磷酸鹽緩沖液PBS配制成不同濃度的溶液[10]。LB液體培養(yǎng)基配制和平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 受試菌濃度的確定及計(jì)數(shù) 將凍存的大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌菌種分別接種于4 mL的含血清的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫箱中37℃培養(yǎng)12 h～18 h；用接種環(huán)取1環(huán)菌液劃線于血清瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h；觀察菌落形態(tài)，挑取典型菌落染色鏡檢、選取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行大量培養(yǎng)37℃培養(yǎng)12 h～16 h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌落計(jì)數(shù)：對(duì)獲得的菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。具體操作按照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002)和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》(GB4789.2-2016)進(jìn)行。

1.2.2 菌懸液的制備 按照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002)的要求，在菌落計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)上，調(diào)整大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的細(xì)菌數(shù)為1×107CFU/mL～5×108CFU/mL。

1.2.3 硫代硫酸鈉對(duì)過(guò)硫酸氫鉀的中和作用試驗(yàn) 《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002)要求，一種消毒劑對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行殺菌試驗(yàn)時(shí)，任選其中的一種細(xì)菌進(jìn)行中和劑鑒定，所用消毒劑的濃度應(yīng)以殺菌試驗(yàn)中的最高濃度為準(zhǔn)。將大腸埃希菌作為過(guò)硫酸氫鉀中和劑鑒定的代表菌，過(guò)硫酸氫鉀的濃度為2 500 mg/L。按1∶9的比例配制菌懸液和消毒劑，共6組。a組：消毒劑+菌懸液，用于驗(yàn)證消毒劑的殺菌效果；b組(消毒劑+菌懸液)+中和劑，用于驗(yàn)證消毒劑在殺滅細(xì)菌后能否被完全中和；c組中和劑+菌懸液，用于驗(yàn)證中和劑對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)是否有抑制作用；d組(消毒劑+中和劑)+菌懸液，用于驗(yàn)證中和產(chǎn)物對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)是否有抑制作用；e組稀釋液+菌懸液，為陽(yáng)性照組；f組稀釋液+中和劑，為陰性對(duì)照組

具體操作：將0.5 mL菌(107CFU/mL)懸液加入裝有4.5 mL消毒劑(2 500 mg/L)的試管中，室溫下作用5 min；取0.5 mL的混合液加入到裝有4.5 mL中和劑(3 g/L硫代硫酸鈉)的試管中，作用10 min；做1 000倍的稀釋，取100 μL涂布到瓊脂平板上(做兩塊板)，37℃培養(yǎng)18 h～24 h后，計(jì)算細(xì)菌菌落數(shù)。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 過(guò)硫酸氫鉀殺菌條件的研究

1.2.4.1 試驗(yàn)條件下過(guò)硫酸氫鉀的殺菌作用 用滅菌生理鹽水將大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌濃度調(diào)整至1×107CFU/mL～5×108CFU/mL，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上用滅菌PBS緩沖液將過(guò)硫酸氫鉀配制成2 500、1 250、625、312.5 mg/L。

分別研究不同濃度消毒劑、不同作用溫度、不同作用時(shí)間時(shí)，過(guò)硫酸氫鉀對(duì)受試菌的殺滅作用。具體操作如下：于滅菌試管中加入4.5 mL消毒劑和0.5 mL菌懸液(107CFU/mL)，置于設(shè)定好的溫度下分別作用一定時(shí)間(1 min或5 min)，加入4.5 mL中和劑(3 g/L硫代硫酸鈉)，混勻，作用10 min；取0.1 mL的作用液接種于瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)過(guò)硫酸氫鉀的殺菌率。每種條件下試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。陽(yáng)性對(duì)照用PBS代替消毒劑，陰性對(duì)照用PBS代替消毒劑和菌液，其他條件相同。

1.2.4.2 干擾物存在時(shí)過(guò)硫酸氫鉀的殺菌作用 按照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002)的操作進(jìn)行。分別給大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的菌懸液中分別加入牛血清白蛋白(終濃度分別為30 g/L和250 g/L)，消毒劑的殺菌溫度設(shè)定為25℃，作用時(shí)間為1、5、10 min。當(dāng)殺菌效果較低時(shí)，將消毒劑的最低殺菌濃度進(jìn)行加倍，直至產(chǎn)生明顯的殺菌效果即可，其他條件同1.2.4.1。

