雷珠單抗競爭結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子A抑制裸鼠皮下血管瘤細(xì)胞生長的實驗研究

黃崇青 虞冠鋒 黃景勇 麻朋艷 萬麗 范良好

雷珠單抗競爭結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子A抑制裸鼠皮下血管瘤細(xì)胞生長的實驗研究

黃崇青 虞冠鋒 黃景勇 麻朋艷 萬麗 范良好

目的探索觀察雷珠單抗（Ranibizumab）競爭結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）抑制裸鼠皮下血管瘤的相對療效及副作用。方法BALB/c裸鼠30只，采用密度為1×107個/mL血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（EOMA）200μL單側(cè)腋下皮下注射法建立血管瘤裸鼠模型，在接種EOMA細(xì)胞9天后給予相應(yīng)藥物治療。具體分組為：對照組只接種EOMA細(xì)胞，無藥物治療；雷珠單抗低、中、高劑量組接種EOMA細(xì)胞并給予0.25、0.5和0.75mg/cm3雷珠單抗治療；平陽霉素組接種EOMA細(xì)胞并給予1mg/cm3平陽霉素治療，每組6只。觀察各組裸鼠成瘤情況并測量腫瘤體積，免疫組織化學(xué)（IHC）法檢測各組裸鼠腫瘤組織CD34、Ki67表達(dá)，HE染色后觀察各組裸鼠肺、心、肝、腎組織病理變化。結(jié)果第9～12天各組裸鼠血管瘤體積增長最快，第12～24天雷珠單抗低、中、高劑量組、平陽霉素組裸鼠血管瘤體積增長減緩，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[第12天：（44.44±13.11）mm3、（45.71± 7.69）mm3、（35.37±11.96）mm3、（41.44±3.75）mm3比（61.91±17.09）mm3，P均＜0.05；第15天：（52.16± 13.28）mm3、（48.18±14.46）mm3、（33.52±9.97）mm3、（47.22±10.86）mm3比（72.98±14.85）mm3，P均＜0.05；第18天：（56.50±6.96）mm3、（51.56±11.10）mm3、（36.57±18.79）mm3、（51.36±5.21）mm3比（95.58±19.10）mm3，P均＜0.01；第21天：（62.88±9.76）mm3、（60.34±12.80）mm3、（39.45±18.47）mm3、（54.95±4.37）mm3比（123.46±18.03）mm3，P均＜0.01；第24天：（70.85±8.73）mm3、（69.84±16.33）mm3、（41.83±18.65）mm3、（61.52±8.12）mm3比（171.76±52.46）mm3，P均＜0.01）；與平陽霉素組比較，雷珠單抗高劑量組裸鼠血管瘤體積顯著縮小[第12天：（35.37±11.96）mm3比（41.44±3.75）mm3，P＜0.05；第15天：（33.52±9.97）mm3比（47.22±10.86）mm3，P＜0.05；第18天：（36.57±18.79）mm3比（51.36± 5.21）mm3，P＜0.05；第21天：（39.45±18.47）mm3比（54.95±4.37）mm3，P＜0.05；第24天：（41.83±18.65）mm3比（61.52±8.12）mm3，P＜0.05）；雷珠單抗低、中、高劑量組和平陽霉素組裸鼠血管瘤組織CD34和Ki67蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），且雷珠單抗?jié)舛仍礁?，降低越明顯。各組裸鼠肺組織受到不同程度的損傷，但雷珠單抗高劑量組裸鼠肺組織損傷程度較平陽霉素輕；各組裸鼠心、肝、腎組織無明顯變化。結(jié)論雷珠單抗抑制裸鼠皮下血管瘤細(xì)胞生長作用顯著，其作用可能與下調(diào)血管瘤組織CD34、Ki67表達(dá)有關(guān)，對裸鼠肺組織損傷要較平陽霉素輕。

