鉛脅迫對蜀葵重金屬積累及抗氧化酶活性的影響

黃亞萍，俎麗紅，沈廣爽，高張瑩，周美利，石福臣

鉛脅迫對蜀葵重金屬積累及抗氧化酶活性的影響

黃亞萍，俎麗紅，沈廣爽，高張瑩，周美利，石福臣*

（南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071）

為探究植物對重金屬鉛（Pb）的積累和耐性，以錦葵科（Malvaceae）植物蜀葵（Althaea rosea Cavan.）為材料，研究了不同Pb濃度（0、50、100、200、500 mg·kg-1）處理對蜀葵葉片抗氧化酶活性及生理特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蜀葵對于重金屬Pb脅迫有較強(qiáng)的耐受性，低濃度Pb處理促進(jìn)蜀葵地上生物量的積累，抑制了蜀葵根的生長，且根為主要積累Pb的部位；Pb濃度的增加導(dǎo)致相對葉綠素含量（SPAD）降低，過氧化氫（Hydrogen peroxide,H2O2）、超氧陰離子（Superoxide anion,O2-·）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量及電解質(zhì)外滲率（Electrolyte leakage,EL）增加；Pb濃度為100 mg·kg-1時，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（Peroxidase,POD）、過氧化氫酶（Catalase,CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）活性比對照分別增加了5.6%、29.36%、22.48%和54.19%。研究表明，蜀葵可以通過調(diào)節(jié)自身的生理生化機(jī)制來適應(yīng)Pb脅迫環(huán)境，可用于Pb污染地區(qū)的土壤修復(fù)。

鉛脅迫；蜀葵；抗氧化酶；積累特性；植物修復(fù)

近年來，隨著城鎮(zhèn)化和工業(yè)化的發(fā)展，土壤污染問題已經(jīng)引起了人們極大的關(guān)注[1-2]。污水灌溉、過量施用農(nóng)藥和化肥等，導(dǎo)致農(nóng)田污染日益嚴(yán)重[3]。在眾多污染物中，重金屬尤為突出，僅過去五十年，全球Pb排放量已達(dá)到7.83×104t，大部分進(jìn)入了土壤[4]。我國耕地土壤位點超標(biāo)率已達(dá)19.4%，其中Pb污染占到1.5%（全國土壤污染狀況調(diào)查公報）。許多近郊農(nóng)田都受到不同程度的Pb污染，黃浦江中上游地區(qū)Pb含量超過土壤背景值的45%[5]。Pb作為植物體非必需元素，能導(dǎo)致農(nóng)作物生長受阻、產(chǎn)量下降，過量累積還會引發(fā)植物內(nèi)環(huán)境的紊亂，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化損傷[6]。

應(yīng)用植物修復(fù)技術(shù)進(jìn)行重金屬污染的土壤修復(fù)，具有廣泛適用性和廉價性[7]。目前對超積累植物的研究較多，國內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)700余種、分布在50個科[8]。所謂的超積累植物是指能吸收一種或多種重金屬、積累能力比一般植物高100～1000倍、且無毒害癥狀出現(xiàn)的植物[9-10]。迄今發(fā)現(xiàn)的Pb積累植物中，多數(shù)生物量較小、生長季受限，在實踐中有一定的局限性[11]，因此尋找生物量大、適應(yīng)性強(qiáng)、耐重金屬且生態(tài)幅更廣的植物具有現(xiàn)實意義。