2 結(jié)果

2.1 中和劑的作用條件

根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002)中和劑鑒定合格判斷標(biāo)準(zhǔn)，從表1可以看出：a組沒(méi)有菌落生長(zhǎng)；b組介于a組和c、d、e組之間；c、d、e三組間的生長(zhǎng)菌落數(shù)非常相近，且誤差不超過(guò)15%；f組沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)；說(shuō)明3 g/L硫代硫酸鈉可以中和2 500 mg/L的過(guò)硫酸氫鉀，能滿足試驗(yàn)的要求。

表1 硫代硫酸鈉對(duì)過(guò)硫酸氫鉀的中和作用

2.2 試驗(yàn)條件下過(guò)硫酸氫鉀的殺菌作用條件

當(dāng)沒(méi)有有機(jī)干擾物時(shí)，在選擇的溫度條件下(37、25、4℃)，濃度為312.5 mg/L～1 250 mg/L的過(guò)硫酸氫鉀對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌(107CFU/mL)作用5 min，殺菌率可達(dá)100%，作用1 min并不能完全殺滅受試菌。當(dāng)過(guò)硫酸氫鉀濃度為2 500 mg/L時(shí)，僅需1 min對(duì)兩種試驗(yàn)菌的殺菌率可達(dá)100%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 有機(jī)物干擾時(shí)過(guò)硫酸氫鉀的殺菌作用

當(dāng)有機(jī)物(牛血清白蛋白)在菌液中的終濃度為30 g/L時(shí)，室溫下作用10 min，過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物完全殺滅大腸埃希菌(107CFU/mL)濃度為625 mg/L，而殺滅金黃色葡萄球菌的濃度為2 500 mg/L。當(dāng)菌液中有機(jī)物含量為250 g/L時(shí)，室溫下作用10 min時(shí)，濃度為625 mg/L的過(guò)硫酸氫鉀對(duì)大腸埃希菌的殺菌率為99.99%；2 500 mg/L過(guò)硫酸氫鉀對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率為99.97%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 過(guò)硫酸氫鉀對(duì)受試菌的殺滅作用

表3 有機(jī)物對(duì)過(guò)硫酸氫鉀殺滅細(xì)菌的影響

3 討論

消毒是防控細(xì)菌性疾病的有效措施，堅(jiān)持日常消毒可以減少細(xì)菌性疾病的發(fā)生，消毒劑的選擇和正確使用是取得理想消毒效果的關(guān)鍵[11]。在自然條件下，由于季節(jié)的轉(zhuǎn)變和畜舍中糞便、飼料等有機(jī)物含量的不同會(huì)影響消毒劑的殺菌效果。通過(guò)對(duì)過(guò)硫酸氫鉀消毒劑殺菌效果的研究，我們發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，溫度越高，相同濃度的過(guò)硫酸氫鉀消毒劑對(duì)同一種細(xì)菌的殺滅作用會(huì)增強(qiáng)。同樣，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺滅效果越好，消毒劑濃度越高，殺菌效果越好。同時(shí)，當(dāng)有機(jī)干擾物存在時(shí)，相同濃度的消毒劑作用效果會(huì)減弱，且過(guò)硫酸氫鉀作為消毒劑使用時(shí)對(duì)革蘭陰性菌的殺滅作用要好于革蘭陽(yáng)性菌。在生產(chǎn)中使用消毒劑對(duì)病原菌進(jìn)行殺滅時(shí)，適當(dāng)升高溫度和延長(zhǎng)作用時(shí)間，可提高消毒劑的殺菌率。相反的，當(dāng)環(huán)境溫度較高時(shí)，可適當(dāng)調(diào)低消毒劑濃度，也可達(dá)到殺滅細(xì)菌的作用，減少消毒劑的浪費(fèi)。當(dāng)畜舍中存在較多有機(jī)物時(shí)，增加消毒的濃度，可提高消毒劑的殺菌作用，濃度過(guò)低會(huì)造成病原菌不能被完全殺滅。

