決明子萘并吡喃酮類對照提取物研究及其在決明子藥材質(zhì)量控制中的應用

周德勇　駱宜　蘇磊　姜艷艷　劉斌

[摘要] 建立以決明子萘并吡喃酮類對照提取物為對照的決明子藥材質(zhì)量控制方法，探討對照提取物在中藥質(zhì)量控制中應用的可行性。采用色譜分離技術(shù)制備決明子萘并吡喃酮類對照提取物，以決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷及決明子苷C對照品為對照，對決明子萘并吡喃酮類對照提取物進行標定。以已知含量的對照提取物為對照，建立決明子藥材HPLC含量測定方法，并與以對照品為對照的含量測定結(jié)果進行比較，結(jié)果表明，2種含量測定方法無顯著差異。該結(jié)果為決明子萘并吡喃酮類對照提取物在決明子藥材質(zhì)量控制中的應用提供科學依據(jù)，為中藥對照提取物替代單一對照品進行中藥質(zhì)量控制奠定基礎，為中藥質(zhì)量控制提供新的研究思路和模式。

[關鍵詞] 決明子； 對照提取物； 萘并吡喃酮； 質(zhì)量控制； 應用

Study on naphthopyrone reference extract and application on

assay of Semen Cassiae

ZHOU Deyong1， LUO Yi1， SU Lei1， JIANG Yanyan1，2*， LIU Bin1*

（1. School of Chinese Pharmacy， Beijng University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Quality Control Technology and Engineering Center of Chinese Medicine， Beijing Municipal

Commission of Education， Beijing 100102， China）

[Abstract] A quality control method of Semen Cassiae was established by using naphthopyrone reference extract（NRE）. Meanwhile， the feasibility about NRE replacing single component reference in quality control of traditional Chinese medicine was explored. After NRE of Semen Cassiae being prepared by chromatographic separation technology， we determined the three main components， cassiaside B2， rubrofusarin6OβDgentiobioside and cassiaside C. In the meantime， an HPLC analytical method， based on the NRE as standard substance， was developed to determinate the contents of three main components in Semen Cassiae. Ttest was used for comparison of the determination results of the two methods（single chemical component and NRE as reference substances， respectively）， and the Ttest result demonstrated that there was no significant difference between the two methods. The results developed scientific basis for the application of NRE of Semen Cassia in the quality control， which could be applied for the quality control of traditional Chinese medicine using reference extract substituting single chemical reference， and provide a new research model for the quality control of Chinese medicine.

[Key words] Semen Cassiae； standard reference extract； naphthopyrone； quality control； application

中藥質(zhì)量控制與評價是中藥研究領域的重要科學問題，現(xiàn)行中藥質(zhì)量控制方法主要以單一化學成分為對照品，從定性和定量角度對中藥及復方進行質(zhì)量控制。這種以單一化學成分表征中藥整體質(zhì)量的模式無法真正控制和評價中藥質(zhì)量，與中醫(yī)藥整體觀亦不相符，在一定程度上阻礙了中藥現(xiàn)代化、國際化的進程。中藥成分的復雜性決定了以單一成分或指標成分為對照難以客觀評價中藥質(zhì)量，然而，多指標成分的質(zhì)量評價模式卻受到中藥化學對照品分離難度大、單體穩(wěn)定性差或?qū)嶒灣杀靖叩纫蛩氐闹萍s[1]。針對這一問題，有研究者[23]提出了一測多評法，該方法可在一定程度上解決中藥多成分同時定量的一些問題，但同時該方法在相對校正因子的定量、指標成分的色譜峰定性，尤其是方法的適用性和耐用性方面尚存在一些問題。因此，建立符合中藥多成分特點的新方法是解決中藥質(zhì)量控制問題的有效途徑。