蜀葵（A.rosea），錦葵科（Malvaceae）蜀葵屬（Althaea Linn.），一年生或多年生直立草本，高達(dá)2 m，花朵艷麗，具有生物量大、根系發(fā)達(dá)和適應(yīng)能力強(qiáng)的特點。蜀葵在我國分布范圍極廣，南至海南、北至內(nèi)蒙古，東至黑龍江、西至新疆（《中國植物志》第49（2）卷11頁）。蜀葵種皮厚且粗糙，對重金屬具有一定的抵抗能力，幼苗對Pb、Cd具有一定的耐性和積累性[12-13]。本研究針對華北地區(qū)的土壤特點和在廣泛考察各種適生植物的基礎(chǔ)上，選擇以蜀葵為材料，通過研究不同濃度Pb處理對蜀葵生長及葉片抗氧化酶活性的影響，探究蜀葵對重金屬的耐受性，并為土壤Pb污染的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本實驗用蜀葵種子采集于天津市內(nèi)花卉種植區(qū)。

1.1 材料培養(yǎng)

實驗于2016年6—10月進(jìn)行，地點在南開大學(xué)校內(nèi)實驗地（北緯39°06′41.66″、東經(jīng)117°10′33.91″）。實驗地頂部用透光板搭建，四周圍有鐵絲網(wǎng)，室內(nèi)保持正常通風(fēng)和透光。選擇健康飽滿的種子播于營養(yǎng)土內(nèi)（草炭土∶蛭石=3∶1），澆水保持濕潤。待種子萌發(fā)后選擇生長一致的幼苗進(jìn)行移栽，塑料盆（口徑18 cm，高16 cm）內(nèi)盛放洗凈的砂子2.8 kg，每盆種植一株，每周澆200 mL Hoagland營養(yǎng)液，適時補(bǔ)充水分。生長20 d后用Pb（NO3）2處理，設(shè)置五個Pb濃度梯度：0、50、100、200、500 mg·kg-1。每個處理六次重復(fù)，每個重復(fù)種植兩盆。

1.2 取樣

Pb處理70 d后收獲植株。收獲時用蒸餾水清洗，并將根部置于20 mmol·L-1EDTA-Na2中浸泡15 min，去除吸附在根表面的Pb。然后分別用蒸餾水和去離子水清洗3次。清洗后的植物置于烘箱，105℃殺青30 min，80℃烘干至恒重。

1.3 測定方法

1.3.1 Pb積累量測定

烘干后的植物粉碎研磨過60目篩。稱取0.4 g植物樣品，用HNO3-HCl（V/V，1∶9）消解[14]后加熱至無黃煙產(chǎn)生，冷卻后置于25 mL容量瓶，超純水多次洗滌定容。上清液過0.45 μm濾膜，用原子吸收分光光度計（SP-3520 AA，上海光譜）測定Pb含量。根據(jù)測定結(jié)果計算富集系數(shù)、轉(zhuǎn)運系數(shù)和耐性指數(shù)，用于判斷植物對Pb的吸附和轉(zhuǎn)運能力[15]，公式如下：

富集系數(shù)（Bioconcentration coefficient，BCF）=植株體積累的Pb濃度/土壤中Pb濃度

轉(zhuǎn)運系數(shù)（Translocation coefficient，TF）=（植物地上部Pb濃度/植物地下部Pb濃度）×100%

耐性指數(shù)（Tolerance index，TI）=處理組植物鮮重/對照組植物鮮重

1.3.2 SPAD值測定

SPAD-502（Soil and Plant Analyzer Development）是一種快速、方便、非破壞性的測定葉片相對葉綠素含量的儀器[16]，SPAD值能夠較好地反映葉綠素含量的變化[17-18]。從Pb處理第10 d開始，每個處理選取3個植株，每個植株選取3個葉片，每片葉選取不同部位測定3次。每10 d測量1次，共6次。

1.3.3 丙二醛（MDA）含量和電解質(zhì)外滲率（EL）測定

丙二醛的測定采用硫代巴比妥酸法[19]。電解質(zhì)外滲率的測定采用Singh等[20]的方法，計算公式為：

式中：E1為初始電導(dǎo)率；E2為沸水浴后電導(dǎo)率；E0為去離子水的電導(dǎo)率。

1.3.4 過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子（O2-·）含量測定

H2O2含量的測定參照Choudhury等[21]的方法；O2-·產(chǎn)生速率參照王愛國等[22]的方法。

1.3.5 抗氧化酶活性測定

Pb處理70 d后測定抗氧化酶活性。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法、過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法、過氧化氫酶（CAT）活性采用過氧化氫分解法[19]、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性采用Nakano等[23]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，采用Microsoft Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），最小顯著差異法（LSD）在α=0.05水平進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb處理對蜀葵生物量及Pb積累量的影響