裸鼠；血管瘤；血管內(nèi)皮生長因子A；雷珠單抗；平陽霉素

血管瘤是先天性良性腫瘤或血管畸形，因其復(fù)發(fā)率高、手術(shù)風(fēng)險及難度大，治療后殘留疤痕。因此尋找創(chuàng)傷小、療效佳、復(fù)發(fā)率低的治療方法成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)的一大難題。藥物治療是血管瘤病的治療首選[1]，其中我國最具代表性的是平陽霉素（pingyangmycin），但其療效不甚理想[2]。雷珠單抗（ranibizumab）能更緊密結(jié)合到血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）上[3]。被認(rèn)為是一種強效的血管生成抑制劑（angiogenesis inhibitor），其導(dǎo)致血管凋亡的治療效果明確，已被批準(zhǔn)用于治療與皮下組織血管瘤發(fā)病相似的老年性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）[4]。但是對于治療皮下結(jié)締組織血管瘤病變，目前國內(nèi)外尚缺少研究。本研究旨在探討建立動物實驗?zāi)Ｐ拖掠^察雷珠單抗競爭結(jié)合VEGF-A抑制裸鼠皮下結(jié)締組織血管瘤的相對療效及副作用。通過HE染色觀察不同處理組裸鼠心、肺、肝、腎及血管瘤區(qū)域組織的病理變化。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測不同處理組裸鼠血管瘤組織CD34和Ki67的蛋白表達(dá)情況。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SPF級BALB/c裸鼠共30只，購自南京醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（蘇）2016-0002，雌雄不拘，3～4周齡，體質(zhì)量18.0～20.0g。所有動物均在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室飼養(yǎng)，喂養(yǎng)飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。未進(jìn)行任何治療的小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(EOMA細(xì)胞)購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 試劑及藥物雷珠單抗注射液（批號p2013080 2142430969）（Novartis公司，瑞士），平陽霉素（批號YB01156）（上海鈺博），血管性血友病因子（vWF）抗體（批號00049557）（Proteintech），CD34抗體（批號J1119）（Santa cruz），Ki67抗體（批號23DB17）（Affinity），臺盼藍(lán)（批號mkbp3291v）（Sigma），Triton-X100（批號BLBD4155V），青鏈霉素混合液（批號20160317），胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（批號20160224），4%多聚甲醛（批號20160311），磷酸鹽緩沖液（PBS）（批號20160314），中性樹脂（批號20160515）（Solarbio），廣譜二抗（批號LD010024），3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）濃縮型試劑盒（批號LDD10118）（上海長島生物技術(shù)有限公司），熒光二抗（批號B20160122），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（批號20160207），抗熒光淬滅封片劑（批號20160207）（碧云天），蘇木素（批號16B01S22）（BASO），蘇木素-伊紅染色試劑盒（批號16L03A14）（博士德）；牛血清白蛋白（BSA）（批號SG16HZ0322）（生工生物），胎牛血清（FBS）（批號AB216694）（Hyclone），EBM2培養(yǎng)基（批號8112655）（LONZA），細(xì)胞培養(yǎng)皿/瓶（批號03316010）（Corning），石蠟（批號20160205），二甲苯（批號20160111），無水乙醇（批號20160207），氨水（批號20160118），3%H2O2（批號20160107），3%甲醛溶液（批號20160107）（上海國藥集團(tuán)）等。

2 實驗方法

2.1 臺盼藍(lán)染色取完全內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基上（成分為EBM2培養(yǎng)基+2%FBS+1%雙抗）對數(shù)生長期的EOMA細(xì)胞，傳代前24h換培養(yǎng)液。用0.25%的胰蛋白酶于37℃消化細(xì)胞1～2min，待大部分細(xì)胞收縮變圓、即將脫壁時棄去胰蛋白酶，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，并以無菌吸管輕輕吹打混勻，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿底脫落成為細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液，離心（1000rpm，5min），棄上清，加入1mL培養(yǎng)液于2mL離心管內(nèi)，以無菌吸管輕輕吹打?qū)⒓?xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液（不能用力過猛，以不出現(xiàn)泡沫為宜）。吸取出10μL于血球計數(shù)板上，于顯微鏡下計數(shù)。計數(shù)后將細(xì)胞懸液的濃度調(diào)整為106個/mL。取適當(dāng)細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)染色液以9∶1的比例混合均勻。在3min內(nèi)分別計數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。