中藥對照提取物是指主要化學成分及其含量明確、穩(wěn)定性好、純度較高的中藥提取物，其化學成分組分比例相對固定，指標性成分含量已采用相應的對照品進行標定，可以實現(xiàn)同時對多個組分進行定性和定量分析，不但制備方法相對簡單、成本較低，而且后續(xù)質(zhì)量控制過程相對簡潔、實驗步驟相對簡便，用于中藥材多成分分析，可節(jié)約資源，降低檢驗成本[4]。如2015年版《中國藥典》收載了銀杏葉片劑2 種可供選擇使用的含量測定方法，若使用化學對照品進行含量測定，則需使用槲皮素、山柰素、異鼠李素等7種化學對照品，若使用已標定的2種銀杏葉對照提取物進行含量測定，成本將大大降低，同時可以減少單體對照品的使用，減少實驗步驟和實驗成本[5]。因此，中藥對照提取物的研發(fā)與應用不僅可以解決中藥質(zhì)量控制中成本高、穩(wěn)定性差、重現(xiàn)性差等諸多問題[68]，而且為更科學、合理、系統(tǒng)的開展中藥質(zhì)量控制，提供新的研究方法和研究模式。endprint

決明子為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明C. tora L.的干燥成熟種子，具有清肝明目、潤腸通便的功效，臨床多用于治療目赤澀痛、頭痛眩暈、目暗不明、大便秘結(jié)等[9]。決明子中主要含有蒽醌類化合物和萘并吡喃酮類化合物[1012]，此外，還含有多糖、蛋白質(zhì)、脂肪酸以及多種微量元素。2015年版《中國藥典》以大黃酚和橙黃決明素為指標對其進行質(zhì)量控制，然而，蒽醌類化合物并非決明子中專屬性化學成分，且含量較低，因而，以其為對照品進行質(zhì)量控制，難以全面、科學的反映決明子藥材質(zhì)量[5]。文獻及前期研究結(jié)果表明，萘并吡喃酮類化合物在決明子藥材中的含量明顯高于蒽醌類成分，且具有保肝、降血脂等作用[1314]，是決明子中的重要藥效物質(zhì)基礎。因此，制備決明子萘并吡喃酮類對照提取物[15]，并以其為對照物質(zhì)，建立基于萘并吡喃酮類對照提取物的含量測定方法，能夠明確對照提取物在決明子質(zhì)量控制中的適用性和可行性，提升決明子藥材質(zhì)量控制方法的科學性和專屬性，解決萘并吡喃酮類成分決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷及決明子苷C對照品稀缺、價格昂貴等問題，同時為建立科學合理的決明子藥材質(zhì)量標準奠定基礎。

1 材料

SHBⅢ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；KQ500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Waters高效液相色譜儀，包括1525型二元高壓梯度泵系統(tǒng)，2998型DAD檢測器，2414型柱溫控制系統(tǒng)，2707型自動進樣系統(tǒng)，Breeze色譜工作站（美國Waters公司）；Sunfire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Sartorious BT 25S型1/10萬電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。乙腈、甲醇（色譜純，F(xiàn)isher公司）；屈臣氏純凈水；其他試劑均為分析純。

對照品決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷及決明子苷C均為自制，經(jīng)1H，13CNMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測，峰面積歸一化法計算，純度均大于98%。

決明子藥材均購于北京同仁堂，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院劉春生教授鑒定為決明C. obtusifolia的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 決明子萘并吡喃酮類對照提取物的研究

2.1.1 對照提取物制備

決明子藥材，10倍量30%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，水分散，AB8型大孔樹脂純化，依次用水、20%乙醇、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫部位，回收溶劑，蒸干后，得到?jīng)Q明子半制備組分Ⅰ。將半制備組分Ⅰ與硅膠（3∶5）均勻拌樣，于80 ℃ 真空干燥，以拌樣硅膠與空白硅膠1∶13干法上樣，氯仿甲醇水（6.5∶3.5∶0.6）洗脫，洗脫完成后將干柱分成20部位，合并2～7，11～17硅膠，加甲醇洗脫，回收溶劑，蒸干后，得到?jīng)Q明子半制備組分Ⅱ。將半制備組分Ⅱ通過ODS柱純化，以甲醇乙腈（2∶1）混合溶液為A相，以水為B相進行梯度洗脫，洗脫程序為30% A（2倍柱體積）， 33% A（1倍柱體積）， 36% A（1倍柱體積）， 39% A（1倍柱體積）， 42% A（1倍柱體積）， 45% A（1倍柱體積），通過薄層色譜法檢識，合并含有指標成分的洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，即得決明子萘并吡喃酮類對照提取物。

