• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      核苷(酸)類似物治療停藥后復(fù)發(fā)的慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變分析

      2017-09-22 09:11:36李全雙鄧演超程星裴蘊(yùn)鋒周靜沈紅艷徐湛
      中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2017年23期
      關(guān)鍵詞:慢性乙肝突變復(fù)發(fā)

      李全雙++++++鄧演超++++++程星++++++裴蘊(yùn)鋒++++++周靜++++++沈紅艷++++++徐湛

      [摘要] 目的 研究核苷(酸)類似物(Nas)治療停藥后復(fù)發(fā)的慢性乙肝患者HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變情況。 方法 收集2014年1月~2016年1月在徐州市中心醫(yī)院就診的慢性乙肝患者110例,患者既往服用Nas時(shí)間6個(gè)月以上,因各種原因停藥后病情復(fù)發(fā)。用PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)及基因型。 結(jié)果 在110例血清標(biāo)本中有耐藥突變位點(diǎn)產(chǎn)生的62例,檢出率是56.36%,其中rtL180M,rtM204V,rtM204I,rtA181V檢出率較高,檢出例數(shù)(檢出率)分別是36例(32.73%)、24例(21.82%)、24例(21.82%)、14 例(12.73%);在110例患者中對(duì)Nas耐藥的有58例(52.73%),主要耐藥突變模式是rtL180M+M204I/V、rtM204I和rtA181V?;颊邔?duì)拉米夫定(LMV)、替比夫定(LDT)、阿德福韋酯(ADV)耐藥比例分別是52.73%,22.73%,14.55%;有43例患者存在恩替卡韋(ETV)耐藥風(fēng)險(xiǎn)(39.09%)。24例患者對(duì)LMV和LDT耐藥,比例是21.82 %;14例(12.73%)對(duì)LMV和ADV耐藥;2例(1.82%)對(duì)LMV、LDT、ADV耐藥。HBV RT區(qū)發(fā)生耐藥突變與患者的年齡、性別、基因型無關(guān)(P > 0.05)。 結(jié)論 Nas治療慢性乙肝停藥復(fù)發(fā)患者的耐藥突變發(fā)生率較高;停藥復(fù)發(fā)患者有必要檢測(cè)HBV耐藥突變,為繼續(xù)治療提供重要依據(jù)。

      [關(guān)鍵詞] 慢性乙肝;乙肝病毒;停藥;復(fù)發(fā);耐藥;突變

      [中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2017)08(b)-0107-04

      [Abstract] Objective To investigate the mutation of hepatitis B viurs DNA reverse transcriptase in chronic hepatitis B patients with relapse after nucleot(s)ide analogues withdrawal. Methods From January 2014 to January 2016, in Xuzhou Central Hospital, 110 serum samples of patients with chronic hepatitis B were collected. Patients took nucleoside (acid) drugs for more than 6 months; due to various reasons, patients after withdrawal of the disease recurrence. HBV resistance mutation sites and genotypes were detected by PCR- reverse dot blot hybridization. Results There were 62 drug resistant mutations, the detection rate was 56.36%; including 36 cases of rtL180M (32.73%), 24 cases of rtM204I (21.82%), 24 cases of rtM204V (21.82%), 14 cases of rtA181V (12.73%); the number of patients with drug resistance was 58 cases (52.73%), and the main patterns of mutation were L180M+M204I/V, M204I, A181V. Drug resistance rates of Lamivudine (LMV), telbivudine (LDT), adefovir dipivoxil (ADV) was 52.73%, 22.73%, 14.55% respectively; there were 43 patients with entecavir resistance risk (39.09%) among them. 24 patients were resistant to LMV and LDT, the ratio was 21.82%; 14 patients were resistant to LMV and ADV, the ratio was 12.73%; 2 patients were resistant to LMV, LDT, ADV, the ratio was 1.82%. Mutations in the HBV RT region were independent of age, sex, genotype (P > 0.05). Conclusion The incidence of drug resistance mutation in chronic hepatitis B patients with relapse after withdrawal was higher; it is necessary to detect the mutations in chronic hepatitis B patients with relapse after withdrawal, so as to provide basis for clinical treatment.

