噬菌體制劑在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用及安全性評價

王君雁 范秋麗 蘭瑞霞 蔣守群*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州510640；2.廣東海洋大學(xué)，湛江524088)

噬菌體是一類微生物病毒，能感染細(xì)菌、真菌、放線菌以及螺旋體等微生物。1915年，英國微生物學(xué)家Twort[1]首次證明在葡萄球菌培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的噬菌體能使金黃色葡萄球菌發(fā)生凋亡；1917年，D’Herelle[2]正式提出噬菌體的概念，并成功治療了瘧疾等人類疾病。由于噬菌體具有特異性強、毒副作用小、增殖速度快和成本低等優(yōu)點[3]，成為新型替抗添加劑。目前，國外將噬菌體廣泛應(yīng)用于動物疾病防控、食品源性病菌清除、農(nóng)作物細(xì)菌感染治療以及生物被膜的抑菌作用等方面，而國內(nèi)噬菌體的研究尚處于發(fā)展階段。

噬菌體在實際生產(chǎn)中能有效提高動物的繁殖性能和生產(chǎn)性能[4]。目前噬菌體在替抗飼料添加劑方面研究較少，這限制了噬菌體制劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用；此外，噬菌體制劑的應(yīng)用也受限于噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)毒素會對畜禽機體造成損傷。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外相關(guān)研究進展，從噬菌體特性、在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用、制劑研發(fā)以及安全性評價等方面進行綜述，旨在為噬菌體制劑在家禽生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 噬菌體的結(jié)構(gòu)、特性及分類

1.1 噬菌體的結(jié)構(gòu)

噬菌體長度為24～200 nm，通常由頭部和尾部2部分組成，其中頭部包含衣殼蛋白和核酸，尾部為長管結(jié)構(gòu)，能幫助噬菌體整合到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)[5]。噬菌體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與衣殼蛋白有關(guān)，Asija等[6]在3.3?冷凍E花環(huán)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，使用E環(huán)氨基酸E52、E59和E72通過具有P結(jié)構(gòu)域殘基R102、R109和K118的衣殼內(nèi)鹽橋來穩(wěn)定噬菌體P22病毒體衣殼，并分別將谷氨酸殘基突變?yōu)楸彼?；結(jié)果表明，E花環(huán)和P結(jié)構(gòu)域之間的相互作用力能穩(wěn)定噬菌體P22結(jié)構(gòu)，且基因突變不會破壞噬菌體的穩(wěn)定性。

1.2 噬菌體數(shù)據(jù)庫

噬菌體廣泛存在于自然界中，目前已發(fā)現(xiàn)的噬菌體數(shù)量總數(shù)有1031個[7]。人們?yōu)榱丝焖俸Y選出目的噬菌體，因此建立了噬菌體數(shù)據(jù)庫。最早介紹噬菌體篩選技術(shù)的是Smith[8]，他用M13絲狀噬菌體作為載體，將外源DNA摻入M13絲狀噬菌體染色體中，使外源肽融合到M13噬菌體的G3P涂層蛋白上形成融合蛋白，并利用基因產(chǎn)物的抗體進行克隆篩選。Gao等[9]根據(jù)噬菌體的特異性，建立了微生物-噬菌體相互作用(microbe versus phage，MVP)數(shù)據(jù)庫，可以對噬菌體進行靶向選擇。該數(shù)據(jù)庫從美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)病毒基因組、NCBI原核生物參考基因組數(shù)據(jù)庫、人類腸道組裝宏基因組序列以及已發(fā)表數(shù)據(jù)集的病毒和噬菌體序列中，確定了30 321個宿主-噬菌體關(guān)聯(lián)，包含了與9 245種原核生物發(fā)生相互作用的18 608個病毒簇。