從表1可以看出，蜀葵地上生物量在Pb濃度為50 mg·kg-1時，比對照增加了4.13%（P＜0.05）；Pb濃度為100 mg·kg-1時，與對照間無顯著差異；當(dāng)Pb處理濃度達(dá)到200 mg·kg-1時，顯著低于對照（P＜0.05）。蜀葵地下生物量隨著Pb濃度的升高而顯著降低，各處理間與對照均存在顯著差異（P＜0.05）。Pb濃度在500 mg·kg-1時地下生物量最小，為對照組的80.33%。

Pb處理濃度較低時，Pb主要積累在蜀葵根部，隨著處理濃度的增加，植株P(guān)b的積累逐漸向地上部轉(zhuǎn)移。在Pb處理50 mg·kg-1時轉(zhuǎn)移系數(shù)為13.74%；500 mg·kg-1時轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到75.88%。實驗發(fā)現(xiàn)，蜀葵的富集系數(shù)、耐性指數(shù)隨Pb濃度的升高而降低，最高濃度Pb（500 mg·kg-1）比最低濃度（50 mg·kg-1）的富集系數(shù)降低了0.27，耐性指數(shù)降低了0.21。

2.2 Pb處理對蜀葵SPAD值變化的影響

圖1為Pb脅迫處理后蜀葵葉片相對葉綠素含量（用SPAD值表示）隨時間的變化情況。蜀葵葉片SPAD值隨Pb處理時間的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，并在Pb處理第30 d達(dá)到最大值。此時，對照組SPAD值比第10 d提高了1.14倍，Pb濃度50、100、200、500 mg·kg-1的SPAD值分別提高了1.09倍、1.06倍、1.03倍和1.01倍。進(jìn)一步可以看出，Pb濃度與蜀葵葉片SPAD值成反比。在第30 d時，各處理下SPAD值分別比對照降低了6.11%、11.26%、14.30%和15.95%。

圖1 不同濃度Pb處理下蜀葵葉片SPAD值隨時間的變化Figure 1 The change of SPAD of A.rosea in different Pb concentrations

2.3 Pb處理對蜀葵葉片H2O2和O2-·含量的影響

圖2A表示了不同Pb濃度處理下蜀葵葉片中H2O2含量的變化。蜀葵葉片中H2O2含量隨Pb處理濃度升高而增加。在Pb濃度最高時（500 mg·kg-1）與其他各處理間存在顯著差異（P＜0.05），此時H2O2含量是對照的1.29倍。當(dāng)Pb濃度為200 mg·kg-1時，H2O2含量與對照間存在顯著性差異（P＜0.05）；Pb濃度為100 mg·kg-1和50 mg·kg-1時差異不顯著。

不同Pb濃度處理對蜀葵葉片中O2-·含量影響顯著（圖2B）。隨著Pb濃度的升高，O2-·含量逐漸增加。當(dāng)Pb濃度為50 mg·kg-1時，蜀葵葉片中O2-·含量比對照增加了16.15%，與各處理間存在顯著差異（P＜0.05）。當(dāng)Pb濃度500 mg·kg-1時，O2-·含量達(dá)到最大，是對照的1.49倍，但與濃度為200 mg·kg-1的Pb處理差異不顯著。同時，Pb濃度200 mg·kg-1的處理與100 mg·kg-1的處理間O2-·含量差異不顯著。

