土壤中茄科雷爾氏菌實時熒光定量PCR快速檢測體系的建立與應用

張海燕　張小芳　魏蘭芳

摘要：根據(jù)茄科雷爾氏菌eg1基因，設計1對特異性引物，建立并優(yōu)化實時熒光定量PCR反應體系，并對土壤中的茄科雷爾氏菌進行檢測和評估。對采自云南省文山州5個縣的100份青枯病帶菌土壤進行檢測，結果表明，100份土壤樣品中，廣南縣15、22、24號，丘北縣31、35、43號，麻栗坡縣62、67、68號，馬關縣70、74、78、79、80、83、84號，共16份土壤樣品中茄科雷爾氏菌含量大于105 CFU/mL，預測細菌性青枯病發(fā)病風險較高；廣南縣12、20、21、23、26、27、29號，丘北縣30、33、34、37、38、39、46、48號，麻栗坡縣50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69號，馬關縣71、72、73、75、76、77、81、82、85、86號，硯山縣1、2、4、5、7、9號，共43份土壤樣品檢測出的茄科雷爾氏菌含量在104～105 CFU/mL之間，預測細菌性青枯病發(fā)病風險中等；其他土壤樣品檢測出的茄科雷爾氏菌含量均小于103 CFU/mL，預測細菌性青枯病發(fā)病風險低，其中硯山縣3、10、87、88、89、90號，廣南縣14、19、25、28、91、92、93號，丘北縣32、36、44、49、94、95、96號，麻栗坡縣51、57、97、98、99、100號，共26份土壤樣品中未檢測出茄科雷爾氏菌。

關鍵詞：茄科雷爾氏菌；實時熒光定量PCR檢測；快速檢測體系；細菌性青枯病

中圖分類號： S432.4+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0017-03

茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病原細菌之一，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。該病原細菌的寄主范圍較廣，可侵染55科數(shù)百種植物[1]。在我國，已報道有番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯、煙草、花生、生姜、沙姜、桑、蕹菜、桉樹等10余種作物受到該病原細菌的危害，造成細菌性青枯病。該病原菌主要在土壤中及遺落土中的病株殘體上越冬，通過根部﹑葉柄或莖部的傷口侵入后，在維管束內繁殖，并沿維管束向上發(fā)展，以致維管束阻塞，腐爛變褐，莖、葉因得不到水分、養(yǎng)分的供應而萎蔫[2]。調查研究表明，由該病原菌造成的煙草青枯病極為嚴重，給我國西南地區(qū)及長江下游流域的煙草生產(chǎn)帶來了很大威脅[3]。其中個別年份煙草青草枯病暴發(fā)流行，發(fā)病重的地塊，產(chǎn)量損失達 80%左右，造成毀滅性損失[4]。此外，受該病原菌感染的番茄、茄子、辣椒等茄科作物的產(chǎn)量會大幅減少，帶來嚴重的經(jīng)濟損失[5-7]。因此，對溫室或大田可能存在的病菌進行早期檢測，對于適時控制病害的發(fā)生有著極為重要的意義。

近年來，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，實時熒光定量PCR技術在植物病害研究上也不斷深入并廣泛在多種病原菌定量檢測中應用，極大地提高了植物病害的檢測效率[8-11]。Nicholson等利用實時熒光定量技術建立了小麥莖基部病原物的定量檢測方法[12]；潘娟娟等利用 RT-PCR 技術建立了定量檢測小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）潛伏侵染的方法，對小麥條銹病進行早期檢測，指導病害的預測[13-14]。目前，國內外未有利用該方法對茄科雷爾氏菌進行檢測的報道，本研究擬查閱文獻并分析茄科雷爾氏菌基因序列的保守區(qū)，設計相關的熒光定量PCR的特異性引物，并應用建立的方法對采自云南省各個地區(qū)土壤中的病原菌進行早期檢測。

1材料與方法

1.1試驗材料

茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）標準菌株Y45，由云南省農業(yè)科學煙草研究院提供；軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum）MY9，由筆者實驗室保存；細菌基因組DNA提取試劑盒（BioTeke），購自生工生物工程（上海）股份有限公司；土壤DNA提取試劑盒（美國MO BIO），購自北京寶杰羅生物科技有限公司；PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成；TaKaRa SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）試劑盒，購自寶生物工程 （大連） 有限公司；熒光定量PCR儀器（BIO-Rad IQTM5），由云南農業(yè)大學生物多樣性國家工程中心提供。

云南省文山州5個縣（廣南縣、丘北縣、麻栗坡縣、馬關縣、硯山縣）的100份土壤樣品，由云南省文山州煙草公司協(xié)助采集。

1.2試驗方法

1.2.1茄科雷爾氏菌標準菌株DNA提取與檢測使用細菌基因組DNA提取試劑盒（BioTeke）提取茄科雷爾氏菌標準菌株Y45的DNA，于微量分光光度計下檢測DNA濃度及D260 nm/D280 nm值，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2土壤DNA提取與檢測使用土壤DNA提取試劑盒（美國MO BIO）進行土壤中煙草青枯病病菌基因組DNA的提取，具體操作步驟參照試劑盒說明書。提取結果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查。Nano Drop 2000超微量分光光度計檢測土壤總DNA濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3引物設計與合成使用PrimerPremier 5.0，根據(jù)GenBank中茄科雷爾氏菌eg1基因部分序列設計1對引物 RS-1：5′-GTGCCTGCCTCCAAAACGACT-3′；RS-2：5′-GACGCCACCCGCATCCCTC-3′，PCR引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.4引物特異性檢測以茄科雷爾氏菌標準菌株Y45的DNA為模板，標準菌株Y45的基因組DNA為陽性對照，軟腐果膠桿菌MY9的DNA為陰性對照，ddH2O為空白對照，應用引物RS-1、RS-2進行普通PCR 和RT-PCR擴增，檢測引物特異性。endprint

