穗花杉的轉(zhuǎn)錄組測序及其轉(zhuǎn)錄組特性分析

王 帥,邵芬娟,李 論,蘆 強,邱德有*

(1.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091； 2.廣西桂林小廬山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，廣西 桂林 541205)

穗花杉的轉(zhuǎn)錄組測序及其轉(zhuǎn)錄組特性分析

王 帥1,邵芬娟1,李 論2,蘆 強1,邱德有1*

(1.中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所，北京 100091； 2.廣西桂林小廬山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，廣西 桂林 541205)

目的通過對紅豆杉科穗花杉屬的穗花杉進行轉(zhuǎn)錄組測序，為穗花杉的萜類合成途徑和分類學研究提供支持。方法利用HiSeq2500技術對穗花杉的莖葉進行轉(zhuǎn)錄組測序。結果穗花杉轉(zhuǎn)錄組測序共得到8.14 Gb的clean data。從頭組裝共獲得82 884條unigene，其中有27 495條unigene被注釋。此外，在82 884條unigene 中共搜索到2 827個SSR位點，單核苷酸重復SSR出現(xiàn)頻率最高(60.1%)，其次為三核苷酸重復SSR(25.4%)。在穗花杉unigene中挖掘出了1個牦牛兒基焦磷酸合成酶(GPS)、1個法尼烯基焦磷酸合成酶(FPS)和5個牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)的同源基因，同時得到紫杉二烯合成酶(TS)同源基因13個。結論發(fā)現(xiàn)了20個與萜類合成有關的unigene和2 827個SSR位點，為今后穗花杉萜類生物合成研究，特別是紫杉二烯合成酶編碼基因的研究打下了基礎，也為該物種系統(tǒng)分類地位及遺傳多樣性研究提供了新的遺傳信息。

穗花杉；轉(zhuǎn)錄組；SSR；萜類合成基因；分類

Abstract:[Objective]The transcriptome ofAmentotaxusargotaenia(Hance) Pilger ofAmentotaxusinTaxaceaewas sequenced and analyzed for its terpenoid biosynthetic pathway and taxonomy research. [Method] The transcriptome of the mixture of stem and leave ofA.argotaeniawas sequenced by using HiSeq2500. [Result]8.14 Gb clean data was obtained from the transcriptome ofA.argotaenia. 82 884 unigene were obtained and 27 495 unigene were annotated using the six public databases. Besides, 2 827 SSRs were identified from the 82 884 unigene. The most abundant type of repeat motif was mono-nucleotides (60.1%), followed by tri-nucleotides (25.4%). Among the unigenes ofA.argotaenia, one homologous gene of geranyl diphosphate synthase (GPS), one homologous gene of farnesyl diphosphate synthase (FPS) and five homologous genes of geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPS) were identified. In addition, 13 homologous genes to taxadiene synthase gene (TS) inTaxuswere obtained using TBLASTN. [Conclusion] In this study, 20 unigenes relating to terpenoid biosynthesis and 2 827 SSRs were identified inA.argotaenia. Our work will facilitate the study about the terpenoid biosynthetic genes especially taxadiene synthase gene inA.argotaeniaand may provide some foundational genetic data to study its taxonomy and diversity.

Keywords:Amentotaxusargotaenia；transtriptome；SSR；terpenoid biosynthesis pathway gene；taxonomy

穗花杉屬(Amentotaxus)是紅豆杉科(Taxaceae)的一個屬，作為一個非常古老的家系存在于歐亞大陸。在第三紀和第四紀冰川時代，穗花杉屬經(jīng)歷了多次群體擴張和緊縮，也因此形成了如今的分布格局[1]。穗花杉(Amentotaxusargotaenia(Hance) Pilger)是穗花杉屬的一個種，有“冰川元老”的美稱，主要分布于我國南部地區(qū)，以福建、江西、廣東等省為主，也是我國三級重點保護的珍稀瀕危植物。