表1 不同Pb濃度對蜀葵生物量、鉛積累量以及富集系數(shù)、轉(zhuǎn)移系數(shù)和耐性指數(shù)的影響Table 1 The effects of biomass，Pb accumulation，bioconcentration coefficient（BCF），translocation coefficient（TF）and tolerance index（TI）of A.rosea in different Pb concentrations

圖2 不同Pb濃度處理下蜀葵葉片H2O2和O2-·含量的比較Figure 2 The comparision of H2O2content and O2-·content in different Pb concentrations of A.rosea

圖3 不同Pb濃度處理下蜀葵葉片MDA含量和EL的比較Figure 3 The comparision of the content of MDA and EL in different Pb concentrations of A.rosea

2.4 Pb處理對蜀葵MDA含量和EL的影響

植物受氧化脅迫時組織內(nèi)MDA含量的高低反映了膜脂過氧化水平[24]。圖3A表示不同Pb濃度處理下蜀葵葉片中MDA含量的變化。隨著Pb濃度的增加MDA含量逐漸提高，各處理與對照間存在顯著差異（P＜0.05）。Pb濃度為50、100、200、500 mg·kg-1時，MDA含量分別是對照的1.09、1.12、1.14、1.19倍。Pb濃度為50、100、200 mg·kg-1的處理間差異不顯著；Pb處理濃度200、500 mg·kg-1處理間也無顯著差異。

當(dāng)細(xì)胞膜的完整性遭到破壞時，會導(dǎo)致膜內(nèi)大量離子外滲使溶液的電導(dǎo)率增加[25]。圖3B比較了不同Pb濃度處理下蜀葵葉片電解質(zhì)外滲率的變化。蜀葵葉片電解質(zhì)外滲率隨Pb濃度的升高而增加，且各處理與對照間存在顯著性差異（P＜0.05）。Pb濃度為500、200、100、50 mg·kg-1時，電解質(zhì)外滲率分別比對照高出70.50%、50.08%、18.46%和11.57%。最高濃度Pb（500 mg·kg-1）與其他處理間存在顯著性差異（P＜0.05），Pb濃度為50 mg·kg-1和100 mg·kg-1的處理之間差異不顯著。

2.5 Pb處理對蜀葵葉片抗氧化酶活性的影響

過量的Pb積累會誘導(dǎo)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的積累，植物體內(nèi)的抗氧化酶（SOD、POD、CAT和APX）能夠有效消除過量的活性氧自由基，緩解植物中毒特征[26]。從圖4可以看出，隨著Pb處理濃度的升高，蜀葵葉片內(nèi)抗氧化酶活性呈先升后降趨勢。當(dāng)Pb處理濃度為100 mg·kg-1時，抗氧化酶活性達(dá)到最大，與對照之間存在顯著差異（P＜0.05），SOD、POD、CAT和APX分別比對照提高了5.60%、29.36%、22.48%和54.18%。隨著Pb濃度的升高，蜀葵葉片抗氧化酶活性逐漸降低，在500 mg·kg-1時，SOD活性比對照組低8.55%，差異顯著（P＜0.05）；而CAT、POD和APX與對照組相比無顯著差異。

3 討論

實驗表明，當(dāng)環(huán)境Pb濃度較低時，Pb對蜀葵地上生物量有促進(jìn)作用。當(dāng)濃度為50 mg·kg-1時，地上生物量是對照的1.09倍，而地下生物量略有下降，為對照的91.13%；當(dāng)Pb濃度達(dá)到100 mg·kg-1時，地上生物量與對照無顯著差異，地下生物量為對照的87.10%。隨著Pb處理濃度的升高，蜀葵轉(zhuǎn)移系數(shù)增大，富集系數(shù)和耐性指數(shù)降低，地上和地下部Pb積累量增加，Pb在植物體內(nèi)的分布特征為地下＞地上。這說明，Pb脅迫對蜀葵的生長產(chǎn)生了抑制作用，且吸收的Pb主要積累在根部，與田菁（Sesbania drummondii）、槐樹（Sophora japonica）和側(cè)柏（Platycladus orientalis）的重金屬Cd、Pb脅迫實驗結(jié)果一致[27-28]。植物體面對脅迫時會表現(xiàn)出相應(yīng)的適應(yīng)機(jī)制，Hall和Tauqeer等指出，植物體通過限制有毒重金屬離子向地上器官的轉(zhuǎn)移、將吸收的重金屬離子大部分積累在根部，從而保護(hù)葉組織、特別是代謝活性光合細(xì)胞免受重金屬損傷[29-30]，其地上部生物量的增加可能與低濃度的Pb增加淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性有關(guān)[31]。