      [Key words] Chronic hepatitis B; Hepatitis B viurs; Withdrawal; Relapse; Drug resistant; Mutationendprint

      核苷(酸)類似物[nucleot(s)ide analogues,NAs]在臨床上廣泛用于慢性乙肝(CHB)的抗病毒治療,該類藥物通過直接靶向抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的活性來發(fā)揮抗病毒的作用,但對(duì)HBV復(fù)制的原始模板共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)沒有直接抑制作用,所以需要長期用藥。然而CHB患者長期治療費(fèi)用高,依從性差等原因,會(huì)造成不規(guī)范停藥;由于核苷(酸)類似物不能直接清除cccDNA,因此停藥后,部分患者體內(nèi)HBV可重新啟動(dòng)復(fù)制,造成肝炎復(fù)發(fā),需要繼續(xù)用藥治療[1]。但是由于HBV的復(fù)制極其活躍及其RT又缺乏校正功能,所以HBV變異率比其他DNA病毒相對(duì)高數(shù)倍,因而具有高度變異的特性[2]。所以在NAs治療HBV過程中,HBV 易發(fā)生耐藥突變,是治療失敗的主要原因[3]。因此有必要研究核苷(酸)類似物治療慢性乙肝停藥復(fù)發(fā)患者的HBV耐藥突變情況,本研究對(duì)此類患者進(jìn)行了HBV 耐藥突變檢測(cè),為臨床治療提供參考。

      1 資料與方法

      1.1 一般資料

      收集2014年1月~2016年1月徐州市中心醫(yī)院就診的CHB患者的血清標(biāo)本110 例,其中男91例,女19例,年齡21~67歲,平均(40.3±11.8)歲。所有患者均經(jīng)核苷(酸)類似物治療后,因各種原因停藥后病情復(fù)發(fā),患者血清HBV DNA定量標(biāo)準(zhǔn)>1×103 copies/mL的陽性標(biāo)本;CHB的診斷和復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[4];排除其他肝炎疾病如HCV、HDV、HIV等混合感染。

      1.2 試劑、儀器及檢測(cè)方法

      HBV耐藥突變檢測(cè)試劑盒和HBV DNA提取試劑盒購自亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司。儀器有深圳亞能分子雜交儀(YN-H16),上海宏石SLAN-96S全自PCR儀。使用 PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè) HBV耐藥突變位點(diǎn)與基因型[2],該法檢測(cè)HBV耐藥突變位點(diǎn)(rt180、rt204、rt207、rt181、rt236)和基因型(B、C、D)。

      1.3 方法

      1.3.1 標(biāo)本采集和處理 采集患者靜脈血 3 mL,注入真空采血管,室溫靜置30~60 min,然后 2000 r/min離心10 min。如果不能當(dāng)天及時(shí)檢測(cè),吸取上層血清轉(zhuǎn)移至無菌離心管中,保存于2~8℃不超過48 h、-20℃下不超過半年完成實(shí)驗(yàn)。

      1.3.2 HBV DNA 的提取 在1.5 mL離心管中加入200 μL HBV DNA 提取液I及待測(cè)血清,13 000 r/min離心5 min。吸棄上清液,加入50 μL HBV DNA提取液Ⅱ,震蕩混勻至沉淀完全溶解,沸水浴10 min。加入5 μL三氯甲烷,混勻,13 000 r/min離心5 min。取上清1.5 μL作為PCR反應(yīng)模板。陰、陽性制品與血清標(biāo)本的處理方式相同,同步處理。

      1.3.3 PCR擴(kuò)增 取1.5 μL樣品DNA加入反應(yīng)液管,同時(shí)做陰陽性質(zhì)控品。擴(kuò)增條件:50℃ 2 min;95℃ 10 min;94℃ 60 s,68℃ 90 s,30 Cycles;94℃ 30 s,54℃ 30s,72℃ 30s,30 Cycles;72 ℃ 5 min 。以1.4℃/s 的速度設(shè)置升降溫。

      1.3.4 雜交、洗膜及顯色 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與A液雜交1.5 h。由B液、C液洗膜,最后在顯色液中顯色,觀察結(jié)果。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      在110 例CHB患者中檢出HBV C型101例(91.82%),B型5例(4.55%),BC型2例(1.82),BD型1例(0.91%),D型未檢出,其中有1例檢出野生型位點(diǎn),但未檢出基因型。在C型的標(biāo)本中檢出耐藥突變位點(diǎn)58例,其中有4例僅檢出耐藥突變位點(diǎn)rtLl80M;在B型的標(biāo)本中檢出耐藥突變位點(diǎn)3例,BC型有1例。在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT區(qū))耐藥突變位點(diǎn)分別檢出rtLl80M,rtM204V,rtM204I,rtAl81V,rtN236T,rtM207I,檢出例數(shù)分別是36例、24例、24例、14例、3例、2例,檢出率分別是32.73 %、21.82%、21.82%、12.73 %、2.72 %、1.82 %。