在裸子植物系統(tǒng)分類上，穗花杉具有很重要的研究價值，因為研究者們從穗花杉被發(fā)現(xiàn)以來，一直對它的分類地位有爭論[2]。早在1883年Hance發(fā)現(xiàn)穗花杉將其定名發(fā)表，并將其置于羅漢松屬(Podocarpus)內(nèi)[3]。20世紀初，Pilger根據(jù)穗花杉小孢子葉球形態(tài)，將它轉(zhuǎn)入三尖杉屬(Cephalotaxus)[4]。但是，隨后Pilger根據(jù)穗花杉雄狀花序的形態(tài)特征將穗花杉單獨列為三尖杉科(Cephalotaxaceae)的一個屬─穗花杉屬[5]。1931年，通過觀察穗花杉生殖器官的形成特征，工藤認為它應該成立一個穗花杉科或是作為紅豆杉科的一個亞科或族[6]。1951年，F(xiàn)lorin發(fā)現(xiàn)三尖杉屬和穗花杉屬間的氣孔結構和大孢子葉球有差異，所以將穗花杉屬歸入紅豆杉科。我國植物學者也在上世紀從各個學科領域?qū)λ牖ㄉ嫉南到y(tǒng)分類學做了大量的研究[7]。其中，馬忠武發(fā)現(xiàn)穗花杉屬植物不含有紅豆杉屬和榧樹屬的植物中存在的雙黃酮類特征化學成分，所以他對穗花杉屬歸于紅豆杉科提出懷疑[8]。

為了為穗花杉的研究提供基因?qū)用娴臄?shù)據(jù)，本研究利用HiSeq2500技術對穗花杉莖葉進行了轉(zhuǎn)錄組測序。穗花杉轉(zhuǎn)錄組測序共得到約8.14 Gb的clean data，從頭拼接后共獲得82 884條Unigene和140 286條Transcript。通過功能注釋，得到了萜類合成相關基因，以及紫杉二烯合成酶的同源基因。同時預測了穗花杉轉(zhuǎn)錄組序列的SSR位點。這為今后穗花杉萜類次生代謝和穗花杉分類學地位的研究奠定了一定的基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料

穗花杉材料由桂林小廬山生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供。盆栽于中國林業(yè)科學研究院溫室里。取當年生單株帶葉的枝條，采集后立即放入液氮中，之后存于-80℃冰箱中待用。

1.2cDNA文庫構建與轉(zhuǎn)錄組測序

總RNA的提取采用OmegaTotalRNAkitII(Omega,USA)試劑盒，按照實驗說明書操作。分別采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整性。樣品的RIN值>7。總RNA檢測合格后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，再將mRNA隨機打斷成小片段。以片段化的mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，純化后進行末端修復、加A尾和接頭。經(jīng)過片段大小篩選后，通過PCR擴增富集得到cDNA文庫。構建好的文庫利用IlluminaHiSeq2500進行測序。

1.3序列組裝與拼接

得到測序數(shù)據(jù)后，對rawread進行數(shù)據(jù)過濾，去除其中的接頭序列及低質(zhì)量read獲得高質(zhì)量的cleanread(質(zhì)量值Q<20的堿基數(shù)占整個read的50%以上)。得到的cleanread利用Trinity[9]進行從頭拼接成為片段(contig)，參數(shù)選用Trintity的省缺參數(shù)Kmer=25。然后，拼接好的片段進一步整合成為轉(zhuǎn)錄本和unigene。

1.4基因功能注釋

使用BLASTx軟件將拼接得到的unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，使用KOBAS2.0[10]得到unigene在KEGG中的KEGGOrthology結果，預測完unigene的氨基酸序列之后使用HMMER[11]軟件與Pfam[12]數(shù)據(jù)庫比對，獲得unigene的注釋信息。

1.5SSR位點分析

使用MISA軟件分析穗花杉unigene序列可以得到6種類型的SSR：單堿基重復SSR、雙堿基重復SSR、三堿基重復SSR、四堿基重復SSR、五堿基重復SSR、六堿基重復SSR。這六種類型SSR設置的參數(shù)分別是重復10、6、5、5、5和5次。