1.3 噬菌體的分類

噬菌體有多種分類方式，根據(jù)尾部形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為有尾噬菌體和無尾噬菌體；其中，有尾噬菌體約占噬菌體總數(shù)的96%，現(xiàn)有的噬菌體有142科和81個亞科[10]，可分為短尾噬菌體科、長尾噬菌體科以及肌尾噬菌體科，其中長尾噬菌體科數(shù)量最多[11]。根據(jù)噬菌體中所含核酸種類可分為單鏈RNA、雙鏈RNA、單鏈DNA以及雙鏈DNA。根據(jù)蛋白質(zhì)外殼分類又分為無尾二十面體結(jié)構(gòu)、有尾二十面體結(jié)構(gòu)以及線狀體(由殼粒組成的盤旋狀結(jié)構(gòu))[12]。按與宿主的關(guān)系可分為溫和噬菌體和烈性噬菌體[13]。噬菌體的大致分類如圖1所示。

圖1 噬菌體的分類

2 噬菌體制劑在家禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 噬菌體制劑在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用

噬菌體最開始用于治療畜禽的腸道感染[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，將噬菌體制劑加入飼糧中能顯著提高家禽的生長性能，改善肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)。卓國榮等[15]選取了672只45 g左右的1日齡肉雞，分別在飼糧中添加0.25和0.50 g/kg的噬菌體和抗生素，觀察肉雞生長性能、血液特征和微生物脫落的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.50 g/kg噬菌體能夠提高肉雞早期的飼料轉(zhuǎn)化率和肝臟相對重量，增加腸道乳酸桿菌數(shù)量，減少腸道大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。Pantoja-Don等[16]利用600只羅斯(Ross)308肉雞評估了β-甘露聚糖酶和噬菌體作為添加劑對盲腸微生物的影響，試驗進行了肉雞生長性能和免疫器官指數(shù)的測定以及盲腸微生物的分析，結(jié)果表明，噬菌體能夠提高免疫器官指數(shù)，且與β-甘露聚糖酶混合使用具有改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的潛力。

2.2 噬菌體制劑在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用

噬菌體制劑不僅能提高肉雞的生長性能，還會提高種雞繁殖性能和抗氧化功能，調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。Lee等[17]選取32只40周齡的海蘭褐蛋雞，飼喂14 d含噬菌體的基礎(chǔ)飼糧，噬菌體效價為108PFU/kg，試驗通過記算免疫器官指數(shù)、微生物多樣性，并采用實時熒光定量PCR來評價噬菌體對蛋雞腸道菌群及免疫狀態(tài)的影響，結(jié)果表明，噬菌體能夠降低組織器官中沙門氏菌的數(shù)量，緩解機體的炎癥反應(yīng)。葛龍等[18]選擇了2 400只350日齡的海蘭褐蛋雞進行試驗，飼喂基礎(chǔ)飼糧和在基礎(chǔ)飼糧中分別添加100、300和500 g/t的大腸桿菌、沙門氏菌和魏氏梭菌噬菌體復(fù)合劑，測定蛋雞的生長性能、蛋品質(zhì)以及腸道菌群數(shù)量，結(jié)果顯示，飼糧中添加復(fù)合噬菌體制劑能夠提高蛋雞產(chǎn)蛋率，降低料重比，降低不合格蛋率以及腸道有害菌群的數(shù)量，且最適添加量為300 g/t。

2.3 噬菌體制劑在細(xì)菌性疾病治療中的應(yīng)用

大腸桿菌和沙門氏菌是引起家禽腹瀉的主要病原體。噬菌體制劑能夠代替抗生素成為新型抗菌劑，用于治療家禽細(xì)菌性疾病。杜新永等[19]利用濃度為106CFU/mL的高致病性大腸桿菌E6對50只1日齡的白羽肉雞進行攻毒，建立肉雞氣囊炎模型，然后將噬菌體制劑與林可霉素、多西環(huán)素進行比較，結(jié)果表明，噬菌體混合試劑對肉雞的大腸桿菌治療效果良好。Kittler等[20]選擇了64只Ross 308肉雞，向飲水中添加噬菌體制劑，結(jié)果表明，噬菌體能夠有效減少腸道大腸桿菌數(shù)量。丁一峰等[21]利用從環(huán)境污水樣品中分離出的沙門氏菌噬菌體D1-2和Pu20以1∶1混合的方式對胸肌表面的沙門氏菌進行抑菌試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，噬菌體混合制劑在感染復(fù)數(shù)(MOI)為10 000時，3 h內(nèi)即可完全抑制鼠傷寒沙門氏菌，且抑菌效果優(yōu)于單個噬菌體。綜上所述，噬菌體不僅能在影響免疫細(xì)胞的情況下提高家禽的生長性能、繁殖性能以及免疫功能，還能應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療，表1列舉了噬菌體在家禽中的作用效果[22-27]。