茄科雷爾氏菌普通PCR反應體系：2.5 μL Buffer，2.0 μL dNTP Mix，引物RS-1、RS-2各0.5 μL，1.0 μL Taq Enzyme，25 μL DNA模板，ddH2O補足25.0 μL。反應條件：95 ℃預變性1 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像系統(tǒng)分析試驗結果。

茄科雷爾氏菌RT-PCR反應體系：引物RS-1、RS-2各0.5 μL，12.5 μL SYBR Premix Ex Taq，2.0 μL DNA模板，ddH2O補足20.0 μL。

1.2.5RT-PCR標準曲線的建立及引物靈敏度檢測取茄科雷爾氏菌Y45的DNA，并將DNA進行梯度稀釋，即取 10 μL DNA加入到90 μL ddH2O中，把DNA的濃度稀釋成10-1，并依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，以ddH2O為空白對照，RT-PCR反應體系參照“1.2.4”節(jié)中青枯病菌 RT-PCR的反應體系。

1.2.6土壤樣品中茄科雷爾氏菌的熒光定量PCR檢測反應體系參照“1.2.4”節(jié)中青枯病菌RT-PCR的反應體系。

2結果與分析

2.1引物特異性檢測結果

用所設計的引物 RS-1、RS-2 對茄科雷爾氏菌標準菌株Y45的DNA進行PCR擴增，結果（圖1）表明，僅茄科雷爾氏菌Y45菌株基因組DNA能擴增出290 bp的特異性條帶，與預測結果一致。說明所設計的引物具有特異性，能夠區(qū)別于其他病原菌。

2.2土壤樣品中青枯病菌的熒光定量PCR檢測結果

由表1可知，100份土壤樣品中，廣南縣15、22、24號，丘北縣31、35、43號，麻栗坡縣62、67、68號，馬關縣70、74、78、79、80、83、84號，共16份土壤樣品中檢測到的茄科雷爾氏菌含量較高（大于105 CFU/mL），預測細菌性青枯病發(fā)病風險較[CM（25]高；廣南縣12、20、21、23、26、27、29號，丘北縣30、33、34、37、38、39、46、48號，麻栗坡縣50、52、54、58、59、60、61、63、64、65、66、69號，馬關縣71、72、73、75、76、77、81、82、85、86號，硯山縣1、2、4、5、7、9號，共43份土壤樣品中檢測出的茄科雷爾氏菌含量在104～105 CFU/mL之間，預測細菌性青枯病發(fā)病風險中等；其他土壤樣品檢測出的茄科雷爾氏菌含量均小于103 CFU/mL，預測細菌性青枯病發(fā)病風險低，其中硯山縣3、10、87、88、89、90號，廣南縣14、19、25、28、91、92、93號，丘北縣32、36、44、49、94、95、96號，麻栗坡縣51、57、97、98、99、100號，共26份土壤樣品中未檢測出茄科雷爾氏菌。

3討論

茄科雷爾氏菌（R. solanacearum）是一種危害嚴重的土傳病害病原菌，具有非常廣泛的宿主范圍，在世界各地均有分布[15]，其中以茄科中的寄主種類最多，茄科雷爾氏菌可以引起茄科作物上重要的細菌性病害，在嚴重發(fā)生的年份甚至造成絕收[16]。因此，在發(fā)病前快速、準確地檢測田間土壤中茄科雷爾氏菌的數(shù)量和動態(tài)變化規(guī)則能為該病的測報、防治策略或防控措施的制定和應用，以及品種田間抗性評價提供重要的科學依據(jù)[17]。

傳統(tǒng)的茄科雷爾氏菌檢測方法存在檢測周期長、操作復雜、靈敏度不高等缺點，不能較好地滿足檢測工作的要求。隨著分子生物學技術的發(fā)展，實時熒光定量PCR技術具有快速、靈敏度高、特異性強的特點，可高通量定量檢測土壤中病原菌數(shù)量，可提前對煙草等茄科細菌性青枯病發(fā)生風險進行評估，已經(jīng)廣泛運用于多種土傳病原菌的快速檢測研究領域中[18]。本研究中建立的茄科雷爾氏菌的實時熒光定量PCR快速檢測體系，為該病原菌的快速檢測提供了新的方法，且能夠實時監(jiān)測作物病害發(fā)生發(fā)展過程中病原菌的動態(tài)變化，為病原菌的預測預報及病害防控奠定了基礎。

4結論

本研究利用實時熒光定量PCR建立了茄科雷爾氏菌的快速檢測技術體系，并用該方法對來自云南省文山州5個縣的100份土壤樣品進行了檢測，16份土壤中茄科雷爾氏菌總數(shù)均大于105 CFU/mL，預測細菌性青枯病發(fā)生風險較高；43份土壤樣品檢測出的茄科雷爾氏菌含量在104～105 CFU/mL之間，預測細菌性青枯病發(fā)病風險中等；15份土壤樣品檢測出的茄科雷爾氏菌含量均小于103 CFU/mL，預測細菌性青枯病發(fā)病風險低；其余26份土壤樣品中未檢測出茄科雷爾氏菌。

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