1.6萜類合成相關基因的分析

利用歐洲紅豆杉(TaxusbaccataL.)紫杉醇生物合成關鍵酶-紫杉二烯合成酶 (Taxadienesynthasegene,TbTS)蛋白質(zhì)的氨基酸序列對本地穗花杉轉(zhuǎn)錄組進行TBLASTN分析[13]。比對參數(shù)為E值<1e-25。

2 結果與分析

2.1測序和從頭組裝

利用IlluminaHiSeq2500技術對穗花杉莖葉進行轉(zhuǎn)錄組測序后，獲得了32321978個reads片段，包含了8141132186個核苷酸序列信息。質(zhì)量值Q≥30堿基數(shù)占所有read的堿基數(shù)的比例即Q30%為89.91%。穗花杉轉(zhuǎn)錄組測序共得到約8.14Gb的cleandata，組裝得到4898457條序列重疊群(Contig)，總長度約為261826164bp，平均長度及N50分別為53.45bp和48bp。進一步對Contigs進行拼接后，共獲得82884條Unigene序列和140286條Transcript序列，總長度為分別為55775850bp和143129259bp，平均長度為673bp和1020bp，N50的長度為1314bp和1932bp。長度大于1000bp的Unigene和Transcript序列分別占到18.14%和34.39%(表1)。

表1 穗花杉轉(zhuǎn)錄組從頭組裝結果統(tǒng)計

2.2功能注釋

為了能夠直觀地研究穗花杉轉(zhuǎn)錄組信息，將所拼接得到的82884條unigene分別與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對分析。結果顯示，共有27495條unigene至少被一個數(shù)據(jù)庫注釋，占unigene總數(shù)的30.14%(表2)。

表2 穗花杉unigene功能注釋統(tǒng)計

利用COG數(shù)據(jù)庫對得到的82 884條穗花杉unigene進行功能注釋，其中被注釋到的unigene一共有8 206條，分別被注釋到24個COG分類中。其中，“一般功能基因”(General function prediction only)、“復制、重組和修復”(Replication, recombination and repair)和“轉(zhuǎn)錄”(Transcription)是最大的3個類群，分別有2 141、1 534和951條unigene。然而，“核結構”(Nuclear structure)是最小的類群，只有1條unigene(圖1)。

J：翻譯，核糖體結構和生物合成；A：RNA加工和修飾；K：轉(zhuǎn)錄；L：復制，重組和修復；B：染色體的結構和動態(tài)；D：細胞周期控制，細胞分裂，染色體分離；Y：核結構；V：防御機制；T：信號轉(zhuǎn)導機制；M：細胞壁/膜/胞外被膜；N：細胞運動；Z：細胞骨架； U：細胞內(nèi)運輸，分泌和囊泡運輸；O：翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊，分子伴侶；C：能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換；G碳水化合物的運輸和代謝；E：氨基酸的運輸和代謝；F：核苷酸的運輸和代謝；H：輔酶的運輸和代謝；I：脂質(zhì)的運輸和代謝；P：無機鹽的運輸和代謝；Q：次生代謝物的生物合成、運輸及分解代謝；R：一般功能預測；S：功能未知。J: Translation, ribosomal structure and biogenesis; A: RNA processing and modification; K: Transcription; L: Replication, recombination and repair; B: Chromatin structure and dynamics; D: Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; Y: Nuclear structure; V: Defense mechanisms; T: Signal transduction mechanisms; M: Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N: Cell motility; Z: Cytoskeleton; W: Extracellular structures; U: Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; O: Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; C: Energy production and conversion; G: Carbohydrate transport and metabolism; E: Amino acid transport and metabolism; F: Nucleotide transport and metabolism; H: Coenzyme transport and metabolism; I: Lipid transport and metabolism; P: Inorganic ion transport and metabolism; Q: Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R: General function prediction only; S: Function unknown.圖1 穗花杉轉(zhuǎn)錄組Unigene的COG功能聚類Fig.1 COG function classification of the unigenes in A. argotaenia transcriptome