2.2 免疫熒光鑒定血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞爬片：蓋玻片滅菌烘干，放入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，EOMA細(xì)胞進(jìn)行單層細(xì)胞爬片。固定細(xì)胞：待細(xì)胞密度約70%時，去培養(yǎng)基先用PBS洗滌1次，再用3%甲醛溶液固定，室溫固定10～15min，后用PBS洗滌3次。穿透：標(biāo)本放置于12孔板，用1%Triton-X100進(jìn)行打孔穿透，室溫孵育5～10min，用PBS洗滌3次。封閉：在封口膜劃分操作區(qū)域，每個樣本位點加適量3% BSA封閉液，室溫封閉30min。一抗孵育：1∶200稀釋一抗，置于濕盒4°℃封閉過夜，PBS洗滌3次。二抗及DAPI核染：1∶500稀釋熒光二抗和DAPI混合液，避光室溫孵育30～60min，后用PBS洗滌3次。封片固定：用熒光淬滅封片劑在載玻片上進(jìn)行封片，指甲油描邊固定玻片。熒光顯微鏡拍片，放大倍數(shù)為200倍。

2.3 裸鼠成瘤動物模型建立及分組治療30只裸鼠隨機分成五組，每組6只，對照組為接種EOMA細(xì)胞的BALB/c裸鼠，無藥物治療；雷株單抗低劑量組為接種EOMA細(xì)胞的BALB/c裸鼠+0.25mg/cm3雷珠單抗；雷株單抗中劑量組為接種EOMA細(xì)胞的BALB/c裸鼠+0.5mg/cm3雷珠單抗；雷株單抗高劑量組為接種EOMA細(xì)胞的BALB/c裸鼠+0.75mg/cm3的雷珠單抗；平陽霉素組為接種EOMA細(xì)胞的BALB/c裸鼠+1mg/cm3平陽霉素。取EOMA細(xì)胞接種培養(yǎng)至70%～80%，胰酶消化后濃集制成細(xì)胞懸浮液，使其密度為1×107個/mL，200μL皮下注射于BALB/c裸鼠單側(cè)腋下，建立血管瘤模型，此過程注意無菌操作，每隔3天測定腫瘤體積，造模9天后加藥治療，繼續(xù)每隔3天測定腫瘤體積。

2.4 蘇木素-伊紅染色（HE）染色各組接受處理后裸鼠的腫瘤組織及肺、心、肝、腎組織HE染色并進(jìn)行圖像采集和分析。

2.5 免疫組織化學(xué)（IHC）檢測分別在藥物注射后15天取腫瘤組織，石蠟切片制備，免疫組化染色CD34和Ki67。具體操作如下：切片：切片前將蠟塊在-20℃冰箱至少放置30min，以增加硬度。將切片刀裝在刀片機的刀架上并固定緊，固定蠟塊底座或蠟塊，調(diào)整蠟塊與刀至合適位置，刀刃與蠟塊表面呈5度角。調(diào)整切片機上的切片厚度為4～7μm，然后切片?？酒兔撓?。將玻片置于65℃恒溫烘箱中烤片30min；置于二甲苯Ⅰ中浸泡15min，再置于二甲苯Ⅱ中浸泡15min。水化。將脫蠟后的切片經(jīng)100、95、85、75%酒精分別浸泡5min，自來水沖洗10min?？乖迯?fù)。本研究采用0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液中高壓修復(fù)15min，自然冷卻后，0.02M PBS洗3次，每次3min，將玻片置于3%過氧化氫（H2O2）中，濕盒孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。0.02M PBS沖洗3次，每次3min。一抗孵育。滴加一抗（（陰性對照可用PBS代替一抗）），濕盒孵育，室溫下放置1h（或者4℃孵育過夜）。0.02M PBS沖洗3次，每次3min。二抗孵育，滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20～30min。0.02M PBS沖洗3次，每次3min。顯色，DAB染色，觀察到切片有顏色改變時，立即用自來水洗去染色液。蘇木素染色,蘇木素復(fù)染3min，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度。自來水沖洗10min，放入65℃烘箱中烘干水分。透明和封片將玻片置于二甲苯中透明2次，每次3min，中性樹膠封片，放入65℃烘箱中15min。最后行圖像采集和分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法初步數(shù)據(jù)錄入EXCEL（2007版）進(jìn)行邏輯校對與分析，應(yīng)用SPSS22.0軟件對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。一般資料以（） 表示，單因素方差分析加post-hoc LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代分離及鑒定EOMA細(xì)胞培養(yǎng)過程中狀態(tài)較好，死細(xì)胞很少（見插頁圖1）。免疫熒光檢測顯示，在原代分離的EOMA細(xì)胞中檢測到vWF蛋白表達(dá)陽性率為93%左右。在原代分離的EOMA細(xì)胞中檢測到CD34蛋白表達(dá)陽性率為97%左右（見插頁圖2～3）。