圖4 不同Pb濃度處理下蜀葵葉片抗氧化酶活性的比較Figure 4 The activity of antioxidant enzymes in different Pb concentrations of A.rosea

細(xì)胞膜是植物體物質(zhì)交換的主要結(jié)構(gòu)，Pb濃度的增加導(dǎo)致蜀葵葉片膜脂過氧化水平加劇、細(xì)胞膜完整性受到一定破壞。本研究中，Pb濃度50 mg·kg-1處理下，蜀葵葉片H2O2含量變化不顯著；隨著Pb濃度的增加，蜀葵葉片中H2O2和O2-·含量積累、MDA和EL增加。通過Cd、Pb、Hg、Ni脅迫大麥幼苗、Pb脅迫臭薺（Coronopus didymus）和棱軸土人參（Talinum triangulare）以及Cd脅迫番茄（Solanum lycopersicum）得到的實驗結(jié)果[32-34]與此一致。低濃度Pb脅迫環(huán)境下，植物體可能啟動了抗氧化酶保護(hù)機(jī)制和增加了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，而隨著Pb濃度的增加，抗氧化酶活性受到抑制，過高的ROS水平導(dǎo)致細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，形成的MDA能交聯(lián)脂類、核酸、糖類及蛋白質(zhì)，進(jìn)一步破壞了膜結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)的外滲[35]。因此，MDA含量反映了膜脂過氧化程度，電解質(zhì)外滲率是膜損傷的直接證據(jù)。

蜀葵葉片抗氧化酶（SOD、POD、CAT和APX）活性與Pb濃度之間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢?？寡趸冈谥参颮OS解毒中起著重要作用，SOD能將O2-·歧化為H2O2，POD將H2O2分解成H2O[36]，CAT存在于過氧化物酶體，而葉綠體中H2O2的分解主要依賴于APX[27]。當(dāng)Pb濃度較低（小于100 mg·kg-1）時，蜀葵啟動了葉片抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)，SOD、POD、CAT和APX活性隨Pb濃度的升高而增加，使得低濃度下蜀葵葉片中H2O2和O2-·的積累量變化不明顯、MDA和EL增加不顯著；而隨著Pb濃度的增加（大于100 mg·kg-1），SOD、POD、CAT和APX活性下降。這與Kaur對小麥（Triticumaestivum）[37]、Israr對田菁（Sesbaniadrummondii）[38]、Hasan對番茄（Solanum lycopersicum）[34]、鐘珍梅對圓葉決明（Chamaecrista rotundifolia）[39]和Gupta對東南景天（Sedum alfredii）[40]的研究結(jié)果相同。低濃度Pb處理下蜀葵葉片中抗氧化酶活性的增加可能是植物體對重金屬脅迫的主要防御機(jī)制[30]，隨著Pb濃度的增加抗氧化酶活性降低，可能與葉片中H2O2、O2-·含量的增加[41]、酶催化位點或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變及合成金屬酶的必需離子如鋅、鐵、錳等的吸收發(fā)生紊亂有關(guān)[42]。同時ROS的大量積累導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷、代謝失調(diào)，植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡遭到破壞。當(dāng)Pb濃度增加到500 mg·kg-1時，SOD活性降低至對照的91.45%，而POD、CAT和APX的活性與對照差異不顯著。這說明，蜀葵能夠通過調(diào)節(jié)自身抗氧化酶系統(tǒng)對Pb脅迫環(huán)境進(jìn)行防御，因此還需要進(jìn)一步研究Pb脅迫對蜀葵的長期影響，并對蜀葵的耐受機(jī)制進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