對82 884條unigene進行GO功能注釋表明，其中有13 453條unigene分別注釋到51個功能組，歸納為生物學過程(Biological Process)、細胞組分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)三大部分，分別含有20、16及15個功能組。在生物學過程部分中，差異表達基因在代謝過程(metabolic process)和細胞過程(cellular process)功能組中注釋的unigene數(shù)目最多，分別為8 846和7 206條；在細胞組分部分中，細胞部分(cell part)和細胞(cell)功能組差異基因數(shù)目最多，分別為5 609和5 551條；在分子功能部分中，催化活性(catalytic activity)和結合(binding)功能組分別含有6 989和6 676條(圖2)。

圖2 穗花杉轉(zhuǎn)錄組的Unigene GO功能分類Fig.2 Gene Ontology of the uUnigenes in A. argotaenia transcriptome

為了能夠把穗花杉的基因信息作為一個整體的網(wǎng)絡進行研究，我們利用KEGG數(shù)據(jù)庫對穗花杉轉(zhuǎn)錄組進行分析。其中，代謝途徑(ko01100)和次生代謝生物合成(ko01110)中的unigene數(shù)最多，分別為1 477和664條，這為查找特定次生代謝途徑中的基因提供了很好的基礎。

2.3SSR分析

利用MISA軟件搜索穗花杉的15032條Unigene，共在2420條unigene中搜索到2827個SSRs位點。具有1個以上SSRs的unigene是339條。單核苷酸重復SSR出現(xiàn)頻率最高(60.1%)，其次為三核苷酸(25.4%)和二核苷酸(12.5%)。其它三種類型的都很少：四核苷酸(0.9%)、五核苷酸(0.6%)、六核苷酸(0.5%)(表3)。

2.4萜類合成相關基因分析

利用KEGG通路中的基因信息查找被KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的穗花杉unigene，獲得牦牛兒基焦磷酸合成酶(GPS)、法尼基焦磷酸合成酶(FPS)和牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸合成酶(GGPS)的同源基因，分別為1、1和5個(圖3)。利用紫杉二烯合成酶TbTS基因序列對穗花杉本地轉(zhuǎn)錄組進行BLAST分析，得到13個同源基因，這為今后進一步驗證穗花杉中是否存在紫杉二烯合成酶提供了基因基礎(圖3)。

表3 穗花杉SSR位點分析

GPS：牦牛兒基焦磷酸合成酶；FPS：法尼烯基焦磷酸；GGPS：牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸GPS: Geranyl pyrophosphate synthase; FPS: Farnesyl pyrophosphate synthase; GGPS: Geranylgeranyl pyrophosphate synthase圖3 穗花杉萜類合成通路關鍵基因查找結果Fig.3 The result of key genes of terpene biosynthesis pathway in A. argotaenia

3 討論

樹木的基因組較大，測一個基因組需要較高的成本。而且樹木的染色體構型較為復雜，除了成本問題，在染色體拼接方面也存在巨大的挑戰(zhàn)。隨著測序技術的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)越來越普遍，也為進一步探測基因組研究缺乏物種功能基因組變化的網(wǎng)絡模式提供條件[14]。在紅豆杉科中，紅豆杉屬、榧樹屬中的香榧都有轉(zhuǎn)錄組測序[15-16]。紅豆杉屬中的物種不僅有組織和細胞系的轉(zhuǎn)錄組測序，還有激素處理后的轉(zhuǎn)錄組測序[17]。然而，穗花杉屬中的穗花杉的基因數(shù)據(jù)比較匱乏，本研究利用HiSeq2500對穗花杉的莖葉混合樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得82 884條unigene和140 286條transcript。其中，有27 495條unigene得到注釋，研究結果為穗花杉的遺傳基礎研究提供了基因?qū)用娴臄?shù)據(jù)。