表1 噬菌體在家禽中的作用效果

3 噬菌體制劑的作用機理

3.1 噬菌體對腸道微生物的調(diào)控作用

腸道內(nèi)的微生物能調(diào)節(jié)家禽生長性能，增強免疫功能。據(jù)研究顯示，腸道內(nèi)主要是溫帶噬菌體，有1 200種基因型可附著于腸道微生物[28]。噬菌體能通過逆轉(zhuǎn)錄酶依賴性機制進行靶向突變，產(chǎn)生致病型基因，影響腸道菌群結(jié)構(gòu)[29-31]；同時提高腸道黏膜的抗氧化功能，維持動物腸道健康。噬菌體可通過編輯規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白(CRISPR-Cas)限制性修飾系統(tǒng)激活特異性免疫使細(xì)菌進行免疫逃逸[32]。Lam等[33]利用M13噬菌體和熒光標(biāo)記的大腸桿菌菌株構(gòu)建CRISPR-Cas9噬菌體載體，結(jié)果證明，M13噬菌體將DNA呈遞給腸道內(nèi)的大腸桿菌，能利用CRISPR-Cas9進行特異性識別，幫助大腸桿菌進行靶向逃離。Hsu等[34]利用定菌(gnotobiotic)小鼠建立了小鼠腸道微生物-噬菌體模型，通過模型觀察到，噬菌體直接與微生物作用會產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)，提高腸道微生物活性，調(diào)節(jié)腸道代謝活動。

3.2 噬菌體的免疫調(diào)節(jié)作用

噬菌體除了調(diào)節(jié)腸道菌群數(shù)量，還能與免疫細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)提高宿主的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，口服噬菌體能治療多種細(xì)菌感染并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體[35]，影響機體的先天性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)，刺激腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素(IL)-1α及干擾素(IFN)-γ和IL-27等免疫因子水平升高，但多數(shù)僅在群體水平上產(chǎn)生作用。Perea等[36]利用5種丁醇純化后的噬菌體懸浮液標(biāo)記健康的單核細(xì)胞，與僅含有丁醇緩沖液的樣品進行對照，并分別向2組添加多黏菌素B，檢測與脂多糖(LPS)識別的單核細(xì)胞標(biāo)記物(CD14)、抗原呈遞[人類白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)]、共刺激(CD86)以及噬菌體誘導(dǎo)的炎癥因子(TNF-α、IFN-α和IL-10)水平，探究噬菌體是否會通過黏膜與單核細(xì)胞產(chǎn)生作用，結(jié)果顯示，丁醇純化后的噬菌體使單核細(xì)胞中IFN-α和IL-10的分泌增高，CD14和CD86的表達降低；所有的噬菌體懸浮液都降低了HLA-DR的表達，且多黏菌素B不能恢復(fù)經(jīng)噬菌體誘導(dǎo)的單核細(xì)胞。這證明丁醇純化后的噬菌體對單核細(xì)胞表型和細(xì)胞因子產(chǎn)生影響，使其具有耐受性。Leung等[37]建立了一種噬菌體治療模型，該模型在現(xiàn)有的噬菌體-細(xì)菌-免疫系統(tǒng)模型的基礎(chǔ)上，根據(jù)宿主固有反應(yīng)的有限能力以及高密度下細(xì)菌的免疫逃逸進行改進，結(jié)果表明，噬菌體會與宿主先天性免疫反應(yīng)產(chǎn)生協(xié)同作用消滅細(xì)菌，且該協(xié)同效應(yīng)更加穩(wěn)定。當(dāng)噬菌體經(jīng)不同途徑進入機體后主要在肝臟進行降解，進入機體的噬菌體顆粒經(jīng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)篩選后會呈遞給單核巨噬細(xì)胞，進而激活特異性免疫。噬菌體的作用機理如圖2所示。