2.1.2 對照提取物標定

以決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C對照品為對照，測定決明子萘并吡喃酮類對照提取物中3個指標成分的含量。

2.1.2.1 色譜條件 色譜柱SunFire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇乙腈（2∶1）混合溶液（A）水（B）梯度洗脫（0～35 min， 31% A；35～45 min，31%～37% A；45～50 min，37%～42% A）；流速1 mL·min-1；檢測波長278 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。在此色譜條件下，混合對照品和對照提取物色譜圖見圖1。

2.1.2.2 對照品溶液配制 精密稱取決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C對照品適量，分別制得每1 mL含0.053 52 mg決明子苷B2，0.079 56 mg紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷，0.069 84 mg決明子苷C的混合對照品溶液，再用純甲醇稀釋成一系列不同濃度的混合對照品溶液。

2.1.2.3 供試品溶液配制 精密稱取決明子萘并吡喃酮類對照提取物3.00 mg，置于25 mL量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，靜置，定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2.4 線性關系考察 取2.1.2.2項的不同濃度混合對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。以對照品進樣量（X）為橫坐標，色譜峰峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得出回歸方程，結(jié)果見表1。

2.1.2.5 精密度考察 取2.1.2.3項決明子供試品溶液，每次吸取10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，以決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C色譜峰峰面積計算RSD，結(jié)果分別為0.54%， 0.72%， 0.61%，表明儀器精密度良好。

2.1.2.6 穩(wěn)定性試驗 取2.1.2.3項決明子供試品溶液，分別于制備后0， 2， 4， 6， 8， 12， 24 h進樣，測定決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C色譜峰峰面積，計算RSD分別為0.96%， 1.1%， 0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.2.7 重復性試驗 分別精密稱定決明子萘并吡喃酮類對照提取物6份，按2.1.2.3項方法制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，計算決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C的RSD，結(jié)果分別為1.2%， 1.1%， 1.2%，表明該方法重復性良好。endprint

2.1.2.8 加樣回收率試驗 分別精密稱定決明子萘并吡喃酮類對照提取物6份，加入一定量的對照品溶液，按2.1.2.3項方法制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積，并計算3個指標成分的加樣回收率及RSD。結(jié)果決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C的加樣回收率分別為98.36%，102.8%，100.8%，RSD分別為1.7%，1.3%，1.5%。

2.1.2.9 對照提取物標定 取3批自制決明子萘并吡喃酮類對照提取物，精密稱定，按2.1.2.3項制備樣品溶液，測定并計算各樣品中3個指標性成分的含量，結(jié)果3個成分的總含量均高于60%，3批對照提取物含量標定結(jié)果見表2。

2.1.3 對照提取物穩(wěn)定性考察

采用2.1.2.1項的HPLC含量測定方法，考察決明子萘并吡喃酮類對照提取物的穩(wěn)定性。對照提取物經(jīng)制備后，常溫避光保存，進行6個月穩(wěn)定性實驗，分別于第0， 1， 2， 3， 6個月抽樣檢測，分析樣品中決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C含量，結(jié)果見表3，3個指標性成分的RSD分別為0.24%，0.25%，0.15%，均小于1%，表明決明子萘并吡喃酮類對照提取物在6個月內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 對照提取物在決明子藥材質(zhì)量控制中的應用

以決明子萘并吡喃酮類對照提取物為對照，測定決明子藥材中決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷及決明子苷C等3個成分的含量，并與單體對照品測得的結(jié)果進行比較，考察對照提取物用于藥材質(zhì)量控制的科學性和可行性。

2.2.1 色譜條件

采用2.1.2.1項條件，對照提取物和供試品色譜圖見圖2。

2.2.2 對照提取物溶液制備

精密稱取已標定含量的決明子萘并吡喃酮類對照提取物6.12 mg，置10 mL量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，靜置，搖勻，30%甲醇稀釋至刻度，制得每1 mL含0.122 0 mg決明子苷B2，0.131 5 mg紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷，0.147 3 mg決明子苷C的母液。精密吸取母液1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加30%甲醇稀釋，定容，搖勻，制成每1 mL含0.012 20 mg決明子苷B2，0.013 15 mg紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷，0.014 73 mg決明子苷C的對照提取物溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