穗花杉在分類學研究上具有很高的學術價值。自發(fā)現(xiàn)以來，它的分類歸屬一直是植物學家爭論的問題。研究者從植物形態(tài)學、胚胎學、解剖學、孢粉學和植物化學等方面對穗花杉的系統(tǒng)分類地位進行了廣泛的研究。多數(shù)學者認為穗花杉具有紅豆杉科某些共同特征，與三尖杉科關系密切，是紅豆杉與三尖杉科之間聯(lián)系的橋梁[2]。但是，少有研究者從分子遺傳層面研究穗花杉的系統(tǒng)分類地位。僅有管啟良等[18]對穗花杉染色體層面對穗花杉的系統(tǒng)分類地位進行了研究，得出結論歸于羅漢松科。本研究利用高通量測序技術對穗花杉轉(zhuǎn)錄組測序，得到大量基因數(shù)據(jù)，為以后深入研究穗花杉的系統(tǒng)分類打下基礎。

穗花杉屬缺乏足夠的遺傳背景，Ge等[1]只利用ISSR技術對穗花杉屬的各個種之間的遺傳多樣性和群體結構進行分析。雖然ISSR引物通用性好，但是得到的多態(tài)性位點有限。在本研究中，我們在穗花杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中一共預測到2 827個SSR位點，遠遠高于ISSR通用引物數(shù)，為以后SSR位點的開發(fā)提供了遺傳基礎。SSR位點的多態(tài)性也為生物遺傳多樣性的研究提供了一個重要的手段。

紫杉醇是一個重要的萜類化合物，最早是在紫杉樹皮中發(fā)現(xiàn)的。穗花杉屬是紅豆杉科的一個屬，是否能夠合成紫杉醇依然未知。根據(jù)植物化學系統(tǒng)學概念，在紅豆杉科中的穗花杉屬植物里面也可能具有紫杉醇。穗花杉轉(zhuǎn)錄組功能注釋得到5個GGPS基因，還有20個跟二萜生物合成通路基因。紫杉二烯合酶是紫杉醇合成過程中一個重要的限速酶，只要穗花杉中存在紫杉二烯合酶(Taxadiene synthease, TS)基因，那么就為證明穗花杉可以合成紫杉醇提供了重要的證據(jù)。對本地穗花杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行TBLASTN分析,預測到的30個unigene。為以后的驗證穗花杉是否能夠合成紫杉醇提供了候選基因。

4 結論

本研究通過穗花杉轉(zhuǎn)錄組測序共獲得82 884條unigene，有27 495條unigene得到注釋，其中有近20個unigene與萜類合成途徑有關，為以后該物種萜類合成途徑研究，特別是紫杉二烯合成酶編碼基因的研究打下了基礎，也為穗花杉系統(tǒng)分類地位的研究提供新的遺傳信息。另外，在穗花杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，我們一共預測到2 827個SSR位點，這為今后穗花杉SSR位點的開發(fā)與遺傳多樣性評估提供了有用的分子標記。

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(責任編輯：張 研)

TranscriptomeSequencingandAnalysisofAmentotaxusargotaenia(Hance)Pilger

WANGShuai1,SHAOFen-juan1,LILun2,LUQiang1,QIUDe-you1

(1.The Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091 China；2.Guangxi Guilin XiaoLuShan Ecological Agriculture Co.Lit, Guilin 541205, Guangxi, China)

718.46

A

1001-1498(2017)05-0759-06

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.05.008

2016-02-06

國家重點研發(fā)計劃“極小種群野生植物就地保護及生境恢復技術研究與示范”課題(2016YFC0503103)。

王 帥(1988—),男,山東淄博人,在讀博士,研究方向為次生代謝途徑相關基因研究。E-mail: hotboyshuai@126.com.

* 通訊作者：邱德有,男,博士生導師,研究員,研究方向為次生代謝研究。E-mail：qiudy@caf.ac.cn.