      58例耐藥標(biāo)本HBV RT區(qū)耐藥突變模式與對(duì)應(yīng)的核苷(酸)類似物耐藥情況,詳見表1。

      將患者的年齡、性別、基因型作為耐藥突變相關(guān)因素進(jìn)行分析,HBV RT區(qū)發(fā)生耐藥突變與患者的年齡、性別、基因型無關(guān)(P > 0.05)。見表2。

      3 討論

      HBV基因組P區(qū)編碼多種功能蛋白,包括DNA聚合酶[5]。此酶既有以RNA為模板合成DNA的逆轉(zhuǎn)錄酶功能,又有催化合成DNA的多聚酶功能。目前,NAs均以HBV逆轉(zhuǎn)錄酶作為靶點(diǎn),發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。有研究結(jié)果顯示,即使嚴(yán)格按照指南推薦的停藥標(biāo)準(zhǔn),仍有44.0%~61.4%的患者在1年內(nèi)復(fù)發(fā)[6-7]。由于HBV易發(fā)生基因耐藥突變,病情復(fù)發(fā)的CHB患者若繼續(xù)治療,會(huì)有耐藥風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致治療失敗[8]。

      本研究檢測(cè)HBV RT區(qū)耐藥突變,分析核苷(酸)類似物耐藥情況。結(jié)果顯示,發(fā)生率較高的突變位點(diǎn)是rtLl80M,rtM204V,rtM204I,rtAl81V檢出率分別是32.73%、21.82%、21.82%、12.73%,而rtN236T,rtM207I檢出率相對(duì)較低,分別是2.72%、1.82%。110例患者中HBV RT區(qū)發(fā)生基因耐藥突變的有62例,其中有4例單獨(dú)出現(xiàn)rtLl80M變異,產(chǎn)生耐藥的有58例,總耐藥率為52.73%。在58例耐藥的患者中有 32例發(fā)生了rt180M+rt204I/V混合位點(diǎn)突變,占55.17%,12例(20.69%)獨(dú)立發(fā)生了rt204I位點(diǎn)突變,11例(18.97%)獨(dú)立發(fā)生了rt181V位點(diǎn)突變,提示rt180M+rt204I/V混合位點(diǎn)突變?cè)诨颊咧休^為普遍,這與戚應(yīng)杰等[9]報(bào)道相似。他們研究的rt180M+rt204I/V混合位點(diǎn)突變占總耐藥例數(shù)41.9%,該研究的比例比他們略高,這可能與研究的人群不同有關(guān)。由此可見,經(jīng)核苷(酸)類似物治療CHB,停藥后復(fù)發(fā)的患者耐藥突變發(fā)生率較高。在本研究中,患者發(fā)生耐藥的比例高低依次是LMV(52.73%),LDT(22.73%),ADV(14.55%),這與戴明佳等[10]報(bào)道基本一致。徐州地區(qū)的汪莉萍等[11]研究了抗病毒治療前的自然耐藥變異,100例CHB患者中發(fā)生自然耐藥的有21例,發(fā)生率為21%,其中ADV 12例(12%),LMV 7例(7%),ETV 2例(2%)。本研究對(duì)象是經(jīng)抗病毒藥物治療后停藥復(fù)發(fā)的人群,LAM和LDT的耐藥比例上升很明顯,ADV略有升高。以上結(jié)果均提示在抗病毒藥物的選擇壓力作用下,使得HBV基因組RT區(qū)的變異頻率大大增強(qiáng)。24例患者對(duì)LMV和LDT耐藥,比例是21.82%;14例對(duì)LMV和ADV雙重耐藥,比例是12.73%;2例對(duì)LMV、LDT、ADV多重耐藥,比例是1.82%。LMV的耐藥突變位點(diǎn)臨床多見的主要是rtL180M+rtM204V/I,其中 rtM204V/I又稱為YMDD變異,以rtM204I更為多見。如應(yīng)用拉米夫定治療1、2、3、4年后,YMDD變異率在分別為14%、38%、49%、66%。拉米夫定是我國最早和應(yīng)用較廣泛的核苷類抗乙肝病毒藥物,rt204M發(fā)生YMDD變異而引起病毒學(xué)突破和生化指標(biāo)反彈,導(dǎo)致其抗病毒治療失敗。此外,有4例患者單獨(dú)出現(xiàn)了rtL180M突變,未出現(xiàn)rtM204V/I變異,而有1例單獨(dú)出現(xiàn)rtM204V變異,這與蔣貝等[3]研究不同,他們報(bào)道的是LAM耐藥突變類型中,所有的rtM204V會(huì)聯(lián)合rtLl80M共同發(fā)生突變。這也許說明了YMDD變異患者除在rtM204發(fā)生變異外,rtL180M有原發(fā)性和補(bǔ)償性變異[12],這些變異與HBV復(fù)制及藥物耐藥的關(guān)系究竟如何有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。ETV具有高耐藥基因屏障,至少需要3個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變方可構(gòu)成耐藥。其耐藥機(jī)制通過二次打擊發(fā)生,即在rtM204I/V(±rtL180M)基礎(chǔ)上,加上以下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)包括B區(qū)rtI169T或rtT184S/G、C區(qū)rtS202I/G和E區(qū)rtM250V[13]。已證實(shí)rtM204V/I會(huì)降低HBV對(duì)ETV的敏感性[10]。ETV在NA初治患者中的耐藥發(fā)生率很低,最初只在對(duì) LAM耐藥的患者中出現(xiàn),有研究顯示應(yīng)用 ETV 3 年累積耐藥率僅為1.7%~3.3%,但有LAM治療失敗史的患者其耐藥發(fā)生率明顯增高[9]。本研究共檢出43例存在ETV耐藥風(fēng)險(xiǎn)的患者,檢出率39.09%,其都伴隨LAM耐藥,變異組合模式主要為rt180M+rt204V、rt204I、rt180M+rt204I。rt181 位點(diǎn)單一氨基酸改變即可能導(dǎo)致LAM 和 ADV 交叉耐藥,本文檢出11例rtA181V 獨(dú)立突變。endprint