（1）Pb脅迫下，蜀葵葉片葉綠素含量降低、膜脂過氧化加劇、細(xì)胞完整性遭到破壞，但這種脅迫誘導(dǎo)了抗氧化酶系統(tǒng)形成。在Pb濃度為100 mg·kg-1時SOD、POD、CAT和APX的活性達(dá)到最大，并顯著高于對照?？寡趸赶到y(tǒng)的防御在一定程度上緩解了的植物的受害癥狀。

（2）蜀葵對于重金屬Pb脅迫有較強(qiáng)的耐受性，根系對Pb較敏感。低濃度Pb處理（50 mg·kg-1）增加了蜀葵地上生物量，隨著Pb濃度的增加，蜀葵轉(zhuǎn)移系數(shù)增大、富集系數(shù)和耐性指數(shù)降低。這說明蜀葵能夠適應(yīng)一定濃度的Pb環(huán)境，可以作為一種集園林花卉和Pb污染土壤修復(fù)為一體的較有前途的植物材料。

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Effects of lead stress on accumulation ability and antioxidant enzyme activities of Althaea rosea Cavan.

HUANG Ya-ping,ZU Li-hong,SHEN Guang-shuang,GAO Zhang-ying,ZHOU Mei-li,SHI Fu-chen*
（College of Life Science,Nankai University,Tianjin 300071,China）

In the present study,Althaea rosea Cavan.was exposed to different concentrations of lead（Pb）（0,50,100,200,and 500 mg·kg-1）for 70 d to evaluate its morphological,physiological,and biochemical responses.The results showed that Pb stress inhibited the growth of different parts of A.rosea,but lower concentrations stimulated an increase in biomass of the shoots.In addition,the accumulation of Pb was found to increase in a concentration-dependent manner,with a maximum of 13.44 μg·g-1in the shoots and 17.72 μg·g-1in the roots at 500 mg·kg-1.Leaf electrolyte leakage,hydrogen peroxide,superoxide anion,and malondialdehyde contents accumulated significantly as the concentration of Pb increased.In contrast,the content of chlorophyll decreased with increasing Pb concentration.In addition,the activities of antioxidant enzymes increased under lower Pb levels,but decreased at higher Pb levels.At the Pb concentration of 100 mg·kg-1,the activity of superoxide dismutase,peroxidase,catalase,and ascorbate peroxidase increased by 5.6%,29.36%,22.48%,and 54.19%,respectively.This study signifies that A.rosea can adjust its own physiological and biochemical mechanisms to adapt to Pb stress,thus A.rosea can be used for soil remediation in contaminated areas.

lead stress;Althaea rosea Cavan.;antioxidant enzymes;accumulation characteristics;phytoremediation

X503.233

A

1672-2043（2017）09-1746-07

10.11654/jaes.2017-0328

黃亞萍，俎麗紅，沈廣爽，等.鉛脅迫對蜀葵重金屬積累及抗氧化酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（9）：1746-1752.

HUANG Ya-ping,ZU Li-hong,SHEN Guang-shuang,et al.Effects of lead stress on accumulation ability and antioxidant enzyme activities of Althaea rosea Cavan[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（9）:1746-1752.

2017-03-10

黃亞萍（1988—），女，博士研究生，從事環(huán)境與資源植物學(xué)研究。E-mail：huangyaping2012@126.com

*通信作者：石福臣E-mail：fcshi@nankai.edu.cn

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項（2011FY110300）

Project supported：The Basic Research Program of Ministry of Science and Technology