過(guò)硫酸氫鉀消毒劑對(duì)皮膚無(wú)刺激，對(duì)動(dòng)物無(wú)毒性損傷[12],但在水中投加量較大時(shí)，用于消毒仍有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。生產(chǎn)中要根據(jù)季節(jié)中溫度的變化和畜舍中糞便、飼料等有機(jī)物存在的多少來(lái)選擇不同濃度的過(guò)硫酸氫鉀，在對(duì)有較多有機(jī)物存在的豬場(chǎng)進(jìn)行消毒時(shí)，適當(dāng)提高消毒劑的濃度和作用時(shí)間，可取得良好的消毒效果。

[1] 陽(yáng)艷林,隆雪明.過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合粉消毒作用試驗(yàn)研究[J].中國(guó)獸藥雜志,2008,42(3):34-36.

[2] 趙 紅,蘇 靜.不同消毒劑對(duì)檢驗(yàn)科物體表面殺菌效果的比較及評(píng)價(jià)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21(19)4085-4087.

[3] 宋海鵬,余 姜.復(fù)合過(guò)硫酸氫鉀系列產(chǎn)品在水處理和水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用[J].當(dāng)代水產(chǎn)，2014(9):60-63.

[4] 朱 陣,曹明澤,張吉麗，等.細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2015,42(12):3371-3376

[5] Cha H S,Shin D H.Antibacterial capacity of cavity disinfectants againstStreptococcusmutansand their effects on shear bond strength of a self-etch adhesive [J].Dental Material J,2016,35(1):147-152.

[6] 萬(wàn)遂如.規(guī)?；i場(chǎng)主要細(xì)菌病流行狀況與防控技術(shù)[J].養(yǎng)豬，2011,6:105-110.

[7] 邵士慧,李槿年,王評(píng)評(píng),等.豬源致病性金黃色葡萄球菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2010,22(4):308-311.

[8] Andres V M,Davies R H,Davies Rob H.Biosecurity measures to control Salmonella and other infectious agents in pig farms:a review [J].Compreh Rev Food Sci Food Safety,2015,14(4):317-335.

[9] 陳 茹.陜西某豬場(chǎng)仔豬腹瀉病原菌的分離鑒定[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[10] 安云科.影響消毒劑效果的因素及選擇消毒藥的原則[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011，1(35):78-79.

[11] 付維星.過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合粉消毒劑的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[12] 楊 寧,賴發(fā)偉,劉科亮，等.過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽的殺菌效果與毒理學(xué)研究[J]中國(guó)消毒學(xué)雜志，2007，24(3):222-225.

Abstract:In the experiment,potassium monopersulfate disinfectant was choosed as the research object,EscherichiacoliandStaphylococcusaureuswere selected as trial bacteria for studying the sterilization effect of potassium monopersulfate at different temperatures,time and organics.Both bacteria(107CFU/mL) were completely killed at 37,25,4℃ for 5 minutes with disinfectant’s concentration from 312.5 mg/L to 1 250 mg/L; and in the same condition,they were completely killed after one minute with disinfectant’s concentration at 2 500 mg/L.there were 30 g/L organics in bacteria suspension,E.coliwere completely killed at 25℃ for 10 min with disinfectant’s concentration at 625 mg/L; andS.aureuscompletely killed with disinfectant’s concentration at 2 500 mg/L.In the same condition,there were 250 g/L organics in bacteria suspension,the killing rate ofE.coliis 99.99% andS.aureusis 99.97%.This study provided the basis for using potassium monopersulfate effectively.

Keywords:potassium monopersulfate;E.coli;S.aureus; disinfection effect

StudyonOptimumSterilizationConditionsofPotassiumMonopersulfateCompound

FENG Xiu1,WANG Ai-ling1,ZHANG Zhen-cang2,ZHANG Wei-min1,ZHOU Hong-chao1, ZHANG Yan-ming1,GUO Kang-kang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China; 2.YanglingVocational&TechnicalCollege,Yangling,Shaanxi,712100,China)

S859.7991

A

1007-5038(2017)08-0039-04

2017-01-05

陜西省重點(diǎn)農(nóng)業(yè)科技示范推廣項(xiàng)目(ZDKJ-2014-33)

馮 秀(1991-)，女，陜西延川人，碩士研究生，主要從事豬重要疫病防控研究。王愛(ài)玲(1990-)，女，山東臨沂人，碩士，主要從事豬重要疫病防控技術(shù)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者*