a：噬菌體通過直接或間接的方式激活特異性免疫和非特異性免疫；b：噬菌體整合到細(xì)菌DNA上形成前噬菌體，細(xì)菌通過CRISPR-Cas系統(tǒng)進行免疫逃逸。

噬菌體的調(diào)控機制大體分為2部分：1)前噬菌體能通過CRISPR-Cas系統(tǒng)進行免疫逃逸，激活機體的特異性免疫應(yīng)答，調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)，該過程與疫苗免疫過程相似；2)噬菌體能通過直接或間接的方式激活細(xì)胞的非特異性免疫和特異性免疫，但噬菌體引起的免疫反應(yīng)會降低噬菌體的活性和抗菌效果，且只會對單個細(xì)菌產(chǎn)生特異性反應(yīng)。

4 噬菌體制劑的研發(fā)與安全性評價

4.1 噬菌體制劑的研發(fā)

實際生產(chǎn)中，根據(jù)噬菌體的自身性質(zhì)以及成分，選擇合適的賦形劑以保護噬菌體抗逆生長，維持噬菌體活性。目前常用的噬菌體賦形劑包括食品級聚合物、脂質(zhì)體以及pH應(yīng)性高的分子材料[38]。雖然噬菌體賦形劑能夠保證噬菌體的穩(wěn)定性，但噬菌體制劑的研發(fā)同樣存在問題：1)目前耐藥菌株克隆體對噬菌體的耐藥性還是未知數(shù)[39]；2)單一噬菌體和多種噬菌體制成的“雞尾酒制劑”在生產(chǎn)上如何進行選擇[40]；3)噬菌體中含有的多種孤兒基因(ORFans)，其中一部分為不良基因，容易產(chǎn)生內(nèi)毒素，因此其安全性還需進行評估[41]。

4.2 噬菌體制劑的安全性評價

4.2.1 噬菌體制劑安全性評價方法

噬菌體的給藥劑量、給藥時間以及給藥方式都會對噬菌體制劑的安全性造成影響，臨床上主要通過攻毒試驗來對噬菌體的安全性進行評價。Saima等[42]利用金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞細(xì)菌噬菌體對患者進行抗生素協(xié)同治療，結(jié)果表明，噬菌體能輔助抗生素進行臨床治療，且具有良好的耐受性。Khalifa等[43]使用糞腸球菌菌株制作糞腸球菌腸道致病模型，并用分離出的噬菌體EFDG1與EFLK1進行治療及藥敏試驗，對噬菌體的安全性以及治療效果進行評價，通過向21～25 g的雌性ICR小鼠腹腔注射糞腸球菌制成小鼠腹膜炎模型，分為4個組，包括對照組、250 μL的2×108PFU/mL EFDG1和EFLK1混合物、250 μL的12.5 mg/kg氨芐西林以及噬菌體和抗生素混合治療，結(jié)果顯示，單次注射噬菌體混合物足以完全逆轉(zhuǎn)由耐萬古霉素糞腸球菌引起的高死亡率趨勢，且不會對腸道內(nèi)的微生物產(chǎn)生毒副作用。Fong等[44]建立了綿羊鼻竇炎感染模型，并用銅綠假單胞菌噬菌體雞尾酒制劑進行治療，結(jié)果顯示，噬菌體雞尾酒制劑濃度為108～1010PFU/mL時不會對機體造成損傷。

