新加大黃附子湯對(duì)小鼠原位移植肝癌的治療作用

李自波，姚靜靜，杜振華， 杜鋼軍

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004

新加大黃附子湯對(duì)小鼠原位移植肝癌的治療作用

李自波，姚靜靜，杜振華， 杜鋼軍

河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004

〔目的〕 觀察新加大黃附子湯對(duì)小鼠原位移植肝癌是否具有治療效果。〔方法〕 建立小鼠原位移植肝癌模型，造模小鼠隨機(jī)分組，次日用新加大黃附子湯灌胃開始治療，觀察小鼠的生存狀態(tài)，用藥40 d后測(cè)量小鼠肝臟的質(zhì)量，計(jì)算腫瘤的體積，檢測(cè)血清 CEA腫瘤標(biāo)志物, HE染色檢測(cè)小鼠肝臟病理變化?！步Y(jié)果〕 模型組小鼠原位移植肝癌的致瘤率為95%，小鼠自主活動(dòng)、體溫都偏低，40 d存活率只有45%，腫瘤體積較大；新加大黃附子湯治療的小鼠致瘤率為75%，小鼠的自主活動(dòng)、體溫都高于模型組，40 d存活率達(dá)到70%，肝臟腫瘤體積明顯小于模型組(P<0.05)；CEA腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)給藥組含量明顯低于模型組(P<0.05)?！步Y(jié)論〕新加大黃附子湯對(duì)小鼠原位移植肝癌具有治療作用。

新加大黃附子湯；肝癌；原位移植；治療作用

Abstract: 〔Objective〕To observe therapeutic effect of the new added Dahuangfuzi Decoction on orthotopic liver cancer in mice.〔Methods〕The mice were divided into different groups randomly after orthotopic liver cancer model in mice was established.The mice were received the new added Dahuangfuzi Decoction via intragastric administration at the second day following tumor inoculation. The survival status of mice was observed every day. The tumor volume and liver weight were measured after 40 days. The concentration of CEA in the serum was detected and the liver pathological changes were observed by HE staining.〔Results〕The tumorigenicity rate in the model group was 95%.The autonomic activities and the temperature of the model group were lower than the therapeutic group, and the survival rate was only 45%. The tumorigenicity rate in the therapeutic group was 75% and the survival rate was 70%. Compared with the model group, the concentration of CEA and tumor volume in the therapeutic group were obviously lower(P<0.05).〔Conclusion〕The new added Dahuangfuzi Decoction have therapeutic effect on orthotopic liver cancer in mice.

Keywords: the new added dahuangfuzi decoction; liver cancer； orthotopic; therapeutic effect

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，初期癥狀并不明顯，晚期主要表現(xiàn)為肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等癥狀。由于肝癌起病隱匿，發(fā)展迅速，在臨床上得到確診往往已經(jīng)是晚期。我國(guó)的肝癌通常是以肝炎和肝硬化為背景的[1]，積極探尋符合我國(guó)國(guó)情，高效并且不良反應(yīng)少的系統(tǒng)化中西醫(yī)聯(lián)合治療方案是肝癌治療的重要課題。中醫(yī)認(rèn)為，肝癌的病因及病理為外受寒邪、損傷脾胃、肝氣郁滯、氣滯血瘀、結(jié)而成積[2]，所以，對(duì)于肝癌的治療應(yīng)以解毒活血和補(bǔ)虛扶正相結(jié)合。

在我國(guó)，中醫(yī)治療肝癌有著悠久的歷史和豐富的經(jīng)驗(yàn)。春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期的《黃帝內(nèi)經(jīng)》、《張氏醫(yī)通》對(duì)肝癌的病理和癥狀都有明確的描寫。對(duì)于治療肝癌的復(fù)方中藥也有很多，例如全蟲散、退黃消漲方、雙半煎等。中醫(yī)能夠根據(jù)肝癌的不同體征，合理配伍中藥，從而最大限度地保護(hù)肝功能、減少病發(fā)癥、提高患者生命質(zhì)量。本研究采用大黃、附子、肉桂、吳茱萸組成的新加大黃附子湯，通過用原位移植肝癌小鼠模型來(lái)評(píng)價(jià)新加大黃附子湯對(duì)肝癌的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