      本研究進(jìn)行了影響HBV RT區(qū)基因耐藥突變的因素分析,結(jié)果顯示年齡、性別、基因型與HBV發(fā)生耐藥突變無關(guān)(P > 0.05)。戴明佳等[10]也研究了195例患者既往有明確的應(yīng)用NA史,B、C基因型間耐藥發(fā)生率無明顯差(P > 0.05)。

      HBV可分為A~J 10種基因型[5],基因型具有明顯的地理分布特點(diǎn),我國南方以B型多見,北方以C型為主,少數(shù)民族地區(qū)可見到一定比例的A型和D型[5,14-15]。在本研究中基因型檢出情況與本地區(qū)的戴明佳等[10]報(bào)道相似,他們檢出C型93.92%,表明在本地區(qū)經(jīng)診療的CHB患者HBV基因型以C型為主,主要是單基因型HBV感染,這與已有報(bào)道結(jié)果基本一致[16]。研究報(bào)道[17-19],感染HBV C基因型患者比感染B基因型更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟疾病,發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的概率較高,且臨床預(yù)后較差。

      綜上所述,經(jīng)核苷(酸)類藥物治療的CHB患者停藥復(fù)發(fā)后,盡早檢測(cè)耐藥變異,依據(jù)世界衛(wèi)生組織指南[20]及時(shí)調(diào)整治療方案,這對(duì)控制病情進(jìn)展,減少病毒突破乃至反彈對(duì)機(jī)體造成的再次打擊相當(dāng)重要。

      [參考文獻(xiàn)]

      [1] 陳立,李孝樓,甘巧蓉,等.核苷(酸)類似物治療慢性乙型肝炎停藥復(fù)發(fā)患者的臨床特點(diǎn)及其影響因素[J].中華肝臟病雜志,2013,21(11):825-828.

      [2] 張達(dá)衡,陳紅玲,譚滿勝,等.PCR-反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)HBV耐藥變異與基因型的探討[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(13):1716-1717.

      [3] 蔣貝,戴晨陽,李秀梅,等.基于PCR測(cè)序技術(shù)的HBV感染者耐藥突變臨床分析[J].中華肝臟病雜志,2016,24(1):36-39.

      [4] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì).中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)[J].中華臨床感染病雜志,2015,8(6):481-503.

      [5] 謝巧靈,叢慶偉,吳凌虹,等.耐核苷(酸)類藥物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P區(qū)耐藥突變位點(diǎn)分析[J].實(shí)用肝臟病雜志,2016,19(1):60-63.

      [6] Ha M,Zhang G,Diao S,et al. A prospective clinical study in hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B patients with stringent cessation criteria for adefovir [J]. Arch Virol,2012,157(2):285-290.

      [7] Liang Y,Jiang J,Su M,et al. Predictors of relapse in chronic hepatitis B after discontinuation of anti-viral therapy [J]. Aliment Pharmacol Ther,2011,34(3):344-352.