3.2 EOMA細(xì)胞裸鼠成瘤及藥物治療第9～12天腫瘤體積增長最快，因此后續(xù)各組裸鼠在接種EOMA細(xì)胞9天后進(jìn)行治療（見插頁圖4）。

與對照組比較，雷株低、中、高劑量組、平陽霉素組裸鼠腫瘤體積在未加藥治療之前（0～9天）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），加藥治療之后（12～21天）腫瘤體積明顯減小。至第24天，對照組裸鼠腫瘤體積顯著增大，各實驗組裸鼠腫瘤體積均顯著縮小，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；與平陽霉素組比較，雷株低、中劑量組裸鼠腫瘤體積變化基本接近（P＞0.05），雷株高劑量組裸鼠腫瘤體積小于平陽霉素組（P＜0.05）。見表1。

3.3 HE染色腫瘤組織及肺、心、肝、腎的病理變化與對照組比較，雷株低、中、高劑量組、平陽霉素組裸鼠肺組織損傷（肺水腫、肺泡壁增厚）程度明顯加重，且濃度雷珠單抗?jié)舛仍礁撸瑩p傷越明顯，其中平陽霉素組損傷程度最為明顯，雷株高劑量組損傷程度次之。與對照組比較，雷株低、中、高劑量組、平陽霉素組裸鼠心、肝、腎組織無明顯變化（見插頁圖5）。對照組裸鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖并聚集成團(tuán)，界限清晰，組織內(nèi)可見明顯的微細(xì)血管瘤；雷株低、中、高劑量組、平陽霉素組裸鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，彼此界限不清，血管瘤組織有不同程度的消退。且雷珠單抗?jié)舛仍礁?，消退效果越明顯（見插頁圖6）。

3.4 各組裸鼠腫瘤組織CD34和Ki67表達(dá)量比較與對照組比較，雷株低、中、高劑量組、平陽霉素組裸鼠腫瘤組織CD34和Ki67蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），且濃度雷珠單抗?jié)舛仍礁?，下降越明顯，其中雷珠單抗高劑量組和平陽霉素組效果最明顯。與平陽霉素組比較，雷株低、中、高劑量組裸鼠腫瘤組織CD34和Ki67蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見插頁圖7。

4 討論

4.1 雷珠單抗治療血管瘤病變的機制分析雷珠單抗（商品名Lucentis）是一種重組人源化單克隆抗體（FAB），最初用于抑制腫瘤血管生成[5]。其受體結(jié)合部位是血管內(nèi)皮生長因子中最重要的血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A），VEGF-A與VEGF受體（vascular endothelial growth factor re-ceptor，VEGFR）結(jié)合后可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生促血管生成作用和滲漏，是新生血管形成中的關(guān)鍵因素[6]。這種單克隆抗體與VEGF-A結(jié)合防止并阻礙了血管內(nèi)皮生長因子受體在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的相互作用。導(dǎo)致血管瘤的發(fā)生發(fā)展及消退的標(biāo)志細(xì)胞-增殖期血管瘤細(xì)胞（HemECs）的凋亡[7]。從而阻止血管內(nèi)皮增生，減少血管的滲漏和新血管的生成。其導(dǎo)致血管凋亡的治療效果已被批準(zhǔn)用于治療濕性（新生血管性）老年性黃斑變性，此病系眼底色素上皮層下活躍的新生血管引起，與皮下組織血管瘤發(fā)病相似，雷珠單抗對其有效作用率可達(dá)89%[4]。此外對于其余眼科血管性疾病如：息肉樣脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變（polypoidal choroidal vasculopathy，PCV）[8]，視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）引起的黃斑水腫[9]，糖尿病性黃斑水腫（diabetic macular edema，DME）[10]，脈絡(luò)膜新生血管（choroidalneovascularization，CNV）[11-12]，新生血管性青光眼（neovascular glaucoma，NVG）[13]，均有肯定的報道?；诖?，本研究在建立動物模型的基礎(chǔ)上，探討其對于皮下結(jié)締組織血管瘤病變的治療作用。