噬菌體制劑的安全性評價是降低噬菌體制劑在臨床產(chǎn)生毒副作用的基礎(chǔ)。噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)毒素在家禽體內(nèi)富集會對組織器官造成損傷，因此解決噬菌體帶來的毒副作用是保障噬菌體制劑安全性的重要方法。

4.2.2 噬菌體制劑的脫毒方法

噬菌體產(chǎn)生的內(nèi)毒素能對機體產(chǎn)生毒害作用，內(nèi)毒素脫毒是噬菌體研發(fā)中保證噬菌體安全的重要環(huán)節(jié)。細(xì)菌內(nèi)毒素脫毒包括2個方面：1)內(nèi)毒素檢測；2)內(nèi)毒素脫毒。

目前運用的內(nèi)毒素生物學(xué)檢測技術(shù)有兔熱原試驗(RPT)、牛全血試驗(bWBA)以及鱟變形細(xì)胞裂解物試驗(LAL)，生物傳感器技術(shù)包括電化學(xué)檢測技術(shù)和光學(xué)檢測技術(shù)，不同方式的檢測技術(shù)的檢出限見表2[45-47]。

表2 不同噬菌體檢測技術(shù)特點

細(xì)菌內(nèi)毒素的脫毒方式分為傳統(tǒng)的超濾法、氯仿提取和氯化銫梯度超速離心以及替代的吸附法、色譜法和層析法等，且親和樹脂色譜法的效果最佳。呂可等[48]利用沙門氏菌噬菌體(φFelix O1)建立動態(tài)濁度法檢測噬菌體制劑中的內(nèi)毒素，后對凝膠層析法、超濾法以及活性炭吸附法脫除內(nèi)毒素進行比較，結(jié)果顯示，基于鱟試劑凝膠反應(yīng)的動態(tài)濁度法對噬菌體制劑中的內(nèi)毒素敏感性較強，通過3種方法的比較，超濾法的效果優(yōu)于另外2種脫毒方法。Michalik-Provasek等[49]利用1-十二烷醇有機溶劑來萃取噬菌體的內(nèi)毒素，該方法在保證噬菌體回收率的條件下有效提取出了噬菌體中的內(nèi)毒素。

噬菌體制劑的脫毒方式，從最開始的傳統(tǒng)脫毒方法到后來的替代方法，根據(jù)噬菌體的特性在不斷優(yōu)化。雖然傳統(tǒng)的脫毒方法對于腸外給藥的噬菌體效果最佳，但毒副作用強、副產(chǎn)物難以消除?，F(xiàn)階段對噬菌體脫毒方式的研究要在保證噬菌體回收率的情況下降低副產(chǎn)物的產(chǎn)率。

5 小 結(jié)

總而言之，噬菌體作為一種抗生素替代品能降低細(xì)菌數(shù)量，提高機體的免疫功能，但該過程有一定的局限作用，只有將噬菌體作用于感染部位才能發(fā)揮作用。噬菌體能增加腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量，因此推測噬菌體能調(diào)控肉品質(zhì)，增加風(fēng)味物質(zhì)的沉積，提高雞肉的可食用性。噬菌體能增強家禽的免疫功能，通過內(nèi)皮網(wǎng)狀細(xì)胞的呈遞作用影響動物生長性能、繁殖性能、免疫功能以及機體正常代謝活動。目前，關(guān)于噬菌體與細(xì)菌的相互作用、噬菌體制劑對家禽的營養(yǎng)調(diào)控作用以及對噬菌體制劑毒副作用的研究，將促進噬菌體作為替抗飼料添加劑在生產(chǎn)中的使用。未來隨著分子生物學(xué)的研究進展，噬菌體制劑作為替抗添加劑對動物生產(chǎn)的調(diào)控作用、噬菌體制劑的安全性評價方式、生產(chǎn)中不同添加類型的噬菌體制劑以及選擇脫毒方式等都將為噬菌體制劑在實際生產(chǎn)中的使用奠定基礎(chǔ)。