昆明種小鼠45只，雄性，6周齡，體質(zhì)量(20～25)g，由河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠肝癌細(xì)胞株H22，由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 戊巴比妥鈉、多聚甲醛、蘇木精、伊紅(美國(guó)Sigma)；醫(yī)用OB吻合膠(開封市天濟(jì)大藥房)；大黃、附子、肉桂、吳茱萸(開封市天濟(jì)大藥房)。

1.2.2 儀器 電子天平(上海精密儀器有限公司天平儀器廠)；電子體溫計(jì)(香港泰克曼電子儀器有限公司)；ZH-YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；正置顯微鏡XDS-500D(奧林巴斯，日本東京)；KD202C轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司)

1.3 新加大黃附子湯的準(zhǔn)備

稱取大黃20克，附子、肉桂、吳茱萸各10 g(即按照2∶1∶1∶1進(jìn)行組方)，加入20倍水，浸泡30 min，然后煎煮30 min，共煎煮3遍。將 3 次的水煎液綜合，加熱濃縮至 200 mL，使水煎液濃度為1 g/4 mL。

1.4 小鼠原位移植肝癌模型的建立

取腹水型H22細(xì)胞，配制成濃度為1×107的細(xì)胞混懸液，每只小鼠腋下接種0.2 mL，在一周后腫瘤生長(zhǎng)至直徑1 cm時(shí)進(jìn)行原位移植，在無(wú)菌狀態(tài)下取出瘤組織，放在生理鹽水中去除外周纖維組織、壞死組織及血管，然后將其切成2 mm3瘤塊。將40只小鼠用0.005 g/mL的戊巴比妥鈉溶液，每只0.1 mL/10 g腹腔注射使其麻醉，小鼠仰臥位固定于鼠板，消毒之后，沿腹中線剪開，露出肝臟，用眼科沙眼鏟在肝左外葉中間部位沿肝葉平面約20度角輕輕戳一個(gè)約3 mm深度的隧道,用彎聶夾取小瘤塊,送入隧道內(nèi)[4],用醫(yī)用OB吻合膠局部外用止血，最后縫合傷口，并涂抹金霉素眼膏防止傷口感染。

1.5 分組與給藥

在小鼠手術(shù)后24 h，將40只小鼠隨機(jī)分為2組，模型組和給藥組各20只。模型組，每天用灌胃法以0.2 mL/10 g蒸餾水給小鼠灌胃。給藥組， 每天用灌胃法以0.2 mL/10 g的劑量給小鼠5 g/kg 的新加大黃附子湯，每次灌喂前都要稱重，連續(xù)給藥40 d。

1.6 日常觀察

每日密切觀察兩組小鼠的情況，測(cè)量小鼠的體溫和自主活動(dòng)；對(duì)40 d內(nèi)死亡的小鼠的死亡日期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7 指標(biāo)測(cè)定

處理小鼠前，統(tǒng)計(jì)小鼠的存活數(shù)；脫臼法處理小鼠，收集血液，檢測(cè)癌胚抗原含量；解剖取肝臟，觀察小鼠肝臟長(zhǎng)瘤情況，稱重、拍照；用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，根據(jù)公式計(jì)算出腫瘤的體積[3]：腫瘤體積=a×b2/2；將收集的小鼠肝臟做好標(biāo)記，浸泡在體積分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液中，2 d后用乙醇脫水，二甲苯透化，石蠟包埋，然后切5μm片做HE染色，觀察小鼠肝臟組織的病理情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠肝癌原位移植瘤的影響

從圖1中可以看出，小鼠肝臟接瘤處有乳白色結(jié)節(jié)，腫瘤形態(tài)相對(duì)規(guī)則，呈圓形或橢圓形，腫瘤有包膜或薄膜不完整；對(duì)小鼠腫瘤組織的體積進(jìn)行計(jì)算，模型組的腫瘤平均體積為2.795 cm3，給藥組的平均體積為1.436 cm3。從圖2中可以看出，給藥組的腫瘤體積小于模型組，且有顯著性差異(P<0.01)；模型組肝臟的平均質(zhì)量為6.867 g，給藥組的平均質(zhì)量為3.807 g，給藥組的肝臟質(zhì)量小于模型組，且有顯著性差異(P<0.05)。見圖3。