4.2 細(xì)胞注射法血管瘤動物實驗?zāi)Ｐ偷姆治霰狙芯坎捎玫呐_盼藍(lán)染色檢測原代血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)表明，EOMA細(xì)胞培養(yǎng)過程中狀態(tài)較好，死細(xì)胞很少。免疫熒光檢測原代分離的EOMA細(xì)胞中vWF和CD34蛋白表達(dá)均在90%以上。我們采用提取的EOMA細(xì)胞，注射法建立BALB/c裸鼠皮下血管瘤模型[14]。其成瘤曲線表明9～12天腫瘤體積增長最快，因此這段時間是藥物治療腫瘤最好的窗口期。

表1 各組裸鼠腫瘤體積比較（mm3，）

表1 各組裸鼠腫瘤體積比較（mm3，）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與平陽霉素藥組比較，△P＜0.05

組別對照組雷株低劑量組雷株中劑量組雷株高劑量組平陽霉素組鼠數(shù)6 6 6 6 6 0d 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 3d 2.22±1.19 2.50±1.51 2.32±1.77 2.70±2.11 2.66±2.07 6d 9.17±3.11 8.07±3.08 9.50±1.19 7.04±3.56 7.56±3.83 9d 20.69±6.57 19.78±8.42 21.28±1.78 20.09±5.83 19.94±2.01 12d 61.91±17.09 44.44±13.11* 45.71±7.69* 35.37±11.96*△41.44±3.75* 15d 72.98±14.85 52.16±13.28* 48.18±14.46* 33.52±9.97*△47.22±10.86* 18d 95.58±19.10 56.50±6.96** 51.56±11.10** 36.57±18.79**△51.36±5.21** 21d 123.46±18.03 62.88±9.76** 60.34±12.80** 39.45±18.47**△54.95±4.37** 24d 171.76±52.46 70.85±8.73** 69.84±16.33** 41.83±18.65**△61.52±8.12**

4.3 藥物治療血管瘤的療效對比分析各藥物治療后，各個時期的藥物治療組裸鼠血管瘤體積均有明顯減小，且以0.75mg/cm3的雷珠單抗治療組與平陽霉素治療組的效果最為明顯。與平陽霉素治療組比較，0.75mg/cm3的雷珠單抗治療組療效稍優(yōu)于平陽霉素治療組，其余各組相當(dāng)。血管瘤HE染色表明，無藥物治療的基礎(chǔ)對照組裸鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖并聚集成團(tuán)，界限清晰，組織內(nèi)可見明顯的微細(xì)血管瘤，故細(xì)胞注射法建立的皮下結(jié)締組織血管瘤動物模型成瘤效果理想；不同濃度雷珠單抗治療組及平陽霉素治療組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，彼此界限不清，血管瘤組織有不同程度的消退。且雷珠單抗?jié)舛仍礁?，消退效果越明顯。上述結(jié)果表明，各藥物對裸鼠血管瘤有不同程度的治療作用。而0.75mg/cm3的雷珠單抗治療組療效最為明顯。

HE染色觀察不同處理組裸鼠肺、心、肝、腎的病理變化表明，不同濃度雷珠單抗治療組及平陽霉素治療組裸鼠均出現(xiàn)非致死性肺組織損傷，表現(xiàn)為肺水腫、肺泡壁增厚，其中平陽霉素治療組損傷程度最為明顯，0.75mg/cm3的雷珠單抗治療組損傷程度次之。與無藥物治療的基礎(chǔ)對照組比較，不同濃度雷珠單抗治療組及平陽霉素治療組裸鼠心、肝、腎組織無明顯變化。上述結(jié)果表明，各藥物治療后，裸鼠肺組織受到不同程度的損傷，其他組織無明顯變化，但雷珠單抗治療組對于肺組織的損傷要輕于平陽霉素。

CD34和Ki67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物[15]。免疫組織化學(xué)檢測不同處理組裸鼠血管瘤組織中CD34和Ki67的蛋白表達(dá)情況表明，不同濃度雷珠單抗治療組及平陽霉素治療組裸鼠血管瘤組織CD34和Ki67蛋白表達(dá)明顯下降，且雷珠單抗?jié)舛仍礁撸陆翟矫黠@，0.75mg/cm3的雷珠單抗治療組和平陽霉素治療組效果最明顯。不同濃度雷珠單抗治療組與平陽霉素治療組比較，裸鼠血管瘤組織CD34和Ki67蛋白表達(dá)基本接近。上述結(jié)果表明，雷珠單抗治療后，血管瘤組織中細(xì)胞增殖明確受到抑制，并且其抑制作用基本相當(dāng)。