      [8] 邱源旺,黃利華,甘建和.慢性乙型肝炎核苷(酸)類藥物治療停藥后復(fù)發(fā)的相關(guān)影響因素[J].中華臨床感染病雜志,2015,8(6):567-570.

      [9] 戚應(yīng)杰,岳莉,朱義媛,等.乙型肝炎病毒耐藥基因變異位點(diǎn)與基因型及病毒載量的關(guān)系[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,36(3):392-394.

      [10] 戴明佳,方圓,汪莉萍,等.740例HBV感染者血清HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥位點(diǎn)分析[J].實(shí)用肝臟病雜志,2014, 17(3):255-258.

      [11] 汪莉萍,韓方正,李春楊,等.慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前HBV P區(qū)基因序列測(cè)定的意義[J].中華臨床感染病雜志,2011,4(5):303-305.

      [12] 錢福初,秦基取,李棟立,等.拉米夫定治療后慢性乙肝患者 HBV 基因組 RT 區(qū)和S 區(qū)變異分析[J].病毒學(xué)報(bào),2015,34(4):433-437.

      [13] 汪莉萍,李春楊,韓方正,等.病毒學(xué)反彈的慢性乙型肝炎患者病毒多聚酶區(qū)耐藥突變分析[J].中華傳染病雜志,2016,34(10):593-596.

      [14] 郭姝君,李娟,曲沛,等.中國北方地區(qū) HBV 主要基因型和肝損傷相關(guān)性研究[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016, 37(6):763-764.

      [15] 張景皓,王家路,趙 虎.新疆漢族與維吾爾族 HBV 耐藥變異類型與基因型研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2014,29(10):1041-1044.

      [16] 李步榮,張 彤,李麗華,等.CHB患者HBV基因型及耐藥突變基因聯(lián)合檢測(cè)臨床研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2015,30(5):40-43.

      [17] 許建平,鐘國權(quán).乙型肝炎病毒核苷類藥物耐藥突變和基因型研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,12(9):1240-1242.

      [18] 江必武,葉麗華,王平.HBV復(fù)制及其基因分型與HBV相關(guān)慢性肝病關(guān)系的臨床研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2013,42(2):231-233.

      [19] 孫文錦,肖作漢,趙麗芹,等.乙型肝炎病毒基因分型與疾病病情的關(guān)系[J].實(shí)用肝臟病雜志,2013,16(1):66-67.

      [20] 醫(yī)學(xué)論壇網(wǎng).標(biāo)準(zhǔn)·方案·指南——2015亞太肝病研究學(xué)會(huì)/世界衛(wèi)生組織慢性乙型肝炎防治指南速遞[J].中國全科醫(yī)學(xué),2015,18(21):2598.endprint

      猜你喜歡
      慢性乙肝突變復(fù)發(fā)
      完整結(jié)腸系膜切除治療老年肥胖患者結(jié)腸癌的療效及復(fù)發(fā)情況觀察
      腫瘤標(biāo)志物CA199和CEA與大便潛血聯(lián)合檢測(cè)對(duì)腸癌復(fù)發(fā)的診斷價(jià)值
      黔西南州日照時(shí)數(shù)變化分析
      69例再發(fā)腦梗死患者臨床特點(diǎn)及危險(xiǎn)因素分析
      例析應(yīng)對(duì)體育教學(xué)環(huán)境突變的教學(xué)策略
      替比夫定治療e抗原陽性慢性乙肝臨床觀察
      果糖注射液對(duì)慢性乙肝合并糖尿病患者血糖的影響
      關(guān)于分析皮帶傳送中的摩擦力突變問題
      考試周刊(2016年76期)2016-10-09 09:47:35
      慢性乙肝癥狀與生物信息相關(guān)性的數(shù)據(jù)挖掘研究
      健康教育在預(yù)防尿路結(jié)石患者復(fù)發(fā)護(hù)理中的作用
      延川县| 宁乡县| 东光县| 泰顺县| 胶州市| 莎车县| 德庆县| 津市市| 理塘县| 湄潭县| 平阴县| 堆龙德庆县| 达尔| 通榆县| 辽宁省| 道真| 天柱县| 马龙县| 司法| 乌兰浩特市| 平武县| 凤台县| 盐边县| 西安市| 阳泉市| 杭州市| 平潭县| 南木林县| 旬阳县| 北宁市| 武汉市| 黄浦区| 鹤庆县| 延吉市| 抚顺市| 日照市| 海伦市| 临洮县| 昌宁县| 微博| 青阳县|