取決明子藥材粉末（20目）60 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理（100 kHz）30 min，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察 精密吸取2.2.2項不同體積的決明子萘并吡喃酮類對照提取物溶液，注入高效液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。以對照品進樣量（X）為橫坐標，色譜峰峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得出回歸方程，見表4。

2.2.4.2 精密度考察 取決明子藥材粉末（20目）60 mg，精密稱定，按2.2.3項制得供試品溶液，連續(xù)進樣六次，每次10 μL，以色譜峰峰面積計算RSD，見表5。

2.2.4.3 穩(wěn)定性考察 取2.2.3項決明子供試品溶液，分別于制備后0，2，4，6，8，12，24，48，72 h進樣，測定決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C色譜峰峰面積計算RSD，見表5。

2.2.4.4 重復性考察 取同一批決明子粉末（20目）6份，每份60 mg，精密稱定，按2.2.3項方法制備供試品溶液，測定色譜峰峰面積，并計算RSD，見表5。

2.2.4.5 加樣回收率考察 取已知含量的決明子藥材粉末（20目）（決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C的量分別為0.394 1%，0.317 9%，0.629 8%）6份，每份30 mg，精密稱定，分別置于25 mL具塞錐形瓶中，精密加入2.2.2項決明子萘并吡喃酮類對照提取物母液1 mL，按2.2.3項方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。計算決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C苷回收率及RSD，見表6，RSD均小于3.0%，表明該方法回收率良好。

2.2.5 決明子藥材含量測定

取20批決明子藥材粉末（20目），精密稱定，按2.2.3項制備供試品溶液，分別以決明子萘并吡喃酮類對照提取物和單體對照品為對照，測定決明子苷B2、紅鐮霉素6OβD龍膽二糖苷、決明子苷C的含量。采用配對t檢驗法比較決明子2種含量測定方法結(jié)果間的差異性，2種方法之間無顯著性差異，表明對照提取物法與對照品法所得測定結(jié)果具有一致性。因此，決明子萘并吡喃酮類對照提取物可有效替代單體對照品進行決明子質(zhì)量評價，見表7。

3 小結(jié)與討論

隨著對中藥研究的深入和發(fā)展，中藥質(zhì)量控制研究已不再滿足于僅僅達到定量準確這一基本要求，建立多指標成分同步分析的模式已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制的重要發(fā)展方向，研究和開發(fā)中藥對照提取物正是順應了這一發(fā)展趨勢。對照提取物具有相對固定的化學組成，其定量指標與原藥材的量化關系明確，專屬性較強，同時具有安全、穩(wěn)定的理化特性，適用于建立多指標評價體系。因此，中藥對照提取物將在中藥質(zhì)量評價中獲得廣闊的應用前景。

目前決明子及其一系列相關制品的質(zhì)量控制主要是通過水解蒽醌苷，測定其水解產(chǎn)物大黃酚及橙黃決明素的含量來實現(xiàn)質(zhì)量控制，不能反映其真實情況。本文在前期對決明子萘并吡喃酮類對照提取物制備方法研究基礎上，制備出含量明確的對照提取物，建立了基于萘并吡喃酮類對照提取物的決明子藥材含量測定方法，并分別采用對照提取物法和對照品法對決明子藥材進行分析測定，結(jié)果顯示對照提取物可替代單體對照品實現(xiàn)對決明子藥材的科學質(zhì)量控制，該質(zhì)量控制模式更符合中藥多成分的特色，同時使中藥質(zhì)量控制更合理、系統(tǒng)、簡便。本研究為決明子萘并吡喃酮類對照提取物進一步應用于含有決明子復方制劑的質(zhì)量控制奠定了堅實的基礎，為中藥質(zhì)量控制新模式的建立提供科學依據(jù)。endprint

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[責任編輯 丁廣治]endprint