總之，本研究表明，利用細(xì)胞注射法建立裸鼠皮下血管瘤模型的方法是切實可行與成熟的。對比平陽霉素，雷珠單抗治療皮下結(jié)締組織血管瘤病變，通過阻礙血管內(nèi)皮生長因子通路，抑制異常增生血管瘤組織細(xì)胞的增生作用是顯著的，且均不影響對于生命相關(guān)的循環(huán)、消化及泌尿系統(tǒng)，而對于肺組織的損傷要輕于平陽霉素。對于改善及預(yù)防其嚴(yán)重并發(fā)癥，類胰島素生長因子（IGF-1）、丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）等細(xì)胞生長因子信號通路激活藥物是否有效，需要后期進(jìn)一步研究。

［1］鄭家偉，楊秀娟.血管瘤的治療選擇［J］.中國實用口腔科雜志，2009，2（5）：274-279.

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（收稿：2017-02-22 修回：2017-05-20）

Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor A by Ranibizumab in Subcutaneous Hemangiomas in Nude Mice

HUANG Chongqing1,YU Guanfeng1,HUANG Jingyong1,MA Pengyan1,WAN Li2,FAN Lianghao3.1

Department of Vascular Surgery,2 Department of Pathology,3 Department of Interventional Therapy,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015,China

ObjectiveTo investigate the relative efficacy and side effects of ranibizumab competitive combined with vascular endothelial growth factor A（VEGF-A）in inhibiting subcutaneous hemangioma in nude mice.Methods Thirty animal model was established by injecting hemagioma cells（EOMA,1×107/mL,200μL）to subcutaneous tissue of nude mice.The nude mice were divided into 5 groups,with 6 mice in each.Drugs were given after 9 daysincubation of EOMA.Group A∶control group,without drug therapy.Group B∶group of injection with 0.25mg/cm3ranibizumab.Group C∶group of injection with 0.5mg/cm3ranibizumab.Group D∶injection of 0.75mg/cm3ranibizumab.Group E∶drug control group,injection of 1mg/cm3pingyangmycin.Tumor growth was observed and the body weight of mice was measured after treatment.Immunohistochemistry was used to detect the expression of CD34 and Ki67 in tumor tissue and HE staining was applied to observe the pathology of Lung,heart,liver and renal tissues of mice.ResultsTumor grew the fastest during 9 to 12 days.On day 12,15,18,21 and 24,the tumor volume was reduced in Group B,C,D,E compared with that in Group A（day 12∶44.44±13.11mm3,45.71±7.69mm3, 35.37±11.96mm3,41.44±3.75mm3vs 61.91±17.09mm3,all P＜0.05;day 15∶52.16±13.28mm3,48.18±14.46mm3, 33.52±9.97mm3;47.22±10.86mm3vs 72.98±14.85mm3,all P＜0.05;day 18∶56.50±6.96mm3,51.56±11.10mm3,36.57± 18.79mm3,51.36±5.21mm3vs 95.58±19.10mm3,all P＜0.01;day 21∶62.88±9.76mm3,60.34±12.80mm3,39.45± 18.47mm3,54.95±4.37mm3vs 123.46±18.03mm3,all P＜0.01;day 24∶70.85±8.73mm3,69.84±16.33mm3,41.83± 18.65mm3,61.52±8.12mm3vs 171.76±52.46mm3,all P＜0.01）;compared with Group E,the anti-tumor effect in Group D was more obvious at each time point（all P＜0.05）.The expression of CD34 and Ki67 protein in tumor tissue of nude mice in Group B～E was significantly decreased as compared to Group A;the decrease appeared to be in a dose-dependent manner in Group B～D.After treatment,the lung tissue of nude mice was damaged in different degrees in every group;however,the damage in Group D was the less;no pathological changes were observed in other tissues in every group.ConclusionRanibizumab can obviously inhibit the growth of hemangioma, which may be related to its downregulation of CD34 and Ki67 in tumor tissue and ranibizumab has less damage to the lung tissue than Pingyangmycin does.

nude mice;hemangioma;VEGF-A;ranibizumab;pingyangmycin

book=747,ebook=16

浙江省溫州市公益性社會發(fā)展科技項目（No.Y20160407）

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科（黃崇青、虞冠鋒、黃景勇、麻朋艷）、病理科（萬麗）、介入科（范良好）（溫州325015）

黃崇青，Tel：0577-55579133；E-mail：christopherhuang@qq.com