2.2 對(duì)血清中CEA腫瘤標(biāo)志物的影響

模型組小鼠CEA腫瘤標(biāo)志物的含量為2.807 mg/L，給藥組小鼠CEA腫瘤標(biāo)志物的含量為2.341 mg/L，從圖4可看出給藥組的CEA腫瘤標(biāo)志物的含量小于模型組，且有顯著性差異(P<0.05)。

圖1 小鼠肝癌生長(zhǎng)情況

圖2 小鼠的腫瘤體積

圖3 小鼠的肝臟質(zhì)量

2.3 對(duì)小鼠存活率的影響

從圖5中可以看出小鼠在第8天開始出現(xiàn)死亡，與模型組相比給藥組的存活時(shí)間更長(zhǎng)，在給藥40 d時(shí)，模型組的存活率為45%，給藥組的存活率為70%。

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)HE染色

對(duì)小鼠肝臟的非接瘤區(qū)進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)模型組多出現(xiàn)細(xì)胞核密集的區(qū)域，細(xì)胞核較大，而且有炎癥滲出物，而給藥組細(xì)胞核密集的區(qū)域相對(duì)較少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。見圖6。

圖4 血清CEA的含量

圖5 小鼠的的存活時(shí)間

圖6 小鼠肝組織病理學(xué)HE染色

2.5 對(duì)小鼠自主活動(dòng)、體溫的影響

如圖7所示，兩組小鼠的自主活動(dòng)都呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，但給藥組的下降趨勢(shì)更加緩慢；在圖8中，可以看出給藥組的腹部溫度明顯高于模型組，中藥復(fù)方水煎液對(duì)小鼠體溫有一定的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

小鼠肝癌細(xì)胞株(H22)是最常用的小鼠可移植性腫瘤細(xì)胞系之一,廣泛應(yīng)用于小鼠肝癌動(dòng)物模型的復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)采用昆明鼠腋下接種腹水型H22細(xì)胞，再將腫瘤組織移植到正常小鼠肝臟內(nèi)，建立小鼠原位移植肝癌模型[4]。原位移植肝癌小鼠模型能更好地模仿肝癌在體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境，更適用于肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的研究。

圖7 小鼠自主活動(dòng)的變化

圖8 小鼠腹溫的變化

大黃附子湯載于 《金匱要略·腹?jié)M寒疝宿食病脈證》篇,由大黃、附子、細(xì)辛組成，具有溫里散寒,通便止痛的功效?，F(xiàn)代藥理研究[5]發(fā)現(xiàn),大黃附子湯在治療膽囊炎中，具有減少疼痛，消退黃疸，減輕肝腎衰竭的癥狀，凡屬素體陽(yáng)虛,寒邪內(nèi)聚所致的“陰結(jié) ”雜癥,運(yùn)用該方都可以得到顯著的治療效果。中醫(yī)[6]認(rèn)為，“陽(yáng)虛寒凝”是惡性腫瘤的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制，而新加大黃附子湯去除細(xì)辛避免了它對(duì)腎功能的損害。肝癌發(fā)病時(shí)通常寒邪凝滯引起疼痛，復(fù)方中新加的肉桂、吳茱萸都屬于溫里藥，具有散寒、止痛的作用，能對(duì)抗體內(nèi)的寒邪，同時(shí)又能起到補(bǔ)陽(yáng)、回陽(yáng)的作用。本研究通過用肝癌小鼠模型評(píng)價(jià)新加大黃附子湯對(duì)肝癌的治療作用，發(fā)現(xiàn)新加大黃附子湯可以改善荷瘤小鼠精神狀態(tài)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)，減少腫瘤的浸潤(rùn)，從而延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活時(shí)間。

綜上所述，新加大黃附子湯在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面已經(jīng)得到了顯著的治療效果，可能成為臨床上治療肝癌的好方劑。

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[責(zé)任編輯時(shí)紅]

ThetherapeuticeffectofthenewaddedDahuangfuziDecoctiononorthotopiclivercancerinmice

LI Zibo , YAO Jingjing ,DU Zhenhua, DU Gangjun

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

R735.7

A

1672-7606(2017)03-0156-04

2016-11-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173094)

李自波(1993-)，男，河南盧氏人，在讀研究生，研究方向：中藥藥理學(xué)與腫瘤藥理學(xué)。